免疫學和分子生物學技術在豬傳染性胃腸炎診斷中的應用進展

謝立蘭，方六榮，方華為，張軍林，安康，肖少波*

(1.武漢生物工程學院 應用生物技術研究中心，武漢 430415；2. 華中農業大學 農業微生物學國家重點實驗室，武漢 430070)

免疫學和分子生物學技術在豬傳染性胃腸炎診斷中的應用進展

謝立蘭1，方六榮2，方華為1，張軍林1，安康2，肖少波2*

(1.武漢生物工程學院 應用生物技術研究中心，武漢 430415；2. 華中農業大學 農業微生物學國家重點實驗室，武漢 430070)

近年來，與豬傳染性胃腸炎(TGE)類似的腸道傳染病日益增多，以病理組織學觀察和臨床癥狀為主要指標的傳統方法已不能進行準確的判斷，眾多學者建立了大量的免疫學和分子生物學新方法。文章就主要免疫學技術(病毒中和實驗、酶聯免疫吸附試驗、膠體金技術)和分子生物學技術(反轉錄-聚合酶鏈式反應、反轉錄環介導等溫擴增技術、基于納米顆粒和DNA探針技術的超靈敏PCR方法)在TGE診斷中的最新應用研究進行了綜述，以期為進一步防控該病提供參考。

豬傳染性胃腸炎；免疫學技術；分子生物學技術；診斷

豬傳染性胃腸炎(Transmissible Gastroenteritis, TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus, TGEV)引起的以嚴重腹瀉、嘔吐和脫水為臨床特征的傳染病，是危害世界養豬業的重要疾病之一[1]。該病由Doyle和Hutchings于1946年在美國首次報道，幾年之內在世界各個國家和地區均有發現。為此，各國學者對TGE的診斷方法進行了大量研究，并建立了病毒分離、熒光抗體技術、免疫電子顯微鏡技術、病毒中和試驗、酶聯免疫吸附試驗、核酸探針和多聚酶鏈式反應等大量方法[2]。近年來，該病在我國的發病率呈上升趨勢，疫區也逐步擴大，并與豬輪狀病毒病、豬流行性腹瀉混合感染，給養豬業造成了嚴重的經濟損失[3]，國內學者對TGE的診斷特別是該病與其他腸道腹瀉病毒病的鑒別診斷方法進行了進一步的研究，診斷方法主要集中于免疫學方法和分子生物學方法。本文就近年來診斷該病的免疫學和分子生物學技術進行綜述，為進一步深入研究提供參考。

1 免疫學方法

1.1 病毒中和實驗 Carbery等人于1969年根據病毒與相應的抗體結合后會失去對易感動物或細胞的致病力的原理建立了病毒中和實驗(virus neutralization, VN)，該方法以直觀性著稱，長期以來被廣泛用于多種病毒病的檢測。然而，一些研究表明用中和實驗檢測TGEV抗體時，與豬呼吸道冠狀病毒(porcine respiratory coronavirus, PRCV)抗體存在交叉反應，這可能是因為TGEV和PRCV的序列相似度較高，導致中和實驗檢測TGEV的特異性不強。此外，Nelosn等[4]比較了VN實驗與ELISA試驗檢測TGEV抗體，當用細胞培養或腸道分離的TGEV感染豬并對其血清進行檢測時，結果發現：ELISA檢測陽性結果比VN 實驗檢測陽性結果分別早3 d和1 d，表明病毒中和實驗的敏感性不強[5]。綜上可見病毒中和實驗在用于檢測TGEV時表現出了特異性差和敏感性不強等缺點，因此限制了該方法在TGE診斷中的進一步應用。

1.2 ELISA試驗 ELISA試驗較之以往的血清學方法(如：VN實驗)具有敏感性高、特異性強和可高通量檢測樣本等特點，是當前應用最廣泛的一種免疫學檢測方法。周仲芳等于1997年率先以桿狀病毒表達的TGEV 纖突蛋白(S蛋白)建立了阻斷ELISA方法檢測TGEV[6]，并進一步證實該方法可用于TGEV和PRCV的鑒別診斷[7]。Carmen等進而運用Svanova Biotech公司的TGEV/PRCV阻斷ELISA試劑盒檢測了大量樣本，證實阻斷ELISA方法用于TGEV的血清學檢測方法可靠、簡便[8]，奠定了該方法為進出口檢驗檢疫中常用方法的重要地位。由于運用純化的全病毒作為包被抗原建立的試劑盒[8]存在抗原獲得量低，純化困難等缺點，López等對鑒別TGEV/PRCV的阻斷ELISA方法進行了優化[9]。PRCV與TGEV的唯一區別在于PRCV的S基因中缺失B、C位點，根據該原理利用桿狀病毒表達S 蛋白建立的抗原捕獲阻斷ELISA方法檢測TGEV，通過對600 份血清樣品進行檢測發現，其檢測結果與單獨檢測TGEV和PRCV的已有商品話試劑盒100%吻合，對兩種病毒檢測的特異性分別達到100% 和92.06%[9]。近期，國內學者尹杰等人則以表達、純化的TGEV S基因B、C抗原基因的重組蛋白作為診斷抗原建立了檢測TGEV抗體的間接ELISA方法，該間接ELISA方法特異性和重復性良好，敏感性比血清中和試驗高，有望用于TGEV的保護性抗體水平檢測[10]。

由于已建立的阻斷ELISA 商品化診斷試劑盒價格昂貴，不適于我國臨床診斷的廣泛應用[11]。近幾年來國內學者對TGEV的ELISA檢測方法進行了大量研究。基于病毒蛋白作為包被抗原的主要成果有：宋振輝等應用表達的重組TGEV衣殼蛋白(N蛋白)建立了間接ELISA方法[11]，通過對62 份血清樣品進行檢測發現，該方法與國外Svanova TGEV/PRCV試劑盒的符合率為93.5%。類似的，屈月[12]選用抗TGEV N蛋白的單抗和多抗血清建立雙抗體夾心ELISA方法，該方法具有較好的穩定性和準確性，與其他豬病病毒反應無交叉性。另外，牟春曉等以S基因主要抗原位點A和D為基礎建立了間接ELISA方法，該方法與純化的TGEV包被的間接ELISA的符合率也較好[13]。另一方面，考慮到當前申報的TGEV抗體ELISA檢測試劑盒均檢測血清中IgG抗體，而分泌性免疫球蛋白A (IgA)在腸道黏膜免疫起著重要作用，是腸道免疫中的主要抗體分子，且韓國已經研制出了檢測乳汁PED-IgA抗體的ELISA試劑盒。我國的蔣鳳英[14]和閆貴偉[15]等分別以純化的TGEV和重組的N蛋白為抗原建立了豬母乳抗TGEV IgA抗體檢測方法，對TGEV陽性乳汁樣品的最低檢測濃度分別為1∶320和1∶160，彌補了豬傳染性胃腸炎IgA抗體檢測空白，具有較好的應用前景[15]。

1.3 膠體金技術 膠體金免疫技術是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術[16]。由于具有檢測時間短、試劑和樣本用量少等特點，膠體金免疫技術在生物學各領域得到了廣泛的應用[16]。暢丹[17]和屈月[12]先后采用檸檬酸三鈉法制備20 nm膠體金顆粒標記抗TGEV N蛋白的單克隆抗體(McAb)，并分別以純化的抗TGEV N蛋白的多克隆抗體(PcAb)和羊抗鼠IgG作為檢測線和質控線成功研制出了一種檢測TGEV的膠體金免疫層析試紙條。該試紙條可檢測100 TCID50的TGEV病毒培養液，且4 ℃密封保存90 d后仍能有效檢測樣品，適合于基層推廣[17]。常亮等[18]通過優化膠體金的稀釋液等措施對TGEV的膠體金快速檢測條進行了改進，優化后的試紙條在常溫下可保存1 年，并可檢測出TGE病料中的TGEV，檢測結果與韓國的商品化試紙條一致，有望用于生產實際。

2 分子生物學診斷

2.1 反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術

2.1.1 RT-PCR RT-PCR 技術是將病毒RNA模板進行反轉錄，再以反轉錄產物進行PCR以檢測病毒的方法[2]。早在1997 年，Paton等[19]根據TGEV和PRCV的S基因設計引物，成功建立了檢測TGEV的最早的RT-PCR方法。李軍等首次在國內對RT-PCR反應條件進行優化，建立了可檢出1 pg TGEV RNA的RT-PCR方法，經過對56 份豬腹瀉糞樣的檢測證實該方法準確、可靠[20]。此后，一些學者針對病毒的N蛋白基因序列也建立了檢測TGEV的RT-PCR方法[21-22]，其中以王黎等報道的方法較好，其檢測靈敏度可達pg級(10 pg)[22]。

2.1.2 多重RT-PCR 多重PCR是在一個反應體系中加入一對以上的引物以同時擴增多種靶序列的方法，自Chamberlain等人首次創立該方法以來[23]，已被廣泛應用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定。由于與TGEV能夠產生相似臨床癥狀和病理變化的病原體較多，而如何在混合感染的樣品中同時鑒定多種病原微生物顯得非常重要，TGEV與其他腸道病毒的多重RT-PCR也獲得了極高的關注。

Kim等首先建立了同時診斷糞便中TGEV和豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的多重RT-PCR方法[24]，該方法可檢測到10 TCID50的最低病毒載量。鄒勇等[25]根據PEDV S基因、豬輪狀病毒(porcine group A rota virus, RV) VP7基因和TGEV S基因序列分別設計了三對引物，建立了最早鑒別TGEV、PEDV和輪狀病毒的三重RT-PCR方法，該鑒別方法簡單、快速、特異性好，可檢測到 1pg的TGEV RNA。Song等[26]使用與鄒勇等[25]不同的三對引物對TGEV、PEDV和RV進行多重RT-PCR，并檢測了2004年1月至2005年5月間韓國的157 份急性仔豬胃腸炎樣品，再分別與單獨檢測三種病毒的RT-PCR結果比較，結果顯示：該方法對三種病毒檢測的特異性均為100%，檢測TGEV的靈敏度可達100%。隨后等多個研究小組均對檢測PEDV、TGEV和RV的多重RT-PCR檢測方法進行了進一步的探索和優化[27-29]。張坤等建立的多重RT-PCR方法敏感性較好，能夠檢測到35 pg的TGEV-PEDV-RV三聯苗的混合RNA[30]，進一步應用該方法對華中地區75 份腹瀉豬糞樣進行的檢測結果表明該方法的敏感性高、特異性強(檢測TGEV的敏感性均為100%)，可用于腹瀉樣品中PEDV、TGEV和RV的檢測[30]。焦洋[31]在國內首次建立了同時快速鑒別診斷PEDV、TGEV和豬博卡病毒(Porcine bocavirus, PBoV)的多重RT-PCR方法，經臨床樣品檢測其檢測PEDV、TGEV和豬博卡病毒的最高敏感度分別為20 pg、35 pg和10 pg，且特異性均良好，可以應用于臨床檢測。Zhao等[32]則建立了同時檢測PEDV、TGEV、RV和豬圓環病毒2型(PCV2)的多重RT-PCR方法，其檢測病毒敏感性分別為2.17×103、2.1×103、1.74×104和1.26×104拷貝，且特異性較好。2.1.3 巢式RT-PCR(RT-nPCR) 巢式RT-PCR又稱套式RT-PCR，是在RT-PCR的基礎上再設計一對或多對引物對模板進行擴增，進而可以提高反應的敏感性和特異性。檢測TGEV的RT-nPCR方法由韓國學者Kim首創[24]，運用該方法可對TGEV和PEDV進行鑒別診斷，并可用于糞便樣品的現場直接檢測。韓國的Jung等人建立了多重RT-nPCR同時檢測TGEV和PEDV，該方法對人工感染和自然感染豬的空腸組織中TGEV檢測的結果與原位雜交技術完全吻合，且對TGEV的檢測敏感度可達2.4×10-4TCID50/mL[33]。Salem等進一步建立的多重RT-nPCR成功的完成了TGEV/PEDV/RV的鑒別診斷，并運用該方法對127 份樣品進行了檢測[34]。2.1.4 熒光定量RT-PCR 傳統的PCR技術因其不能對病毒核酸進行精準定量而只能進行定性分析，從而在很大程度上制約了PCR 檢測標準的建立[35]。近年來，熒光定量RT-PCR方法因其具有定量準確、敏感性更高(可以檢測到幾個拷貝/μL的病毒核酸)、特異性更好等優點，在TGEV診斷應用中取得了較大進展[2]。Chen等[36]以Invitrogen公司的LUX ( light upon extension, LUX)引物為基礎建立了檢測TGEV的熒光定量PCR方法，其敏感性比常規RT - PCR方法提高了10 倍。白興華等[37]首次以包含部分N基因序列的重組質粒為標準品成功建立了TGEV的TaqMan熒光定量RT-PCR方法，該方法的檢測敏感性達到15.3 拷貝/μL，優于Invitrogen公司的LUX引物法。此后，國內外多個課題組也陸續對檢測TGEV的熒光定量RT-PCR進行進一步探索，并建立了多個檢測靈敏度較高(檢測靈敏度≤10 拷貝/μL)的快速檢測方法[38-40]。

自Kim等[41]于2007年首次建立多重實時熒光定量PCR對TGEV和PEDV進行了同時檢測以來，檢測TGEV與其他腸道腹瀉相關病毒的多重實時熒光定量PCR方法取得了較大的進步。陳小金分別以PEDV、TGEV、RV的ORF3基因、S基因和VP7基因為靶基因建立了檢測3 種病毒的SYBR Green-I實時熒光定量 PCR 方法，最低檢測下限分別為85、68和13 拷貝/μL，且特異性和重復性良好[42]。吳洋進一步對這三種病毒的多重實時熒光定量PCR進行了優化，檢測的靈敏度上取得了很大進步，其檢測TGEV的最低下限為32 拷貝/μL，已在臨床診斷上具有重要意義[43]。

2.2 反轉錄環介導等溫擴增(RT-LAMP)技術 2000年，日本科學家Notomi等發明了環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，因該技術具有較高的敏感性與特異性，加之無須特殊儀器設備、操作簡單、檢測快速等優點，所以它已被廣泛應用。RT-LAMP技術是LAMP技術的一種延伸。Li等首次將這種技術應用于TGEV的檢測，作者首先根據TGEV N基因設計引物建立了RT-LAMP方法[44]，該方法可以區分TGEV、PEDV、RV和豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)的感染，不需要高精尖儀器并且操作流程簡單，易于推廣。高睿澤進一步對引物進行優化，改進了TGEV的RT-LAMP快速檢測方法，在63 ℃恒溫下作用50 min，使TGEV N基因獲得了高效率特異性擴增，可檢測到131.4 fg/μL的目標，具有極高的靈敏性[45]。

2.3 基于納米顆粒和DNA探針技術的超靈敏PCR方法(UNDP-PCR) 在動物疾病的診斷中常用的分子生物學方法還有很多，如核酸探針雜交技術等，該方法可以定性或定量檢測特異的病毒核酸，在TGE的臨床診斷中已取得較大進展[35]，并逐步建立了放射性標記探針(P32和S35等)和非放射性標記探針(生物素、辣根過氧化物酶和地高辛等)檢測TGEV的兩大類方法。在病毒感染早期，由于病毒尚未大量復制而導致樣本中的病毒載量較低，當其病毒含量低于已有檢測方法(如實時熒光定量RT-PCR等)的底線時將可能造成檢測結果呈假陰性。Huang等于2014年根據生物條形碼技術(Biobar code assay, BCA)原理，首次將磁性微粒、金納米顆粒和核酸探針技術相結合建立了基于納米顆粒和DNA探針技術的超靈敏PCR方法(ultrasensitive nanoparticle DNA probe-based PCR assay，UNDP-PCR)應用于PCV2的檢測[46]。該方法是通過先將偶聯有特異DNA探針的磁性微粒(Magnetic microparticles, MMP)與樣品雜交從而富集樣本核酸，即放大病毒的模板數量，得到MMP-病毒核酸復合體；再將包被有病毒特異性核酸識別標簽的金納米顆粒與MMP-病毒核酸復合體雜交，形成“三明治”模型，使樣本核酸的信號得到第二次放大；最后，選擇相應的方法把核酸識別標簽洗脫下來并作為模板進行PCR擴增，由于被洗脫下來的核酸標簽是待檢核酸信號的放大，因此極大的提高了檢測的靈敏度[46]。運用該方法檢測PCV2病毒核酸的靈敏度為10 拷貝/mL，是普通PCR的近500 倍[46]。隨后，該課題組又建立了同時檢測PCV2和TGEV的多重UNDP-PCR方法[47]，該方法不僅使TGEV檢測方法的靈敏度得到了更大的提高(可檢測出的最低病毒量為20 拷貝/mL)，同時開創了同時檢測DNA病毒和RNA病毒的超靈敏檢測技術，相信該技術將會被迅速運用于不同病毒和不同領域的檢測。

3 結語

綜上所述，在對TGE的實驗室診斷技術的研究中，近幾年來集中于免疫學方法和分子生物學方法的研究成果較多。其中分子生物學方法因其具有高效、快速、準確等諸多優點而在實驗室得到廣泛應用，尤其是熒光定量RT-PCR，比普通的RT-PCR更敏感，特異性更高。但受到儀器設備的限制，分子生物學的診斷方法目前還無法應用于臨床現地診斷。

近年來，免疫膠體金技術以其靈敏、特異和快捷等特點迅速發展起來，國外已開發出TGEV膠體金快速診斷試劑盒，方便快捷，非常適用于臨床現地檢測。我國建立的TGEV膠體金抗體檢測試紙條在特異性、靈敏度和穩定性等方面都已取得很大進步，不僅能檢測出病料中的TGEV，且對不同樣品的檢測結果與韓國的膠體金試劑盒一致[18]，非常適用于基層單位。因此，使診斷試劑商品化是我國今后發展TGE診斷技術的一個方向。同時，因為各種診斷方法都有其優點，也存在不足，在傳統檢測方法的基礎上，多種不同診斷技術綜合運用以進一步提高檢測靈敏度和特異性也將是今后相關研究的一個重要發展方向。

[1] 殷震，劉景華.動物病毒學[M].北京：科學出版社，1997:671-703.

[2] 楊金生，劉云志，柴方紅，等.豬傳染性胃腸炎診斷技術的研究進展[J].中國畜牧獸醫, 2012，39(5)：195-198.

[3] 殷相平，任曉峰，柳紀省.豬傳染性胃腸炎病毒致病機制的研究進展[J].世界華人消化雜志, 2013，21(1)：39-43.

[4] 王樹成，趙祥平，董志珍，等.二種方法檢測豬傳染性胃腸炎病毒抗體的比較[J].中國畜禽傳染病, 1997，(2):32-34.

[5] Nelson L D, Kelling C L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of transmissible gastroenteritis virus antibody in swine sera[J]. American Journal of Veterinary Research, 1984, 45(8):1654-1657.

[6] 周仲芳，Peggy L，李力復.桿狀病毒表達的豬傳染性胃腸炎病毒釘狀糖蛋白在其血清學診斷上的應用[J].中國獸醫科技, 1997，27(8):3-6.

[7] Sestak K, Zhou Z F, Shoup D I,etal. Evaluation of the baculo-virus-expressed S glycoprotein oftransmissible gastroenteritis virus (TGEV) as antigen in a competition ELISA to differentiate porcine respiratory coronavirus from TGEV antibodies in pigs[J]. J Vet Diagn Invest, 1999, 11(3):205-214

[8] Carman S, Josephson G, McEwen B,etal. Field validation of a commercial blocking ELISA to differentiate antibody to trans missible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine respiratory coronavirus and to identify TGEV-infected swine herds[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation : Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc, 2002, 14(2):97-105.

[9] López L, Venteo A, Garcia M,etal. Antigen-capture blocking enzyme-linked immunosorbent assay based on a baculovirus recombinant antigen to differentiate transmissible gastroenteritis virus from porcine respiratory coronavirus antibodies[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation : Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc, 2009, 21(5): 598-608.

[10]尹杰，楊恒，曹三杰，等.豬傳染性胃腸炎病毒S基因B、C位點的克隆與表達及間接ELISA方法的建立[J].中國獸醫雜志, 2015，51(1):7-10.

[11]宋振輝，郭萬柱，張鸚俊.豬傳染性胃腸炎病毒核衣殼蛋白的表達及在ELISA中的初步應用[J].農業生物技術學報, 2009，17(2):201-205.

[12]屈月.TGEV雙抗體夾心ELISA方法建立與膠體金免疫層析試紙條的制備[D].東北農業大學，2013.

[13]牟春曉，朱立麒，邢憲平，等.豬傳染性胃腸炎病毒基因主要抗原位點和的原核表達及間接檢測方法的建立[J].中國獸醫科學，2015，45(4)：356-360.

[14]蔣鳳英，鄒勇，何錫忠，等.豬母乳中抗豬傳染性胃腸炎病毒IgA檢測方法的建立[J].中國預防獸醫學報，2014，36(7)：551-554.

[15]閆貴偉，庫旭鋼，陳淑華，等.豬乳汁中抗豬傳染性胃腸炎病毒IgA抗體間接ELISA檢測方法的建立[J].中國預防獸醫學報, 2015，37(1):31-34.

[16]牟林琳，劉潔，廖園園，等.犬狂犬病毒抗體膠體金檢測試紙卡的研制[J].中國獸藥雜志, 2015，49(7):26-29.

[17]暢丹.豬傳染性胃腸炎病毒膠體金免疫層析試紙條的研制[D].東北農業大學，2008.

[18]常亮，陳伯祥，楊明，等.豬傳染性胃腸炎免疫膠體金診斷試劑條的研制[J].畜牧獸醫雜志, 2014，33(6):22-24,27.

[19]Paton D, Ibata G, Sands J,etal. Detection of transmissible gastroenteritis virus by RT-PCR and differentiation from porcine respiratory coronavirus[J]. Journal of Virological Methods, 1997, 66(2):303-309.

[20]李軍，林繼煌，陸承平，等.RT-PCR檢測豬傳染性胃腸炎病毒[J].中國獸醫學報, 2001，21(3):246-248.

[21]張作華，曲哲會，陳宏智，等.傳染性胃腸炎病毒RT-PCR檢測方法的建立與初步應用[J].黑龍江畜牧獸醫(科技版), 2015，(3)：131-133.

[22]王黎，李碧，周遠成，等.豬傳染性胃腸炎病毒RT-PCR檢測方法的建立及臨床應用[J].中國獸醫學報, 2015，35(2) ：191-194.

[23]Chamberlain J S, Gibbs R A, Ranier J E,etal. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification[J]. Nucleic Acids Research, 1988, 16(23):11141-11156.

[24]Kim L, Chang K O, Sestak K,etal. Development of a reverse transcription-nested polymerase chain reaction assay for differential diagnosis of transmissible gastroenteritis virus and porcine respiratory coronavirus from feces and nasal swabs of infected pigs[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation : Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc, 2000, 12(4):385-388.

[25]鄒勇，錢永清，唐永蘭，等.豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎和豬輪狀病毒RT-PCR鑒別診斷技術研究[J].上海農業學報, 2003，19(2):82-84.

[26]Song D S, Kang B K, Oh J S,etal. Multiplex reverse transcription-PCR for rapid differential detection of porcine epidemic diarrhea virus, transmissible gastroenteritis virus, and porcine group A rotavirus[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation : Official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc, 2006, 18(3):278-281.

[27]郭容利，何孔旺，倪艷秀，等.PEDV、TGEV、PARV多重RT-PCR檢測方法的建立及其應用[J].江蘇農業學報, 2013，29(5):1065-1069.

[28]徐引弟，張青嫻，李建林，等.PEDV、TGEV、RV多重RT-PCR檢測方法的建立與應用[J].中國獸藥雜志, 2014，48(11):10-13.

[29]曹玉琴，付丹，楊堯，等.PEDV-TGEV-RV多重RT-PCR鑒別檢測方法的建立及應用[J].中國獸醫科學, 2015，45(9): 881-887.

[30]張坤.豬病毒性腹瀉多重RT-PCR診斷方法的建立和應用及豬輪狀病毒的分離[D].華中農業大學，2010.

[31]焦洋.豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬博卡病毒多重PCR檢測方法的建立[D].南京農業大學，2013.

[32]Zhao J, Shi B J, Huang X G,etal. A multiplex RT-PCR assay for rapid and differential diagnosis of four porcine diarrhea associated viruses in field samples from pig farms in East China from 2010 to 2012[J]. Journal of Virological Methods, 2013, 194(1/2):107-112.

[33]Jung K, Kim J, Kim O,etal. Differentiation between porcine epidemic diarrhea virus and transmissible gastroenteritis virus in formalin-fixed paraffin-embedded tissues by multiplex RT-nested PCR and comparison withinsituhybridization[J]. Journal of Virological Methods, 2003, 108(1):41-47.

[34]Salem A N B, Chupin Sergei A, Bjadovskaya Olga P,etal. Multiplex nested RT-PCR for the detection of porcine enteric viruses[J]. Journal of Virological Methods, 2010, 165(2):283-293.

[35]佟有恩，劉芳萍.豬傳染性胃腸炎診斷技術的研究進展[J].畜牧獸醫科技信息, 2011，(4):19-22.

[36]Chen R, Huang W, Lin Z,etal. Development of a novel real-time RT-PCR assay with LUX primer for the detection of swine transmissible gastroenteritis virus[J]. Journal of Virological Methods, 2004, 122(1):57-61.[37]白興華.TGEV TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及其S蛋白抗原位點的原核表達[D].中國農業科學院，2007.

[38]董玲娟.TGEV Real-time PCR 檢測方法的建立及ORF7蛋白亞細胞定位和對病毒增殖影響的研究[D].西北農林科技大學，2012.

[39]Yu Z Y, Xu X W, Sun B,etal. Development of taq man-based real-time PCR assay for detecting transmissible gastroenteritis virus and its application in vacci ne evaluation[J]. Agricultural Science & Technology, 2014, 15(9): 1487-1490.

[40]Vemulapalli R, Gulani J, Santrich C. A real-time TaqMan?RT-PCR assay with an internal amplification control for rapid detection of transmissible gastroenteritis virus in swine fecal samples [J]. Journal of Virological Methods, 2009, 162 (1/2):231-235.

[41]Kim S H, Kim I J, Pyo H M,etal. Multiplex real-time RT-PCR for the simultaneous detection and quantification of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus[J]. Journal of Virological Methods, 2007, 146(1/2):172-177.

[42]陳小金.PEDV、TGEV、PoRV SYBR Green Ⅰ實時熒光PCR診斷方法的探索[D].中國農業科學院，2010.

[43]吳洋.豬腹瀉相關病毒多重和SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應用[D].東北農業大學，2014.

[44]Li P, Ren X. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of transmissible gastroenteritis virus[J]. Current Microbiology, 2011, 62(3):1074-1080.

[45]高睿澤，白云云，李訓良，等.豬傳染性胃腸炎病毒RT-LAMP檢測方法的建立及應用[J].中國獸醫科學, 2015，45(6):572-577.

[46]Huang Y, Zhang X, Du Q,etal. Preclinical detection of porcine circovirus type 2 infection using an ultrasensitive nanoparticle DNA probe-based PCR assay[J]. PloS One, 2014, 9(5):e97869.

[47]Huang Y, Xiang N, Wang Z G,etal. Ultrasensitive detection of RNA and DNA viruses simultaneously using duplex UNDP-PCR assay [J]. PloS One, 2015, 10(11): e0141545

(編輯：李文平)

Progress on the Application of Immunology and Molecular Biology Techniques in Diagnosing of Transmissible Gastroenteritis

XIE Li-Lan1, FANG Liu-Rong2, FANG Hua-wei1, ZHANG Jun-lin1, AN Kang2, XIAO Shao-bo2*

(1.CenterofAppliedBiotechnology,WuhanInstituteofBioengineering,Wuhan430415,China; 2.StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)

With the increase of viral diarrhea of pigs, it’s difficult to make accurate diagnosis for transmissible gastroenteritis (TGE) by the traditional methods depending on pathological changes and clinical symptoms. In recent years, many scholars have done a lot of research about the diagnosis and detection methods of TGE, especially in immunological methods and molecular biology techniques. Accordingly, some immunological methods (virus neutralization, ELISA, immune colloidal gold technique) and molecular biology techniques (RT-PCR, reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, ultrasensitive nanoparticle DNA probe-based PCR assay ) developed in diagnosis of TGE were reviewed and summarized in the thesis, in order to provide reference for the prophylaxis of TGE.

transmissible gastroenteritis; immunological technique; molecular biotechnology; diagnosis

國家自然科學基金(31402181)

謝立蘭，講師，從事動物病毒分子生物學與免疫學研究。

肖少波。E-mail: vet@mail.hzau.edu.cn

2015-12-21

A

1002-1280 (2016) 02-0056-07

S852.65