沙門菌減毒基因的研究進展①

陳松彪　張春杰　程相朝

(河南科技大學動物疫病與公共衛生重點實驗室，洛陽471003)

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沙門菌減毒基因的研究進展①

陳松彪張春杰程相朝

(河南科技大學動物疫病與公共衛生重點實驗室，洛陽471003)

①本文為河南省科技攻關資助項目(162102110054)。

沙門菌(Salmonella)屬于腸道致病菌，是一種重要的食物源性病原體，其具有廣泛感染的宿主譜，在公共衛生方面具有重要的意義。用沙門菌作為重組疫苗的載體具有安全、免疫方式類似自然感染等無可比擬的優越性。弱毒的沙門菌活疫苗可以經口服途徑表達傳遞重組的抗原到機體的黏膜表面，從而誘導機體產生保護性的免疫應答來對抗病原體的感染。近年來，出現的許多令人振奮的醫學新發現和新技術都是以減毒的沙門菌作為載體來實現的。本文結合國內外近年來構建的一些沙門菌減毒菌株進行說明，為進一步研制安全高效的沙門菌弱毒疫苗以及將其用作活載體表達外源基因的研究奠定基礎。

1　沙門菌的研究狀況

沙門菌具有廣泛感染的宿主譜，據估計，每年有8.0×105～3.7×106不等數量的人感染沙門菌[1]，該菌能引起食物中毒和醫院內感染流行、暴發，在醫學、獸醫和公共衛生上具有十分重要的意義。

近年來，利用基因工程技術將強毒株毒力相關基因敲除構建新型減毒沙門菌作為疫苗的研究備受關注，采取基因工程方法減毒的沙門菌對人和動物的致病力顯著降低，但仍然保持良好的安全性和免疫原性。最早通過抗生素誘導對鼠傷寒沙門菌進行減毒，但所獲得的弱毒株毒力不穩定，因而應用起來不受歡迎，后來發展成為用化學誘變進行減毒，錢峰等[2]發現鼠傷寒沙門菌的Ty2株經誘變后可成為半乳糖差向異構酶(Galactose epimerase,galE)基因缺失的營養缺陷型突變株，此菌株已獲準用于人體，但是由于用化學誘變產生突變株很盲目，可能存在其他未知突變，其背景不清楚且可能出現毒力回復等，若用于疫苗制備，其質量也不敢保證，所以此法也不被人們重視。

隨著分子生物學技術的發展以及對沙門菌毒力遺傳學的深入研究和了解，為該病原體在基因組中引入多重、限定、減毒和不可回復的突變提供了可能性。為克服最早用于預防沙門菌病的滅活疫苗只能激發體液免疫、不能提供交叉保護、容易引起全身及局部反應等缺陷，近年來人們通過基因工程方法構建沙門菌減毒或無毒活菌疫苗免疫動物取得了比較好的效果。利用基因工程方法在沙門菌染色體基因組上隨機插入一個轉座子或刪除一段或幾段毒力相關基因，使編碼毒力因子或編碼關鍵代謝途徑的酶基因的序列發生改變，以及控制菌株在體內生存的調節基因等均可使其毒力降低，但仍保留著高度的免疫原性。因此，應用各種基因工程技術構建減毒沙門菌作為弱毒疫苗已成為研究熱點。目前，許多與沙門菌致病相關的因子用于沙門菌的減毒，并已取得了不同程度的成功。

2　沙門菌毒力基因的研究概況

沙門菌的致病機理主要與位于Ⅲ型分泌系統上的編碼毒力島1(SPI-1)和毒力島2(SPI-2)上的一些毒力因子有關，Ⅲ型分泌系統在細菌進入宿主細胞中起著重要作用，這些蛋白被稱之為效應蛋白，SPI-1上面的蛋白主要促進細菌黏附并進入宿主細胞，并且與細胞內的炎癥發生有關，SPI-2上面的蛋白主要與細菌感染宿主細胞并在吞噬細胞內存活和復制有關，由SPI-1和SPI-2上面的蛋白共同發生作用，從而引起全身性感染。目前許多研究者已經利用沙門菌致病島SPI-1、SPI-2、SPI-3上面與毒力有關的致病因子進行了一系列的研究[3]。在沙門菌感染機體的過程中，SPI-1負責細菌對宿主的初期侵入，SPI-2對于細菌在吞噬細胞內的生存是至關重要的。SPI-3致病島與鼠傷寒沙門菌繁殖和持續作用于腸黏膜有關。下面就位于毒力島上面一些減毒基因的國內外近年的研究現狀進行闡述。

2.1cya基因cya基因編碼環化腺苷酸合成酶，該類減毒株能有效刺激機體產生黏膜免疫、細胞免疫和體液免疫應答，李靜等[4]通過重組自殺性質粒介導的細菌同源重組技術構建鼠傷寒沙門菌環化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系統，生物學特性結果表明其毒力較親本菌株相比降低了104倍，免疫雛雞后對100LD50的野毒攻擊有60%左右的免疫保護率，有潛力開發為疫苗活載體。

2.2rpoE基因Rpo蛋白是目前研究最多的δ因子，它在穩定生長期受到環境應激時控制著基因表達，缺少rpoE基因可導致沙門菌對環境的抵抗力下降，生物被膜形成能力下降，黃駿等[5]通過RED重組方法構建雞白痢沙門菌rpoE基因缺失株，生物學特性結果表明rpoE基因缺失株呈粉色干燥粗糙型，且熒光板的熒光強，說明產生纖維素，但不產生卷曲菌毛，且對環境的抵抗力發生了下降。

2.3ygaE基因最早在大腸桿菌中報道，在大腸桿菌中，gabC(來源于ygaE)被報道其屬于gabDAPC操縱子，是操縱子的抑制劑[6]，gab操縱子的功能主要與λ-氨基丁酸的分解代謝有關，但是不能分解代謝其他的氮源物質[6]，然而對于ygaE基因在沙門菌中研究甚少，Schneider等[7]報道該基因能夠控制外膜蛋白OmpF/OmpC在高滲壓力下的早期階段和OmpA外膜蛋白的在高滲壓力下的后期階段。

2.4steA基因該基因是為數不多充當Ⅲ型分泌系統的基底之一，它位于SPI-1(毒力島1)和SPI-2(毒力島2)之間，Cardenal等[8]使用缺失該菌株的腸炎沙門菌去感染HeLa細胞發現會影響細胞外基質的生物合成，調節細胞增殖，并且能夠影響絲氨酸/蘇氨酸激酶的信號通路。同時也能夠抑制與免疫相關基因的表達和調控嘌呤核苷酸的形成，并且與SMAD蛋白磷酸化的信號通路有關。

2.5sipB基因該基因是位于Ⅲ型分泌系統SPI-1上的一種效應蛋白，主要與細菌的侵襲力有關，同時也與細胞的耐高滲有關，Hiroshi等[9]發現鼠傷寒沙門菌LT2菌株的sipB基因缺失會顯著降低菌株的耐高滲性，生化特性試驗表明NaCl的等滲溶液能夠增加sipB缺失菌株細胞膜的膜拓撲異構，親本菌株在滲透壓力的條件下能夠提高環丙烷脂肪酸的利用，另一方面有越來越多的證據表明SipB蛋白通路Caspase-1介導的通路激活IL-1b和IL-18來引起巨噬細胞的壞死和凋亡[10,11]。

2.6flgC基因該基因是構成細菌鞭毛基底部的一個成分，Shippy等[12]采用轉座子的方法構建出鼠傷寒沙門菌E2627 株flgC基因缺失菌株，生物學特性表明該缺失菌株生長速度較親本菌株和回復菌株相差不大，但其運動型發生了顯著的降低，對腸上皮細胞的侵入試驗表明該缺失菌株侵襲性發生了明顯的降低，進一步在雞體內的動態分布試驗也顯示肝臟和脾臟中細菌數目也發生了顯著的降低。以上結果表明該基因在沙門菌感染家禽入侵腸黏膜方面發揮著重要的作用。

2.7stdA基因Shippy等[13]通過轉座子的方式構建出腸炎沙門菌stdA基因缺失菌株，并將缺失菌株與親本菌株進行了生物學特性的比較，結果表明缺失株的生長速度與親本菌株相差不大，但是運動性較親本菌株相比發生了顯著的降低，通過體內和體外試驗進行了侵襲性的檢測，結果與flgC突變株的結果相類似，對腸上皮細胞的侵入降低，動物試驗結果表明在小腸和盲腸細菌數均低于親本菌株組，在肝臟和脾臟上的細菌數也顯著低于親本菌株。

2.8sefA基因主要編碼SEF14亞單位菌毛，Zhu等[14]使用同組自殺性質粒介導的細菌同源重組技術構建了sefA的缺失菌株，證實了該基因在SEF14菌毛體外和體內的致病過程中所扮演的重要角色，與親本菌株50336相比sefA基因缺失菌株能夠提高小鼠腹腔巨噬細胞的存活，6周齡的BALB/c毒力實驗結果表明缺失株的LD50明顯升高。

2.9yncD基因主要編碼外膜上依賴TonB的轉運體，Xiong等[15]使用重組自殺性質粒介導的細菌等位基因同源重組技術構建出yncD基因缺失菌株，通過腹腔接種小鼠進行毒力測定，發現其毒力較親本菌株相比發生了顯著降低，免疫保護效力實驗結果顯示對104和105CFU的野毒攻擊能提供100%的保護率。

2.10aceE基因該基因主要編碼丙酮酸脫氫酶，Pang等[16]使用轉座子插入的方法構建出腸炎沙門菌aceE基因缺失菌株，生物學特性研究表明該缺失菌株對腸上皮細胞的侵襲性降低，動物感染試驗表明缺失株對雞的毒力發生下降，完全致死劑量的野毒攻毒有50%的免疫保護率。

2.11ompR基因ompR基因主要與細菌的生物被膜形成有關，該基因缺失后會影響細菌生物被膜的形成，已有研究表明該基因還與細菌的毒力有一定的關系，缺失該基因后對小鼠的毒力會發生顯著的下降[17,18]，該基因缺失后仍能夠產生很高的IgG和IgA抗體，Dong等[19]發現腸炎沙門菌C50041缺失此基因后對野毒攻毒有62.5%的免疫保護率[19]。

2.12spiA 基因spiA基因參與沙門菌生物被膜的形成，董洪燕等[17]報道spiA基因是通過降低卷曲菌毛來調控腸炎沙門氏菌生物被膜的形成。spiA基因缺失株以及野生株的半數致死量為107.47和10.03，以100倍LD50野生株攻毒后spiA基因缺失突變株仍能保持50%的免疫保護效力。說明spiA基因缺失后通過影響細菌生物被膜的形成來達到減毒的目的。

2.13tpi基因該基因主要編碼糖酵解代謝過程中的磷酸丙糖異構酶，主要通過影響和改變細菌的形態，從而影響其在動物體內的增殖來達到減毒的目的，Gavin等[20]通過λRed重組系統，以鼠傷寒沙門菌SL1344為研究對象，構建出了tpi基因的缺失菌株，并且利用原核載體pBR322構建出缺失菌株的回復菌株，結果表明缺失該基因后菌株的某些生化特性發生了改變，并且形態較親本菌株相比也發生了變化，生長速度降低，在小鼠體內動態分布試驗表明在肝臟和脾臟的侵襲力均發生了下降，免疫105CFU的缺失菌株后能有效抵御野毒株的感染。

2.14spiC基因該基因編碼的效應蛋白在避免吞噬小泡與溶酶體融合機制中發揮極其重要的作用，有利于沙門菌在宿主巨噬細胞中的存活，SpiC效應蛋白還能參與調控其他效應蛋白的分泌，spiC基因缺失后導致細菌毒力下降。耿士忠等[21]構建了雞白痢沙門菌spiC基因缺失菌株，生物學特性研究表明，該缺失菌株生化特性仍和親本菌株保持一致，生長速度略慢于親本菌株，對雛雞的毒力實驗顯示spiC突變株對雛雞的半數致死量比野生株提高了約154倍，毒力明顯下降，這為后期研究其作為減毒雞白痢沙門菌活疫苗的可能性奠定了重要基礎。

3　展望

以減毒沙門菌作為載體表達外源蛋白已成為當今學者研究的一個熱點，它可以作為增強機體免疫力的一種方法，通過口服免疫使機體獲得持久的黏膜、體液和細胞免疫應答，通過將同一種病原體的主要保護性抗原基因在弱毒的沙門菌體內復制和表達，從而能夠以較小的免疫劑量來抵抗致病菌的感染，這種途徑相當有效。重組的減毒沙門菌表達異源性抗原基因，然后機體經口服攝入，誘發機體的免疫應答來對抗由這些入侵體內特定的病原體。與其他的細菌，如大腸桿菌，李斯特菌、志賀菌和弧菌相比，沙門菌侵襲的特性使它能輕易地誘發B細胞和記憶T細胞的免疫應答，這些給了沙門菌能夠長期誘導機體持續的免疫應答的潛能。

沙門菌是最早應用于活疫苗載體的病原菌之一，也是研究最深入的活菌疫苗載體，已經在防治多種疾病上顯示出了良好的應用前景，但仍存在一些問題，如毒力返強、外源基因表達不如預期穩定、質粒DNA的危險性、宿主對抗原免疫應答的負載能力不一等。目前對于沙門菌研究是一個熱點，很多沙門菌的二聯苗被廣泛的開發[22-24]。因此，通過對沙門菌毒力基因的深入研究，可為研制一個遺傳背景清晰、安全有效的沙門菌口服疫苗弱毒株，進一步將其開發為適于黏膜免疫的口服多價疫苗載體提供新的思路。今后的目標是開發更有優勢的技術來進一步完善沙門菌載體技術，為活菌載體技術和疫苗研發工作帶來新的契機。

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[收稿2015-07-20修回2015-08-04]

(編輯倪鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.036

S852.612文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1241-04

陳松彪(1990年-)，男，碩士，主要從事人畜共患病的診斷和防治的研究，E-mail:chensongbiao@126.com。

及指導教師：張春杰(1964年-)，女，博士，教授，主要從事動物疫病防控和分子免疫學方面的研究，E-mail:cjzhang@sina.com。