結腸癌干細胞特征及生物學行為研究進展

陳方軍　劉玉蘭　張育軍　孫國平

(安慶醫藥高等專科學校臨床醫學系，安徽　安慶　246052)

結腸癌干細胞特征及生物學行為研究進展

陳方軍劉玉蘭1張育軍1孫國平2

(安慶醫藥高等專科學校臨床醫學系，安徽安慶246052)

〔關鍵詞〕結腸癌;干細胞;增殖;轉移

由于結腸癌早期缺乏癥狀難以診斷，發現時多已進入晚期，預后差、存活率低。結腸癌組織中存在一小部分具有誘導腫瘤發生、增殖，促進腫瘤遷徙、轉移的特殊細胞，稱為結腸癌干細胞(CCSCs)，研究CCSCs的相關生物學特征，可以為結腸癌的診斷、治療、預防提供一種全新的手段。

1CCSCs的特征

腫瘤干細胞目前已被認為是腫瘤發生、發展、轉移和藥物抵抗的重要原因，了解CCSCs的特性有助于分離CCSCs并研究其與腫瘤相關的生物學行為。

1.1CCSCs與非CCSCs之間的轉化細胞類型的可塑性在特定條件下可引起腫瘤干細胞和非干細胞之間的相互轉化。Schwitalla等〔1〕發現在炎性腫瘤微環境中,核因子(NF)-κB通過活化的Wnt信號通路，誘導非干細胞去分化，從而使組織獲得腫瘤發生的能力，而特定的腸上皮細胞RelA/p65(NF-κB亞單位)的消除可阻斷腸腺窩干細胞的擴增,這說明體內炎癥信號對CCSCs的產生和去分化的作用。Yang等〔2〕也發現CCSCs和非CCSCs在正常和輻射環境中存在固有的相互轉換和動態平衡，轉化生長因子(TGF)-β可能通過激活上皮間充質轉化在平衡中扮演重要角色。

1.2CCSCs的標志物有研究通過蛋白質組分析結腸癌細胞株SW1116中有包括CD133和CD29在內的10個蛋白斑點被識別〔3，4〕，在細胞株HCT116 和SW480上有CD24表達〔5〕，DLD-1細胞株上表達CD133、 CD166、 G蛋白耦聯受體(LGR)5和乙醛脫氫酶(ALDH)〔6〕。具有這些標志物的細胞群具有干細胞特性，在體外和體內表現出更強的腫瘤生成、遷移、侵襲及化學抵抗能力。研究發現，LGR5抗體在正常組織中不被染色，在高分化腫瘤的癌細胞中有單個或多達4個干細胞簇被染色，在低分化腫瘤中有9～81個干細胞簇被染色〔7〕；在伊立替康存在的環境下，LGR5的表達改變可引起CCSCs在增殖和抗藥狀態下發生相互轉化。這些結果顯示不同群集的干細胞數量和標志物的表達改變可導致腫瘤等級的重構〔8〕。細胞凋亡相關核蛋白PHLDA1在結腸癌中表達也很廣泛，在腫瘤侵襲的邊緣常有增強表達和核定位。小干擾RNA(siRNA)介導的PHLDA1抑制可阻止結腸癌細胞體外遷移、錨定非依賴性生長及體內腫瘤的生成，提示PHLDA1也可能是人腸組織潛在的上皮干細胞標志物〔9〕。

2CCSCs的增殖、分化和轉移

2.1CCSCs的增殖對結腸癌ALDH+CCSCs細胞群研究發現，胰島素樣生長因子(IGF)-1在β-連環蛋白(catenin)依賴的方式下可使絲/蘇氨酸激酶(AKT)組成性激活突變體過表達導致干細胞數量增多，而IGF-1抗體Cp-751,871可減少干細胞數量，抑制腫瘤生長〔10〕；此外，Lin等〔11〕發現ALDH+/CD133+CCSCs表達高水平的磷酸化信號轉導和轉錄活化因子(STAT)3，姜黃素及類似物GO-Y030可抑制這種改變,減少STAT3下游靶基因表達，從而誘導CCSCs凋亡，抑制腫瘤形成。另有研究顯示白細胞介素(IL)-6可通過誘導細胞株HCT-116和HT-29CCSCs Notch-1和CD44的表達，增強這兩種細胞株的腫瘤生成能力〔12〕；干擾素(IFN)-γ和腫瘤細胞壞死因子(TNF)-α也可刺激C26結腸癌小鼠CCSCs加速腫瘤的生長,通過siRNA抑制CCSCs中的低氧誘導因子(HIF)-1α信號通路則能有效降低CCSCs在體內炎性環境中的致瘤能力〔13〕。Leng等〔6〕則發現DLD-1細胞株中過度表達的kruppel樣轉錄因子(KLF)4，能誘導體細胞產生多能干細胞，促進體內外的腫瘤生成。

Yap多肽的高水平是促使CCSCs增殖的必需因素，Zhou等〔14〕研究顯示71例結腸癌病例中有68例高表達Yap，36個結腸癌細胞株中至少有30個高表達Yap，這可引起腸組織干細胞群擴大，促使癌細胞增殖，而Yap的消除可減弱β-catenin和Notch信號傳導，抑制細胞增殖和生存，在 HCT116細胞株中，同樣發現表皮生長因子(EGF)對維持干細胞增殖是必需的，通過抑制EGF受體(EGFR)的自身磷酸化和下游信號通路蛋白AKT、細胞外信號調節激酶(ERK)1/2能抑制CCSCs增殖，誘導CCSCs的凋亡〔15〕。Shenoy等〔16〕通過Wnt通路報告實驗分離了潰瘍性結腸炎(UC)病人具有高度Wnt活性的ALDH+CCSCs，研究評估了Wnt/β-catenin信號通路與結腸炎向癌轉化(CCT)之間的機制，發現20個CCSCs單細胞注射后，有5個可引起組織腫瘤形成，顯示CCSCs具有高度的克隆和致瘤潛能。Múnera等〔17〕發現初生小鼠結腸上皮細胞中Est2基因的條件性失活可使小鼠結腸隱窩過度表達，引起黏膜厚度增加、杯狀細胞數量增多，這種選擇性隱窩群分化狀態的改變提示Ets2缺陷改變了CCSCs的數量和行為，導致腫瘤的發生。

2.2CCSCs的分化DNA5′端甲基化是與組織分化相關的一種重要表觀修飾，5 mC在與TET蛋白家族成員相關的酶促反應中被轉化成5hmC(5-hydroxymethylcytosine)。研究發現5hmC在鼠和人正常結腸組織中含量豐富，而在結腸癌組織中顯著減少，顯示5hmC在組織分化中的重要作用〔18〕。另有研究觀察了25例腫瘤樣本中表達CD133的CCSCs，發現骨形成蛋白(BMP)4激活包含磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(PKB)/AKT的BMP信號通路，促進了CCSCs的終末分化、凋亡〔19〕。Merlos-Suárez等〔20〕則通過流式細胞術發現免疫缺陷性小鼠的CCSCs高表達酪氨酸蛋白激酶受體EphB2，表現出強大的腫瘤生成和長期自我更新潛能，但在細胞分化中逐漸沉默。

2.3轉移Dieter等〔21〕發現腫瘤起始細胞(TICs)存在細胞異質性，具有維持連續異種移植腫瘤形成的長期的(LT)-TICs主要儲存在骨髓中，不斷更新的LT-TICs促使腫瘤轉移的發生。高遷移率蛋白(HMG)A1是結腸癌細胞轉移分子機制中關鍵的轉錄因子。Belton等〔22〕發現在轉基因小鼠中HMGA1誘導CCSCs表達Twist1蛋白，抑制E-cadherin的表達，促進腫瘤轉移發生和發展；而HMGA1的敲除阻斷腫瘤細胞的錨定非依賴性生長、移植瘤的發生，也抑制體內肝轉移的發生。結腸癌的肝轉移現象還與TGFβ的參與有關，Zubeldia等〔23〕將Mc38-luc TGFβ細胞注射到小鼠脾臟，發現TGFβ促進原發腫瘤的生長和肝轉移的發生，這可能與TGFβ引起Mc38細胞Smad2、Smad3和Smad1/5/8活化，增強細胞侵襲和跨內皮遷移能力有關。另有研究發現結腸癌細胞株(HT29 和HCT-116)CCSCs分泌的高水平纖溶酶原激活抑制物(PAI)-1可顯著刺激這兩種細胞株遷移，而針對PAI-1的抗體能阻斷這種效應〔24〕。

對人結腸癌HT29細胞株CD133+CCSCs的微小RNA(miRNAs)表達譜進行研究，發現有11種過表達和8種低表達的miRNAs，如miR-429,miR-155,and miR-320d，而SW1116 CD133+/CD44+CCSCs則有31種上調和31種下調的miRNAs，如miR29a,miR29b,miR449b and miR4524。基因本體和通路分析顯示這些表達差異的miRNAs可進一步調節CCSCs信號通路、細胞骨架及膜蛋白表達，從而賦予CCSCs復發和轉移的生物學行為〔25,26〕。

3治療與預后

3.1CCSCs的治療化學抵抗是結腸癌藥物治療效果低下的主要原因，而眾多研究顯示CCSCs與結腸癌的化學抵抗關系密切。Chen等〔27〕發現ALDH1+HT29和HT29-taxol細胞株低表達miRNA125a/b，高表達ALDH1A3和Mcl1，這種miRNA125a/b引起ALDH1A3和Mcl1基因表達上調的機制提高了細胞生存能力，減少細胞凋亡，使CCSCs在化學抵抗中發揮關鍵作用。Wu等〔28〕對由CCSCs引發的免疫缺陷小鼠結腸腫瘤給予BMP4，發現BMP4可減弱腫瘤對治療的化學抵抗，增強5-Fu和奧沙利鉑的抗腫瘤效應；O′Brien等〔29〕發現沉默分化抑制因子ID1和ID3也可提高干細胞對化療藥物奧沙利鉑的敏感性；van Houdt等〔30〕則發現凋亡蛋白抑制劑BIRC6是伴肝轉移結腸癌病人CCSCs對奧沙利鉑和順鉑抵抗的重要調節因子，針對BIRC6的治療可能有助于消除CCSCs。另有研究顯示，表達同源異型盒基因cdx1的SW1222細胞株對紫杉醇誘導的細胞毒性有顯著抵抗，這與cdx1、bcl-2的表達、半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3活力、微管相關蛋白(LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例上調有關，cdx1的沉默和溶酶體抑制劑bafilomycinA的治療能提高紫杉醇誘導的細胞毒性，cdx1 siRNA的瘤內注射可顯著抑制接種cdx1癌細胞的移植瘤生長〔28〕。Bitarte等〔31〕對以伊立替康為基礎的一線藥物治療沒反應的結腸癌患者觀察發現，具有干細胞特性的結腸癌球中miRNA451表達下調，而miRNA451的恢復可減少三磷酸腺苷結合轉運蛋白(ABC)B1基因的表達，導致癌細胞對伊立替康敏感，這個結果提示miRNA451是結腸癌病人發生藥物抵抗的一個重要因素。另有研究發現將表達特異腫瘤相關抗原Cep55來源的抗原蛋白Cep55/c10orf3_193 的CTL克隆41進行過繼轉移，可顯著抑制對化療藥物伊立替康、依托泊甙抵抗的SW480細胞株CCSCs的增殖，提示Cep55/c10orf3-193蛋白為基礎的癌癥疫苗治療或者CTL的過繼轉移是治療有化療抵抗的CCSCs的一種可行途徑〔32〕。

3.2預后Padin-Iruegas等〔33〕從伴轉移的結腸癌病人的血樣本中分離循環癌干細胞，發現不同干細胞標志物CD133,SOX2,OCT4 和TWIST1表達水平在治療過程的不同階段有顯著的不同。評估這些干細胞基因的表達對預測治療過程的療效是有用的，而樣本相對容易獲得使這種方法簡便易行。Gerger等〔34〕通過DNA測序或聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性方法(PCR-RFLP)觀察了234例以5-氟尿嘧啶(FU)為基礎的化療病人血液標本中CCSCs基因的種系多態性，預測三期和高風險二期結腸癌病人的腫瘤復發時間,發現CD44 rs8193 C>T,ALCAM rs1157 G>A,LGR5 rs17109924 T>C 的小等位基因與腫瘤復發時間增加顯著相關,明確了CCSCs基因的常見種系變體可作為結腸癌病人3期和高風險2期的獨立預后標志物。Hu等〔35〕還發現伴糖尿病的結腸癌病人中晚期糖基化終產物受體(RAGE)及上游信號通路在維持CCSCs特性及致瘤性中具有重要作用，這項研究不但將結腸癌和糖尿病并發癥的發生聯系起來，而且也提供了腫瘤發生危險性評估和生物藥物治療的一種新途徑。

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〔2015-04-09修回〕

(編輯王一涵)

基金項目：安徽省自然科學研究重點項目(KJ2014A147)

通訊作者：孫國平(1961-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事腫瘤藥理及個體化治療研究。

〔中圖分類號〕R735.3

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2790-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.107

1北京大學人民醫院消化科

2安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤內科

第一作者：陳方軍(1973-)，男，在讀博士，副教授，主要從事腫瘤藥理及個體化治療研究。