冠心病心肌缺血病證動物模型構建方法與評價的研究進展

李敬文　尚　坤

長春中醫藥大學，吉林　長春　130117

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冠心病心肌缺血病證動物模型構建方法與評價的研究進展

李敬文尚坤*

長春中醫藥大學，吉林長春130117

病證結合模型研究方面，大多數建立的是一病一證的病證結合模型，即圍繞一種現代醫學疾病，在制作的現代醫學疾病模型的基礎上，滲透中醫干預因素后制作一個證的動物模型。文章就冠心病心肌缺血已構建的痰瘀互結證、心血瘀阻證、氣陰兩虛證、心脾陽虛證動物模型的建立以及評價指標進行歸納整理闡述。病證動物模型能夠彌補中醫臨床辨證客觀化指標不足的缺點，為中醫的臨床實踐提供科學依據，以加速實現中醫的現代化進程。

冠心??；心肌缺血；動物模型；構建方法；綜述

心肌缺血(myocardial ischemia)是心臟的血液灌注量減少，引發心臟的供氧量不足以及心肌功能代謝紊亂，從而導致心臟不能正常運作的病理狀態[1]。中醫病證動物模型的病證和病理改變具有與人體相同或相似的特征，所以在實驗研究中復制與人類疾病相似的動物模型就顯得尤其重要。目前，在推進中醫病證研究的客觀化和規范化過程中，研究思路主要有造模方法、動物選擇和評價體系三方面。本文將造模方法和評價體系進行歸納概述如下。

1　痰瘀互結證動物模型

痰瘀同源相生而互相凝結,主要是指痰瘀能夠隨氣的改變而生成。隨著痰瘀互相凝結的部位、性質以及引起病變的不同就有許多不同的臨床表現。前有學者認為冠心病在中醫學中屬于“胸痹”的范疇。痰、瘀是目前臨床上常見的兩個致病因素，它是指痰水代謝功能出現障礙，導致水津停滯病理產物的形成。瘀血是指來自內部和外部的損傷等原因的病理產物，其實質是經絡氣血離經，氣血不暢和血液停滯于經脈中。本文依據冠心病心肌缺血痰瘀互阻證的病理本質，分別介紹球囊損傷外加高脂肪飲食誘導的動物模型以及高脂肪飲食、靜脈注射維生素 D3和異丙腎上腺素模擬冠心病小型豬的動物模型。

1.1球囊損傷外加高脂肪飲食誘導的痰瘀互結證小型豬動物模型的建立李欣志等[2]通過喂食高脂肪食物和結合冠狀動脈血管內皮損傷的方法組合建立小型豬模型。操作方法如下：小型豬喂高脂飲食，每只小型豬每天每次喂食900g食物，連續兩個星期。在此基礎之上，進行冠狀動脈內皮損傷的介入。具體的操作方法:在耳靜脈注射戊巴比妥鈉(30mg·kg-1) 麻醉，后將右側頸總動脈分離，遠心端結扎。放置6F動脈鞘管，從動脈鞘管的側管注入肝素200U·kg-1。將導引導管置于左冠狀動脈開口處，然后做左冠狀動脈造影，觀察實驗小豬冠狀動脈的分布情況。造影后將交換導絲放入冠狀動脈前降支(LAD)中部，將球囊沿導絲置入LAD 中部。根據實驗動物間 LAD 直徑的差異進行球囊加壓8～12大氣壓(ATM),持續30s，反復操作3次，擴張后維持球囊壓力4～6ATM，同時稍微拉動球囊，距離約0.5～1.0cm。在實驗結束時，按照順序除去導絲和球囊，造影觀察 LAD 擴張后，將該導管取出，隨后將頸動脈結扎，無菌縫合。術中連續使用心電監護，單個籠子喂養觀察。手術結束后給予高脂飼料喂養8周(依舊每只每天900g)。正常對照組僅冠脈造影，不損傷血管內皮細胞，同實驗組相同,每只小豬每天喂養飼料900g，僅以普通飼料喂養。

小型豬冠心病痰瘀互結證的評價需對胸痹心痛的主癥、兼癥、舌象和脈象進行量化統計學處理。同時需要借助體重指數、體表心電圖以及無創血流動力學指標。造模成功后的動物模型組血脂水平顯著上升，冠狀動脈前降支形成粥樣硬化斑塊，血液的黏稠度也顯著增高，并伴有不同程度的心肌缺血，提示為小型豬痰瘀互結證冠心病動物模型建立較成功。結合其他實驗方法進行整體性分析，此種造模方法穩定性較好。但該動物模型所需費用較高，同時對實驗要求也較高，技術手法較為嚴苛，難度也較大，應用不廣泛。

1.2高脂飲食和靜脈注射維生素 D3(VD3)和異丙腎上腺素復制冠心病痰瘀互結證小型豬動物模型的建立潘永明等[3]采用實驗小型豬，適應6周后，按血脂水平和體重隨機分為3個組，每組小型豬5只，即正常對照組(control，Ctr)喂基礎飼料；高脂組(high fat-cholesterol diet，HFC)以高脂飼料喂養；痰瘀互結證慢性心肌缺血組(chronic myocardial ischemia，CMI)在喂食高脂飼料的同時，于造模 0、4、8周的時候耳緣靜脈注射5萬IU/kgVD3，從第12周開始時，每周耳緣靜脈注射1次異丙腎上腺素25μg/kg，直至第24周結束[4]。小型豬連續喂養24周，按照體重的2.5%給予飼料喂量，均分成兩等份于1日飼喂完，每兩周稱重并更換1次飼料量，高脂飼料配方為15%起酥油，10%蛋黃粉，1.5%膽固醇，73.5%基礎飼料。

此模型試驗期間，觀察到痰瘀互結證慢性心肌缺血小型豬有明顯的心率加快、喘息急促、心電圖異常、舌質暗紫等癥狀，表明該實驗動物模型可以成功模擬中醫痰瘀互結證冠心病的病因和病理過程，且其病程相對緩慢。血液流變學、心肌酶代謝、脂質代謝和炎癥指標也可作為評價該模型的生物學基礎，這為中醫冠心病痰瘀互結證的研究和藥物干預機制提供了參考依據。該實驗方法可操作性較高，而且操作較為簡單，應用更廣泛。

2　心血瘀阻證動物模型

心血瘀阻證的臨床表現包括心胸憋悶疼痛以及口、唇部呈暗紅色，指甲發青紫，或出現有瘀斑、脈澀等癥狀。經反復調查研究統計，間斷反復冷應激方法與垂體后葉素聯合造模以及冠脈結扎法兩種動物模型效果較好。

2.1反復間斷冷應激的方法與垂體后葉素聯合造模法谷萬里等[5]將實驗大鼠隨機分為正常組、硝酸甘油治療組和生理鹽水對照組，隨后將實驗大鼠進行隨機編號、標記、稱重。每組實驗動物各8只。硝酸甘油治療組和生理鹽水對照組每日8∶30于-(5±1)℃低溫環境中將大鼠分別置于籠內,連續3h(采用可調溫冰箱,透過玻璃蓋可進行觀察),使大鼠全身暴露于低溫環境。然后再恢復與室內溫度相同的溫度(20±1)℃,并連續3d于腹腔注射垂體后葉素20U/(kg·d)。三組按照相同的常規方法喂養。于造模成功后當天，連續3d，給予治療組大鼠硝酸甘油0.45mg/(kg·d)；對照組大鼠給予0.9%生理鹽水7mL/(kg·d)。最后一次給藥后30min,觀察大鼠的一般情況。

實驗觀察表明,硝酸甘油治療組和生理鹽水對照組中實驗大鼠出現煩躁、多動的現象。隨后出現反應遲鈍、耳色暗紅、蜷縮懶動、爪尾部發紫、飲水量明顯減少等血瘀的癥狀。結果表明，開始時大鼠生理功能代償性的增強引起了血管內皮細胞的損傷,血管通透性顯著增加、血漿ET含量增多,NO含量減少。同對照組比較差異具有統計學意義，說明模型建立較成功。

2.2冠脈結扎法構造心血瘀阻證動物模型使用鹽酸氯胺酮20%進行腹腔麻醉(80kg/kg)，將背位固定，頸部去毛。然后將上皮組織剪開，頸前肌分離，讓氣管外露，用20號穿刺針頭經口插入氣管穿刺，另一端口連接微型人工呼吸機。將胸部脫毛，消毒，縱向切開皮膚約2cm，作鈍性分離(第4或第5肋間)，剪斷左側胸廓第4肋。打開胸腔，剪開心包膜。然后以3/8不銹鋼小圓針和6/0號絲線穿過肺動脈圓錐于左心耳交界下約1～2mm處，結扎左冠狀動脈左前降支，結扎前后需記錄Ⅱ導聯心電圖[6-7]。若結扎部位以下出現心肌蒼白，脈搏微弱，ST段弓背向上顯著則表明模型的構造成功。然后快速的將胸腔縫合，待動物可以自主呼吸，即停止人工呼吸。造模成功后觀察3h，處死動物，進行采血隨后取出心肌組織。對以下指標進行測定：MDA的測定、SOD、TXB、6-keto-PGF含量等。

冠狀動脈結扎所致的心肌缺血動物模型，其SOD、6-keto-PGF值顯著降低，MDA、TXB明顯上升。冠狀動脈結扎可導致大鼠血瘀的模型，實驗結果表明，如果涉及到胸痹所致的心血瘀阻模型的實驗研究，可采用結扎動脈法。

3　氣陰兩虛證動物模型

以臨床常見的氣陰兩虛證為切入點,發現慢性間歇性缺氧模型小鼠特征表現為攝食量降低、體重減小、自發活動行為的改變、心電圖T波持續性升高等異常的出現[8]。可部分模擬氣陰兩虛證的主要臨床表現,并伴隨氧化應激異常等病理變化。同時發現近老齡大鼠情況與人有一定的同一性，所以近老齡、老齡大鼠可用來研究人類的氣陰兩虛證。

3.1采用慢性間歇性缺氧手段構建氣陰兩虛證動物模型將30只雄性ICR小鼠隨機分為三組，空白對照組 、鈉石灰組、低壓氧儀組。每組ICR小鼠10只放于同一籠內喂養，每組小鼠每天給食物100g，飲水正常。空白組每日喂養情況正常，早晨灌服0.02 mL·g-1生理鹽水；鈉石灰組和低壓氧儀組每晚21時開始禁食，第二日清晨8時分別放入200mL密閉廣口瓶中(每個瓶子中預先加入15g鈉石灰)同時將低壓氧儀置于缺氧箱中(氧分壓調至7%～8%)，持續缺氧20min；每日1次，連續42d[9]。

3.2評價結果顯示，在不同時間段下小鼠各項指標的變化趨勢基本一致。具體表現為：體重在前14d增長比較緩慢，直至第3周時呈逐漸下降趨勢；進食量一直呈下降趨勢；行走格數在第14～35d明顯減少，而直立次數則一直呈上升趨勢，而且與空白對照組相比較，理毛、搔抓、大、小便次數也明顯增多；心電圖則表現出心率加快，T波呈逐漸抬高趨勢等現象。鈉石灰組、低壓氧儀組與空白對照組比較差異均有統計學意義(P<0.01)。證實鈉石灰缺氧法與低壓氧儀缺氧法兩種不同的缺氧條件，二者誘導的慢性間歇性缺氧小鼠模型都能模擬形體消瘦、食欲不振、體倦乏力、煩躁、心悸、脈細數等氣陰兩虛證的主要臨床特征[10]。除此之外，2種不同缺氧方式的相關性分析結果也顯示出鈉石灰缺氧法與低壓氧儀缺氧法具有非常顯著的相關性。

4　心脾陽虛證動物模型

在有關脾陽虛證的研究中[11-15]，結合脾陽虛證兩大癥狀群的評價，脾陽虛的癥狀分為兩類，分別是陽虛癥狀：喜溫畏寒、四肢冰冷等癥狀；脾虛癥狀：乏力、消瘦、便溏、腹痛、腹脹[16-17]。通過觀察大鼠的行為以及肛門溫度的測定來初步評估建立的模型。以上所述心脾陽虛的觀察結果，可供心脾陽虛證動物模型的研究作定性參考。

4.1心脾陽虛證大鼠模型的建立適應性喂養大鼠一星期，然后將大鼠隨機分為五個實驗組:正常組、模型組、低劑量治療組、中劑量組、高劑量組。每組20只且雌雄各半。正常組飲水正常，普通食物喂養；模型組、治療藥物低劑量組、中劑量組和高劑量組均施行肩胛骨間棕色脂肪組織( brown adipose tissue，BAT) 切除術，術后于19℃環境高脂飼料喂養。實驗22 d開始給予腦垂體后葉素(10U·kg-1)皮下多點注射，正常組給予等容量生理鹽水。每日1次，連續7d。最后一次分別按照梯度劑量給藥低劑量組、中劑量組和高劑量組，隨后進行心電圖檢查，取心臟，進行心臟灌流，正常組和模型組給予生理鹽水灌流。

4.2評價在實驗動物模型中，發現小鼠肛門附近有異物，懶動并伴有大便稀溏，喜歡扎堆，無光澤。同時，模型組中小鼠的體重，肛門溫度等指標與正常組小鼠相比較差異有統計學意義。該動物模型的建立綜合了以下三種方法，分別為：高脂肪食物喂養、BAT 切除術以及腦垂體后葉素皮下多點注射，隔日置于陰涼寒冷環境刺激。在動物模型的復制過程中，加強對“傷陽”脾虛證的設計，采用去除BAT的方法能夠顯著降低小鼠產生熱量的來源[18]。為使其陽氣衰弱，則采用寒冷環境刺激，旨在模擬“飲食不節”、“寒傷中陽”的癥狀，使脾陽虛證造模的陽虛、脾虛環節更為可信。實驗結束后注意到，模型組的體量、肛溫在造模后都有明顯下降的趨勢，同造模前相比差異有統計學意義，說明此動物模型效果較好。

5　小結

中醫病證動物模型不應該局限于單一的改變局部生理狀況，同時應與系統生物學、基因組學以及光譜分析學相結合，觀察實驗整體的變化，包括DNA、mRNA、蛋白質、代謝物等復雜檢測指標之間的變化，才能真正地促進了中醫病證動物模型的發展，從整體的角度，逐漸對傳統中醫理論探索和研究方面有更深刻的理解，并逐步深入研究探討“證”的實質[19-20]。

復制冠心病心肌缺血病證動物模型的方法日漸成熟，應用也越來越廣泛。目前已取得了一定的發展，其設計思路已經遵循了“因-脈-證-治”思路中的某些環節。中醫辨證體系的建立和不斷發展與創新對中醫藥的發展起到了舉足輕重的作用。本文通過對復制冠心病心肌缺血病證動物模型構建方法的切入，同時對心電圖、組織染色檢查和血清酶學等綜合指標的評價研究近況的探討，希望能通過不斷改善中醫病證動物模型的構建方法以及評價機制，建立與傳統中醫理論相適應的量化可測的實驗方法，并不斷完善，為藥物研究所用。

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Coronary Heart Disease (CHD)on Myocardial Ischemiasyndrome Animal Model Building Methods and Evaluation Research Progress

LI JingwenSHANG Kun*

Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Changchun 130117,China

Model combined disease research, most of the building is a model combined disease and syndrome, a disease that revolve around a modern medicine disease, in the production of modern medical model which is on the basis of the penetration of traditional Chinese medicine after intervention factors to produce a certificate of animal models.In this paper, the sputum silt of myocardial ischemia of coronary heart disease has been build mutual junction resistance syndrome, blood stasis syndrome, qi and Yin deficiency syndrome, mist Yang deficiency syndrome animal model and evaluation index for generalization.Disease animal model could make up for a lack of clinical syndrome differentiation of traditional Chinese medicine objective indicators of faults, which will provide a scientific basis for the clinical practice of TCM, and accelerate the realization of the modernization of traditional Chinese medicine.

Coronary Heart Disease (CHD) ; Myocardial Ischemia; Animal Model; Building Methods;Review

高等學校博士學科點專項科研基金項目，項目編號：20122227110003；吉林省科技發展計劃項目，項目編號：20150203007YY；吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目，項目編號：吉教科合字[2014]第85號；吉林省衛生廳科研課題，課題編號：2012S007

李敬文(1992-)，女，碩士，漢族，遼寧大連人，碩士研究生在讀。研究方向：中醫藥治療心腦血管疾病的臨床與機理研究。

尚坤(1978-)，女，博士，副教授，碩士研究生導師，吉林延吉人，長春中醫藥大學藥學院副院長。研究方向：中醫藥治療心腦血管疾病的臨床與機理研究。E-mail：495218735@qq.com

R256.22

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1007-8517(2016)14-0034-03

2016.05.18)