黃腐酸抗氧化作用機制研究進展

宋游行　李寶才　張惠芬　何　靜

(昆明理工大學生命科學與技術學院，云南　昆明　650500)

黃腐酸抗氧化作用機制研究進展

宋游行李寶才張惠芬1何靜

(昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明650500)

〔關鍵詞〕黃腐酸；抗氧化；自由基

研究表明，人體內的氧化損傷與多種疾病如腫瘤、心腦血管疾病、機體衰老等的發生密切相關〔1〕。人體內自由基主要包括氧自由基(OFR)，過氧化脂質(LPO)和脂類自由基，其對機體造成的損傷是體內氧化作用的結果，對生物大分子和膜結構均有不同方式的損傷作用。向系統內補充抗氧化劑，清除過多的自由基或終止體內自由基反應，可防止線粒體腫脹，抑制膜的脂質過氧化反應、蛋白質交聯等作用，對于保護生物膜結構與功能完整性，抑制自由基誘發的疾病或增強體質和治療疾病都是有意義的。因此，研究開發新型高效、綠色環保的天然抗氧化劑刻不容緩。黃腐酸(FA)是自然界廣泛存在的一類從泥炭、褐煤、風化煤等提取的活性產物，氧化程度高，含羧基、羥基、酚羥基、醌基等多種活性官能團，極易被人體吸收利用，是醫療效果最好的腐植酸。早在幾千年前，李時珍在《本草綱目》中已有類似腐植酸藥用的記載，主要用以治療鼻子出血、婦女氣血痛及諸瘡毒、金瘡出血等疾病〔2〕。近年來，部分研究報道了FA及其鈉鹽在消炎、抗病毒、抗氧化、抗癌、抗潰瘍等方面的顯著療效，且其抗氧化作用可能是發揮相關重要的生理功效的藥理基礎〔3〕。因此，對FA抗氧化作用機制的研究今后可能將成為其基礎研究的重點之一。目前，對不同產地FA抗氧化作用的研究以證明其具備抗氧化性為多，也有一些研究涉及分析其結構與抗氧化性的關系，但對FA抗氧化作用實現的途徑及其作用機制的研究報道較少〔4〕。本文結合體內主要氧化產物自由基的產生途徑，從抑制體內氧化物產生與清除已有氧化物的角度，綜述近年來國內外有關FA抗氧化作用機制的研究工作，為FA抗氧化作用機制的研究提供一定思路。

1自由基的產生

自由基，化學上也稱“游離基”，是指化合物的分子在光熱等外界條件下，共價鍵發生均裂而形成的具有不成對電子的原子或基團。正常機體的氧化損傷和抗氧化體系處于動態平衡，機體正常代謝產生的活性氧自由基能不斷地被抗氧化體系清除，以維持細胞氧化和還原穩態。而人體可能由于受到外界刺激，使機體產生應激反應，也可產生自由基，打破動態平衡，損害機體的組織和細胞，進而引起慢性疾病及衰老效應〔5〕。據國內外相關報道，人體可產生各種各樣的活性自由基。自由基是人體脂質過氧化和損傷的直接兇手，其中衰老、腫瘤產生、心腦血管疾病等60多種疾病與自由基產生密切相關。

具體而言，人體內自由基的產生有內源性和外源性兩種途徑。例如化學誘導、環境污染、吸煙、微波震蕩等外界因素都會使人體內產生外源性自由基〔6〕。而內源性自由基的產生則不然，主要源于機體自身代謝和酶促反應，例如線粒體中電子傳導系統、線粒體腫脹、線粒體脂質過氧化過程等引起。人體在呼吸代謝中需要能量，而適量的自由基則不斷傳遞著能量，保持呼吸代謝正常運轉。

2FA的抗氧化作用機制研究

FA可能通過不同途徑抑制或清除氧化損傷機體的自由基，從而發揮其抗氧化作用，但目前對FA抗氧化作用實現的途徑及其作用機制的研究報道較少。

2.1FA化學結構決定其具有抗氧化作用FA是一類從泥炭、褐煤、風化煤等提取的活性產物,氧化程度高，含羧基、羥基、酚羥基、醌基等多種活性官能團。FA中的氧68%～91%存在于官能團上，最重要的官能團是總酸性基團和醌基，這些基團決定了FA的化學性質和生物活性。

FA自身的多酚-醌基結構和芳香共軛體系對自由基具有清除作用。其在某些情況下是電子接受體，表現為氧化劑，而在有些情況下則是電子給予體，表現為還原劑，這證實了FA本身就是一個氧化-還原體系，存在醌基-半醌-酚基的轉換、硝基、酚羥基等的各種轉換〔7〕。在這種轉換的過程中，struyk提出“自生電子傳遞中間體”的假說。而這種氧化-還原體系在體內必然會參與到生理和能量代謝中。Nardi等〔8〕認為，FA進入植物體主要作為氫的受體影響植物的氧化還原，促進植物體內糖的積累，特別是在缺少氧的條件下，可以促進ATP的積累合成，或者為多酚供應源，起呼吸催化劑的作用。Aiken等〔9〕提出，FA的芳香共軛體系，順磁水平(自由基濃度)與生理藥理活性呈現正相關，并建議用自由基的濃度作為評價FA生理藥理活性的重要指標。可見，FA的結構組成與其生理藥理活性密切相關，可能是其抗氧化機制之一。

2.2FA對相關酶和激素活性的影響有報道認為，FA的藥理作用實際就是激素的作用。動植物自身的體內激素有上百種之多，而FA是由微生物的代謝產生，所以FA中也有幾十種激素，他們有的是和FA以化學或者物理鍵結合，有的可能本來就是FA組成中的一份子，不過是存在形式不一樣而已。

也有部分報道認為，FA是酶的激活劑或者抑制劑，大致包括以下幾種：(1)抑制透明質酸酶，與抗感染和減少炎癥滲出有關；(2)抑制紅細胞中三磷酸腺苷酶，以調節基礎代謝；(3)抑制膽堿酯酶，與減緩疼痛相關；(4)激活己糖激酶，促進糖氧化磷酸化和糖代謝；(5)激活凝血酶，或誘導纖維蛋白溶解酶原激活劑(t-PA)釋放,這與凝血止血有關；(6)活化植物體內的合成酶(主要為醛羧酶和轉化酶)，促進可溶性碳水化合物積累，讓細胞滲透壓改變。此外，FA還對過氧歧化酶、過氧化氫酶、脂合酶等都有活化或抑制作用〔10〕。

2.3FA的金屬離子絡合作用眾所周知，自由基的另一重要來源是機體內過渡金屬離子。絕大多數過渡金屬離子都含有未配對的電子，它們可以催化機體產生自由基，對機體造成氧化損傷。而FA對金屬離子具有一定的絡合作用，從而可以很大程度地抑制自由基產生。FA的羧基、酚羥基以及很多含O、P、N、S等的基團都是電子給予體，所以是一類天然的絡合劑或者螯合劑，較容易與金屬離子配位。因至今很難分辨到底哪些是螯合，哪些是絡合，故統稱為絡合反應。

王將等〔11〕利用電子自旋共振(ESR)波譜技術，分析鐵離子影響下杏仁皮中黃酮類化合物抗自由基的效應。結果證明：杏仁皮中黃酮類化合物對鐵影響下自由基誘發的紅細胞膜過氧化有一定保護作用。分析其機制，一是杏仁皮中黃酮類化合物對鐵的絡合作用，減弱了鐵的活性而抑制自由基的過渡產生；二是對膜脂質過氧化啟動因子·OH的高效清除及對次級產生的脂自由基的清除，從而抑制脂質過氧化鏈的啟動與增長。而李寶才等〔12〕則認為茶褐素和黃腐酸具有相似的結構和官能團，由此生理藥理活性相近。Gao等〔13〕研究茶多酚對鐵誘導的突觸小體脂質過氧化的保護作用，結果表明，茶多酚的抗氧化作用不僅與其清除自由基有關，而且也與其絡合鐵離子的能力密切相關。有學者的實驗證明，茶黃素是通過與銅離子及鐵離子的絡合而降低細胞中低密度脂蛋白(LDL)的氧化程度，并抑制體內Fenton反應，從而起到抑制活性氧自由基產生的作用。

FA的絡合能力很強，雖然不知道具體的絡合形式和配位數，但其對自由基產生和消除有影響是毋庸置疑的。據報道，X光電子能譜(XPS)可以鑒別元素的種類和化合價態、測定元素相對含量，了解中心原子與配位原子的相互作用，可能是研究電荷轉移絡合物最有利的手段之一。如有學者〔14〕利用XPS研究發現，FA-La的O1S結合能比FA-K高，對自由基的抑制程度可能就會更高。

2.4FA抑制脂質過氧化反應脂質過氧化是一種自由基鏈式反應，可反復進行，并伴隨有大量中間產物產生(如：O2、H2O2、·OH等自由基和過氧化物)；損害細胞膜結構和功能，同時其中間產物及終產物丙二醛(MDA)對細胞也具毒性。脂質過氧化過程中發生ROS氧化生物膜的過程，即ROS與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關的多不飽和脂肪酸的側鏈及核酸等大分子物質起脂質過氧化反應形成LPO，如MDA和4-羥基壬烯酸(HNE)，從而使細胞膜的流動性和通透性發生改變，最終導致細胞結構和功能的改變〔15〕。

機體內的自由基可以攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，并引發脂質自由基過氧化鏈式反應。FA可與脂質鏈式的中間產物脂氧自由基反應，從而終止鏈反應，抑制脂質過氧化。曾述之〔16〕研究表明，北京風化煤黃腐酸鈉對體內不飽和脂肪酸氧化抑制率達到92.7%，對應激紅細胞過氧化(生成MDA)抑制率92.4%，對·OH 誘導溶血A540抑制率73.2%，對紅細胞釋放抑制率和紅細胞膜膽堿酯酶(AchE)的滅活抑制率均增加了1倍左右。王偉等〔17〕研究發現，大骨節病(KBD)病人體內存在脂質過氧化和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力降低，由此，FA的自由基清除機制在保護生物膜成分和組織損傷的臨床應用中得到初步證實。

2.5FA激活機體抗氧化體系機體自身的抗氧化體系分為酶抗氧化系統和非酶抗氧化系統。體內的抗氧化酶系統主要有超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-Px以及過氧化氫酶(CAT)、細胞色素氧化酶(CCO)等，這些酶可以抵抗自由基，防止衰老，保護生物體免疫損傷，因此也稱為防御酶〔18〕。非酶系統則包括維生素A、維生素E、維生素C等。

Frimmel等〔19〕的研究報道，FA的施加可以影響植物的氧化過程，促進氧的吸收，提高生理代謝能力和酶的活力。Rezacova等〔18〕認為，FA螯合金屬離子影響植物細胞膜通透性和膜上載體的性質，增加ATP酶的活性。正是由于FA的綜合刺激活性，才促使植物各種酶〔包括多酚氧化酶(FOD)、蛋白分解酶、過氧化氫酶(CAD)、過氧化物酶(POD)等〕的合成及生理活性增強。Anjum等〔20〕的研究表明，FA具有激活細胞保護酶活性，延緩衰老的作用。回振龍等〔21〕也報道稱，FA可以同時提高SOD、CAD和POD等酶的活性，清除活性自由基，激發作物生命活性。

在農業上，植物體中加入FA之后也可以增加維生素C的含量，使FA對自由基的清除進一步加強，而FA本身可能也含有一些維生素類物質可以起到作用。

3研究前景展望

近年來，茶多酚、蜂膠、殼聚糖、橙皮素等許多天然抗氧化物質均得到了較好的應用，如國外天然蜂膠的生產工藝已比較成熟〔22〕,橙皮素在歐洲被廣泛作為一種具有食品補充劑使用〔23〕。但抗氧化活性物質的研究及運用總體上還處在初級階段，這也意味著對它們的研究有著廣闊的前景，具有很大的潛力〔24〕。據相關資料證實，在人們經常食用的產品中，天然抗氧化劑的毒性遠遠低于人工合成抗氧化劑，因此，從自然界中尋找天然抗氧化劑已引起越來越多科學家的高度重視。FA具有高效的天然抗氧化活性成分，如果能對其抗氧化作用進行深入研究與開發，或許可以產生豐富的商業價值和社會價值。

而FA相關生物活性基礎研究工作的難點和重點依舊是其自身的結構和穩定性問題。大量的研究數據表明,不同產地來源,甚至同一產地不同分級成分FA的生物活性作用都可能大不相同，正如Senesi等〔25〕所說：“應當先研究簡單的確定了的腐植酸的化學結構和醫療效果，再推進更艱難的天然腐植酸研究” 。作為食品添加、醫藥實驗或者臨床試驗的FA產品，必須在嚴格實驗的基礎上，以原料產地固定產品來源，固定生產技術工藝，并對產品質量嚴格控制。只有穩定的物質結構基礎和穩定性，才能使FA的生物活性基礎研究更加明朗。

就目前而言，不同產地FA抗氧化作用的研究以證明其具備抗氧化作用為多，但對其抗氧化作用實現的途徑及其作用機制的研究報道相對較少。筆者認為，首先，在FA影響酶產生及活性方面，已知生物體中存在多達100種以上的氧化酶，而FA中也有多種類別的酶，但對兩者之間相互關系的研究不多，需多開展這方面的相關研究工作。其次，在提高機體抗氧化系統功能性方面，有關FA增強機體抗氧化酶活性的研究較少，對不同性質及結構的FA對不同的抗氧化酶活性影響的規律尚缺乏認識。再次，FA的抗氧化性與其組分、結構或聚合度都有密切關系，目前這方面的研究尚需要進一步探究。最后，和已研究成熟的天然抗氧化劑相比較，在分子水平層面，應對FA是否可以提高抗氧化酶m-RNA轉錄水平的表達量，對抗氧化酶基因表達是否可以呈現相關的調節作用來研究；而在細胞水平層面，則應該建立可行的細胞損傷模型和動物損傷模型對其進行深入的探討；同時，還應加強對FA發揮抗氧化作用的內源性分子靶點的研究，以找到問題的本質〔26〕。上述方面必將成為今后黃腐酸抗氧化作用機制研究的重要發展方向。

4參考文獻

1Comuzzo P,Battistutta F,Vendrame M,etal.Antioxidant properties of different products and additives in white wine〔J〕.Food Chem,2014;168:107-14.

2成紹鑫.腐植酸類物論〔M〕.北京：化學工業出版社,2007:259-60.

3Sehepetkin IA,Khlebnikov AI,Kwon BS.Medical drugs from humus matter:focus on mumie〔J〕.Drug Develop Res,2002;(7):140-59.

4Tabatabaie T,Vasquez-Weldon A,Moore DR,etal.Free radicals and the pathogenesis of type 1 diabetes:bête-cell cytokine-mediated free radical generation via cyclooxygenase-2 〔J〕.Diabetes,2003;(8):1994-9.

5Peskind ER,Li G,Shofer JB,etal.Influence of lifestyle modifications on age-related free radical injury to brain〔J〕.JAMA Neurol,2014;71(9):1150-4.

6Bild W,Ciobica A,Padurariu M,etal.The interdependence of the reactive species of oxygen,nitrogen,and carbon〔J〕.J Phys Biochem,2013;69(1):147-54.

7欒富波，謝麗，李俊，等.腐植酸的氧化還原行為及其研究進展〔J〕.化學通報，2008;71(11)：833-7.

8Nardi S,Pizzeghello D,Muscolo A,etal.Physiological effects of humic substances on higher plants〔J〕.Soil Biol Biochem,2002;(34):1527-36.

9Aiken GR,Mcknight DM,Wershaw RL,etal.Humic substances in soil,sediment,and water:geochemistry,isolation,and,characterization〔M〕.NewYork:Wiley Sons,1985:329-62.

10Alessandro P.Humic substances in terrestrial ecosystems〔M〕.NewYork:Elsevier Press,1996:378-81.

11王將，鄭亞軍，馮翠萍，等.杏仁皮中黃酮類化合物抗氧化性的研究〔J〕.中國糧油學報，2010;25(1)：78-81.

12李寶才，龔加順，張惠芬，等.腐植酸與普洱茶茶色素〔J〕.腐植酸，2007;(1)：19-26.

13Gao Q,Zhao B,Li M,etal.Studies on protective mechanisms of four components of green tea polyphenols against lipid peroxidation in synaptosomes〔J〕.Biochem Biophys Acta,1996;1304(3):210-22.

14袁歡欣，歐陽健明.X射線光電子能譜在配合物研究中的應用及其研究進展〔J〕.光譜學與光譜分析，2007;27(2)：395-9.

15陳文華，趙鳳達，沈麗娟，等.姜黃醇提取液對冰乙酸損傷性潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜保護作用及機制研究〔J〕.中國中醫急癥，2011;20(10)：1611-3.

16曾述之.福爾酸鈉對羥自由基應激不飽和脂酸及人紅細胞的影響〔J〕.腐植酸，1994;(3):3-6.

17王偉，陳靜宏，于伯泉，等.自由基氧化損傷與大骨節病的相關性研究〔J〕.中國地方病學雜志，2011;30(29)：10-2.

18Rezacova V,Baldrian P,Hrselova H,etal.Influence of mineral and organic fertiliationon soil fungi,enzyme activities and humic substances in along-term field experiment〔J〕.Folia Microbiol(Praha),2007;52(4):415-21.

19Frimmel FH,Christman RF.Humic substances and their role in the environment〔M〕.NewYork:John Wiley Sons,1988:75-8.

20Anjum SA,Wang L,Farooq M,etal.Fulvic acid application improves the maize erformance under well watered and drought conditions 〔J〕.J Agronomy Crop Sci,2011;197:409-17.

21回振龍，李自龍，劉文瑜，等.黃腐酸浸種對PEG模擬干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發及幼苗生長的影響〔J〕.西北植物學報，2013;33(8):1621-9.

22Gardana C,Barbieri A,Sihonetti P,etal.Biotransformation strategy to reduce allergens in propolis〔J〕.Appl Environ Microbiol,2012;78(13):4654-8.

23Satinsky D,Jaegerova K,Havlikova L,etal.A new and fast HPLC method for determination of rutin,troxerutin,diosmin and hesperidin in food supplements using fused-core column technology〔J〕.Food Analytical Methods,2013;6(5):1353-60.

24魯曉翔.黃酮類化合物抗氧化作用機制研究進展〔J〕.食品研究與開發，2012;33(3):220-4.

25Senesi N,Miano TM.Humic Substances in the global environment and implication on human health〔M〕.New York:Elsevier Press,1994:1245-9.

26趙海田，王振宇，程翠林，等.松多酚類活性物質抗氧化構效關系與作用機制研究進展〔J〕.食品工業科技,，2012;33(2):458-61.

〔2015-10-10修回〕

(編輯曲莉)

基金項目：國家自然科學基金資助項目(21166013)

〔中圖分類號〕R2

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2532-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.106

1昆明理工大學云南省食品安全研究院

第一作者：宋游行(1989-)，男，在讀碩士，主要從事腐植酸醫藥應用研究。