線粒體DNA及相關基因與衰老的關系

莫　菲　管德龍　韓　燕　張　敏

(陜西師范大學生命科學學院，陜西　西安　710119)

線粒體DNA及相關基因與衰老的關系

莫菲管德龍韓燕張敏

(陜西師范大學生命科學學院，陜西西安710119)

〔關鍵詞〕線粒體DNA；多態性；衰老

線粒體是存在于絕大多數真核細胞內的一種基本功能細胞器，是細胞進行氧化磷酸化的場所。線粒體DNA(mtDNA)屬于真核細胞核外遺傳物質，結構簡單，位于線粒體基質中，有時與線粒體內膜結合存在。大多數多細胞生物的mtDNA都是以共價、閉合的環狀分子形式存在。不同物種的mtDNA大小懸殊，一般植物mtDNA較大，其分子大小范圍為186～2 400 kb；動物mtDNA較小，約為15.7～19.5 kb，其中人及大多數動物細胞的mtDNA約為16.5 kb〔1〕，昆蟲mtDNA大小一般為15.4～16.3 kb，并且以較高拷貝數存在于線粒體內〔2〕。mtDNA進化速率較核DNA(nDNA)快，遺傳過程不發生基因重組、倒位、易位等突變，且嚴格遵守母系遺傳方式，是相對獨立的遺傳系統〔3〕。mtDNA不僅是研究DNA結構與復制轉錄的良好模型，也是研究核酸與蛋白質結合非常合適的模型系統〔4〕。Anderson〔5〕用氯化銫密度梯度離心法首次分離得到mtDNA并進行全序列分析，此后mtDNA的研究日益得到研究者的重視，其中，有關mtDNA多態性的研究由于與機體衰老和種間親緣性等密切關系而成為研究熱點。

衰老是生物隨著時間的推移，自發的必然過程，它是復雜的自然現象，表現為結構和技能衰退，適應性和抵抗力的減弱〔6〕。衰老是多因素導致的，其中包括自由基致使細胞損傷導致的衰老、程序性細胞凋亡引起的衰老和mtDNA突變引發的衰老等。Kovalenko等〔7〕提出mtDNA突變在組織細胞衰老過程中起著重要作用，發現衰老的根本原因是由于mtDNA突變引起細胞凋亡，而不是自由基增多引起的細胞損傷所導致的。mtDNA突變主要有三種：①缺失突變：主要發生在D環區，往往造成線粒體功能下降；②點突變：主要發生在編碼蛋白質和轉運RNA(tRNA)區；③串聯重復：是指堿基序列的重復，其中mtDNA點突變和缺失突變發生頻率較高。但mtDNA突變的生物學意義目前不是十分清楚，推測可能是重復突變后，表達過多種類的蛋白質從而造成線粒體呼吸鏈組裝障礙而導致衰老甚至相關疾病發生〔8〕。最近有研究指出，mtDNA突變能開啟一種信號級聯放大過程，從而導致細胞程序性死亡，這一發現有助于揭示母系遺傳學的分子途徑〔9〕。本文通過對依賴性絲氨酸蛋白基因(LONP)1、DNA2和熱激蛋白(DNAJ)A3三個基因在線粒體中的信號通路及生化反應，從正向和負向兩個方面對機體衰老在分子方面進行全面闡述。

1mtDNA

mtDNA是細胞內較小而又易于純化的復制轉錄單位，基因組結構比較簡單，且具有很高的專一性。通過對mtDNA測序研究發現，絕大多數動物mtDNA的組成是相同，哺乳動物mtDNA的大小為16 kb左右，分為編碼區和非編碼區。其中編碼區包含2個核糖體RNA基因(rDNA)，22個tDNA基因和13個編碼蛋白質的基因。

1.1mtDNA結構組成

1.1.1編碼區線粒體rRNA基因的結構比核rRNA基因簡單得多，其分子結構域進化的平均速率受其功能制約。絕大多數的線粒體或核rRNA基因都存在一個規律性的三葉草形二級結構〔10〕，線粒體rRNA基因相對于蛋白質編碼基因而言，其進化速率要慢得多。除tRNA基因外，線粒體基因組基因序列非常保守，但在rRNA基因、tRNA基因及編碼蛋白質基因之間，由于其結構和功能上的不同，進化方式也存在較大差異〔11〕。

蛋白質編碼基因和RNA基因的主要差別是前者含有一個編碼氨基酸的開放閱讀框，由于蛋白質編碼密碼子的簡并性，這些蛋白質基因受到限制較少。13個蛋白質編碼基因分別為1個細胞色素b基因(Cytb)，2個三磷酸腺苷(ATP)酶亞基基因(ATPase6、ATPase8)，3個細胞色素C氧化酶亞基基因(COX1、COX2、COX3)，7個煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化還原酶亞基基因(ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6)〔12〕。在不同物種的種屬間相應的線粒體蛋白質編碼序列的比較顯示，CoⅢ、CoⅡ、CoⅠ和Cytb基因較保守且同源性較高，ATPase8、ATPase6和ND基因變異性較大。

1.1.2非編碼區非編碼區分為輕鏈復制起始區和控制區兩部分，mtDNA堿基對中有少數堿基對構成復制起始區的特有序列，這個序列有一個突出的D-loop(d placement-loop region)結構。D-loop為mtDNA的分子控制區，該區為A+T堿基富集，能被一些特異分子識別。同時D-loop也是整個線粒體基因組序列和長度變異最大的區域，其進化速度最快，基因排列緊湊，幾乎沒有間隔序列和內含子，便于進行種內種間的系統進化分析。非編碼區主要是在A+T富集區，mtDNA復制原點就在其中，可控制復制的起始和轉錄，因此也稱為控制區，其變異程度最大，可用于分析親緣關系較近的分類單元。研究〔13〕證明線粒體D-loop區具有較高多態性及與突變有關的敏感區域，其中相關基因的突變可導致多種腫瘤和疾病的發生。而在線粒體A+T富集區發生的核苷酸替換、轉換和顛換，被認為是由A+T富集區中片段的保守程度不同所造成的，且發現莖-環結構含一鏈合成的起點位置〔13〕。另外，在家蠶〔14〕、印第安白蟻〔15〕等其他較低等的物種中也有相類似的研究結果。

1.2mtDNA多態性研究方法mtDNA多態性可對生物體壽命進行一定影響，它是mtDNA在不同種群間或種群內表現出的變異現象，是由堿基的增加、缺失或置換造成。近些年，mtDNA多態性研究逐漸被人們所重視，研究發現mtDNA的多態性不僅是物種進化的關鍵〔16〕，而且也與物種壽命有極為密切的關系。目前普遍采用研究mtDNA多態性的方法有限制性片段多態性分析(RFLP)和測序法。

1.2.1測序法測序法是直接測定mtDNA的全序列或者片段序列，比較不同物種或個體間的相關序列，研究其起源。何芳等〔17〕采用聚合酶鏈式反應(PCR)方法對2條代表性成蟲線粒體基因組進行測序及序列拼接，得出線蟲線粒體基因組存在重復序列且兩條基因組大小存在很大差異，排列順序也各不相同。作為線粒體基因組遺傳多態性的研究方法，測序法雖能獲得大量可靠數據，但技術條件要求高、費用大，并不適合大群體遺傳進化的研究〔18〕。

1.2.2RFLPRFLP是利用限制性內切酶識別DNA分子的特異序列，并在特定序列處切開DNA分子，即產生限制性片段的特性。RFLP技術具有快速、經濟，精確度較高等特點，適用于大群體、大樣本種群壽命研究。在mtDNA多態性對壽命影響這一研究領域中，最為熱門的應當是人類壽命研究，通過對新疆百歲老人聚居地人口mtDNA研究顯示，百歲組和長壽組5178A等位基因和10398G等位基因頻率較為對照組明顯增加〔19〕，這就證明mtDNA多態性與壽命密切相關。mtDNA的進化也是多態性的一種表現形式，mtDNA進化的主要方式表現為DNA分子結構的改變，包括轉換和顛換兩種方式。大量研究〔20〕表明，mtDNA較快的進化速率主要由轉換造成，在種內比較中，轉換在數量上通常超過顛換10～20倍。在mtDNA所有基因和密碼子中發現，轉換數明顯超過顛換數，這種偏倚可能是決定mtDNA的進化速率的重要因素。同時，這種轉換偏倚似乎與序列間的差異存在一定相關性，即轉換偏倚的比率與物種從共同祖先進化的時間呈反比。堿基替換主要發生在基因控制區和間隔區，且不同區域基因的進化速度存在明顯差異〔21〕。mtDNA核苷酸序列的差異程度能反映物種內或種間親緣關系的遠近，常用于不同群體水平的遺傳分析。其中D-loop區是整個mtDNA基因組中堿基突變和長度變異最大的區域，其堿基替換率比mtDNA的其他區域高5～10倍〔22〕。

2mtDNA突變與衰老的關系

與衰老相關的理論有自由基學說、程序性衰老理論、體細胞突變學說及mtDNA突變引起的衰老。衰老主要包括功能損失和老化細胞衰老，功能損失是指對疾病的抵抗能力、平衡能力、生殖能力降低及機體的損傷老化等；而老化細胞衰老的定義更加廣泛，包括機體早衰和發育至成熟期。線粒體相關基因從不同方面對機體衰老進行的調控，進而影響機體在不同生長發育時段的各項技能。mtDNA和衰老相關基因多與mtDNA復制、修復和凋亡調控有關。

2.1LONP1基因LONP1基因表達翻譯的蛋白為ATP-依賴性絲氨酸蛋白酶，蛋白序列長度為959AA，屬于肽酶S16家族，存在于線粒體基質中。ATP-依賴性絲氨酸蛋白酶介導錯誤折疊的選擇性降解、未裝配或氧化性損傷的多肽及某些短期調控蛋白。同時LONP1基因還具有類似分子伴侶功能介導內膜蛋白復合物的裝配，并參與線粒體基因表達的調節和線粒體基因組的完整性維護。該基因可與線粒體基因組啟動子和RNA單鏈中的特異性位點結合，此后與單鏈DNA對應的特異性結合位點配對，靶向調節蛋白結合位點和mtDNA啟動子及其相鄰位置的衰老退化，并對mtDNA的復制和相關基因表達進行調控。在維護線粒體基因組結構完整性方面，其作用功能包括mtDNA自身及其姐妹染色單體的復制。在細胞水平，參與細胞合成和調控過程，其中包括對線粒體形態、分布、線粒體基因組的復制及新合成的mtDNA組裝等調控機制〔23〕。

2.2DNA2基因DNA2基因與LONP1基因在某些方面類似，也參與mtDNA與nDNA的復制過程。DNA2通過招募RecQ dna解螺旋BLM蛋白，介導5′-單鏈DNA的裂解，而3′-單鏈DNA斷裂可阻止復制蛋白(RP)A的形成，從而對DNA的復制過程造成影響。

此外，DNA2還參與DNA復制檢驗點對獨立岡崎片段的處理過程，且具有ATP酶和核酸內切酶的酶活性。DNA2具有5′-3′解旋酶活性，但因解旋酶活性較弱，在功能方面的研究仍不清楚。DNA的復制和修復是所有細胞的核心流程，這一過程需要核酸酶及解旋酶的參與以處理不同的DNA中間結構，從而維持基因組穩定性。而DNA2就屬于解旋酶/核酸酶家族，在DNA復制和修復過程中起功能調節作用。在酵母菌中，DNA2在nDNA復制過程中參與RNA引物的剔除，同時在紫外線傷害修復、基礎傷害修復及雙鏈沉默中都起到重要作用。數據表明，人類DNA2不定位于細胞核，因為它與酵母DNA2基因相比，缺少一個核定位序列(NLS)。人類DNA2遷移到線粒體時，與mtDNA聚合酶相互作用，這一相互作用對聚合酶活性的刺激十分顯著〔24〕。在線粒體DNA復制和“長補丁”堿基切除修復(LP-BER)中，DNA2可與皮瓣內切酶1發生協同作用。參與所有的重組過程，有助于維護適當的端粒長度。正常細胞隨著復制能力下降，其端粒長度會逐漸變短，端粒長度受到染色體端粒酶活力的調節，端粒酶以端粒RNA為模板合唱端粒序列而使端粒延長。端粒酶活性的高低直接影響端粒長度的增減，而端粒的長短直接影響細胞內基因的表達，進而影響到細胞的增殖和壽命。機體內的各類生化反應及各種反應通路都有可能導致DNA內部3′端脫氧核糖核苷酸鏈中的個別5′-磷酸二酯鍵遭到水解，造成DNA損傷〔25〕。

2.3DNAJA3基因DNAJA3基因參與調節線粒體基質內凋亡信號轉導及效應器結構，從而影響線粒體和半胱氨酸蛋白酶(caspase)3的活化，細胞色素C的釋放，但該基因不能活化蛋白酶8的活性。同種DNAJA1可增加凋亡的腫瘤壞死因子，即與DNA損傷劑四鏈霉素C結合，促進腫瘤細胞的凋亡。2型可抑制細胞凋亡，調節干擾素(IFN)-γ介導的轉錄活性；亞型2可能作為麝香信號通路的效應器而存在，作用于神經肌肉接頭處。DNAJA3所調控參與的細胞凋亡過程，可激活細胞周期阻滯，當細胞色素C從線粒體中被釋放，形成凋亡酶激活因子(APAF1)復合體，激活半胱氨酸內肽酶活性，進而促使細胞凋亡的發生。有研究〔26〕發現，DNAJA3可促使細胞通過細胞周期阻滯停止生長，進而出現細胞老化或凋亡的現象。除上述正向調節細胞凋亡的過程以外，DNAJA3還具備負向調控的功能〔26〕。該基因通過阻止或減少參與細胞凋亡過程中的半胱氨酸型內肽酶的活性，從而降低凋亡速率和程度或抑制、減緩細胞凋亡的進程。

3mtDNA突變與人類疾病的相關研究

mtDNA突變會導致某些蛋白功能的改變，從而影響生物的適應能力，利用生物信息學手段從分子角度研究mtDNA的突變將為后續一些與線粒體相關的疾病研究提供基礎材料〔27〕。人類mtDNA總長度為16 500堿基對，常見的DNA片段丟失為5 000堿基對、7 400堿基對及3 800堿基對〔28〕。動物實驗也證明了mtDNA隨著年齡的增長而逐漸丟失〔29〕。DNA的內源性氧化損傷可產生大量的8氧-7,8-二氫脫氧鳥苷(O8dG)，O8dG是mtDNA脫氧尿苷與氧自由基的加成產物，可作為mtDNA氧化損傷的鑒定指標，實驗證實，線粒體的異常突變可引起呼吸功能的衰退，心腦血管細胞的損傷；醫學方面研究發現老年性糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化及阿爾茨海默病等相關疾病均與mtDNA片段丟失有關〔30〕。

當mtDNA受到體內或外界造成的損傷時，會對線粒體氧化磷酸化功能造成不利影響，即可出現器官或組織功能異常，而較長時間異常功能狀態的積累，就會造成細胞和生物體的衰老，與此同時，生物體在發生衰老現象時，線粒體氧化磷酸化功能減退，呼吸鏈酶復合體活性在各種組織中都有所下降，從而產生過多的活性氧(ROS)，而ROS的大量堆積又會對mtDNA本身造成損傷，這就導致了衰老機體的惡性循環。電子傳遞鏈中產生的超氧陰離子基團通過各種生化反應生成過多的ROS，氧化應激可能引起電子傳遞鏈組分和mtDNA損傷，ROS可損傷血管內皮和平滑肌細胞，與動脈粥樣硬化相關。在生命過程中mtDNA損傷和突變逐漸積累，直接引起細胞氧化磷酸化活性降低，導致ROS產物增多，ROS產物增多又引起mtDNA損傷和突變率增高，形成氧化損傷增多和功能下降的惡性循環，并最終一起死亡〔31〕。由此認為，線粒體的氧化反應和mtDNA遺傳可能參與衰老和長壽的過程。

4結語

mtDNA的不穩定突變是衰老的重要因素之一。線粒體作為古老的細胞器廣泛存在于真核生物細胞中，由于其較高的進化速率，已被作為DNA標記廣泛應用于現代分子生物學研究。Osada等〔29〕提出線粒體與細胞核的互償進化模型，即表面看來 mtDNA快速進化且積累一定的有害突變，但是 mtDNA只是為nDNA提供可選擇的材料，mtDNA的有害部分會通過nDNA 的調控來減少其有害性，而一旦出現在選擇作用下具有適應性的基因，將會從 mtDNA轉移至nDNA，由此猜測mtDNA積累有害突變其實是生物適應性的更好體現。隨著分子生物學技術的不斷發展，應同時考慮線粒體編碼和核基因編碼的能量代謝相關基因在能量代謝適應性進化過程中的協調作用。利用基因水平研究為向導，從宏觀的角度去驗證基因與功能的關系將為探討線粒體功能與分子進化的相互作用關系提供一個更為全面的視角。

動物的能量代謝絕大部分發生在線粒體，生物運動能力的進化與線粒體的進化密切相關。利用線粒體基因組的比較從能量代謝角度研究生物進化是一種有效手段。利用基因水平研究，從宏觀角度去驗證基因與功能的關系將會是分子進化研究的新角度。在病理學方面，人們發現許多疾病的發生都與mtDNA變異有關。線粒體是細胞內ROS的主要來源，線粒體或mtDNA受到氧化損傷可能縮短壽命，所以，線粒體的變性、突變和破裂都是細胞衰老的重要原因之一。抑制mtDNA的缺失突變，可能是延長機體壽命的重要突破口。

5參考文獻

1Yan HC,Gao L.Recent developments in genetic model of mtDNA〔J〕.Biotechnology,2003;13(6):63-5.

2Yuzefovych LV,Musiyenko SI,Wilson GL,etal.Mitochondrial DNA damage and dysfunction,and oxidative stress are associated with endoplasmic reticulum stress,protein degradation and apoptosis in high fat diet-induced insulin resistance mice〔J〕.PLoS One,2013;8(1):54059.

3Nunes MD,Dolezal M,Schlotterer C.Extensive paternal mtDNA leakage in natural populations of drosophila melanogaster〔J〕.Mol Ecol,2013;22(8):2106-17.

4Yassin A,Da Lage JL,David JR,etal.Polyphyly of the Zaprionus genus group(Diptera:Drosophilidae)〔J〕.Mol Phylogenet Evol,2010;55(1):335-9.

5Anderson S.Shotgun DNA sequencing using cloned dnase I-generated fragments〔J〕.Nucleic Acids Res,1981;9(13):3015-27.

6Baumann K.Development:developmentally programmed senescence〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol,2014;15(1):4-14.

7Kovalenko SA,Kopsidas G,Kelso J,etal.Tissue-specific distribution of multiple mitochondrial DNA rearrangements during human aging〔J〕.Ann N Y Acad Sci,1998;854:171-81.

8Lin CS,Sharpley MS,Fan W,etal.Mouse mtDNA mutant model of leber hereditary optic neuropathy〔J〕.Proc Nat Acad Sci,2012;109(49):20065-70.

9Raimundo N,Song L,Shutt TE,etal.Mitochondrial stress engages E2F1 apoptotic signaling to cause deafness〔J〕.Cell,2012;148(4):716-26.

10Shao YJ,Hu XQ,Peng GD,etal.Structure and evolution of the mitochondrial genome of exorista sorbillans:the Tachinidae(Diptera:Calyptratae)perspective〔J〕.Mol Biol Rep,2012;39(12):11023-30.

11Bogenhagen DF.Mitochondrial DNA nucleoid structure〔J〕.Biochim Biophys Acta，2012；1819(9-10):914-20.

12Kolesar JE,Wang CY,Taguchi YV,etal.Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome〔J〕.Nucleic Acids Res,2013;41(4):e58.

13張淑萍，宋書娟，李雅軒.人類線粒體DNA突變與癌癥〔J〕.遺傳,2008;30(3):263-8.

14Dai LS,Zhu BJ,Liu QN,etal.Characterization of the complete mitochondrial genome of bombyx mori strain H9(Lepidoptera:Bombycidae)〔J〕.Gene,2013;519(2):326-34.

15Prabhakar CS,Mehta PK,Sood P,etal.Population genetic structure of the melon fly,Bactrocera cucurbitae(Coquillett)(Diptera:Tphritidae)based on mitochondrial cytochrome oxidase(COI)gene sequences〔J〕.Genetica,2012;140(1-3):83-91.

16Fang SM,Zhang L,Lu C.Study and aplication in origin and evolution of mitochondrial DNA in the silkmoths〔J〕.Chinese Bull Entomol,2010;47(3):439-45.

17何芳,姜愛蘭,李神斌,等.中華卵線蟲線粒體基因組多態性分析〔J〕.昆蟲學報,2009;52(10):1083-9.

18任凌雁,何燕,張婷,等.貴州三個少數民族群體線粒體 DNA 多態性研究〔J〕.中華醫學遺傳學雜志,2013;30(5):626-31.

19穆葉賽,尼加提.mtDNA 及 GNB3 基因多態性與新疆和田地區維吾爾族自然長壽的關聯研究〔D〕.烏魯木齊：新疆醫科大學,2008.

20O′Grady PM,Lapoint RT,Bonacum J,etal.Phylogenetic and ecological relationships of the hawaiian drosophila inferred by mitochondrial DNA analysis〔J〕.Mol Phylogenet Evol,2011;58(2):244-56.

21Aw WC,Correa CC,Clancy DJ,etal.Mitochondrial DNA variants in drosophila melanogaster are expressed at the level of the organismal phenotype〔J〕.Mitochondrion,2011;11(5):756-63.

22Maruyama S,Komuro T,Izawa H,etal.Analysis of human mitochondrial DNA polymorphisms in the Japanese population〔J〕.Biochem Genet,2013;51(1-2):33-70.

23Galluzzi L,Kepp O,Kroemer G.Mitochondria:master regulators of danger signalling〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol,2012;13(12):780-8.

24Kazak L,Reyes A,Holt IJ.Minimizing the damage:repair pathways keep mitochondrial DNA intact〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol,2012;13(10):659-71.

25Zheng L,Zhou M,Guo Z,etal.Human DNA2 is a mitochondrial nuclease/helicase for efficient processing of DNA replication and repair intermediates〔J〕.Mol Cell,2008;32(3):325-36.

26Elwi AN,Lee B,Meijndert HC,etal.Mitochondrial chaperone DnaJA3 induces Drp1-dependent mitochondrial fragmentation〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,2012;44(8):1366-76.

27Wallace DC.Mitochondrial DNA mutations in disease and aging〔J〕.Environ Mol Mutagen,2010;51(5):440-50.

28 張宗玉,童坦君.衰老機理的分子生物學研究進展〔J〕.科技導報,1996；(6):14-6.

29Osada N,Akashi H.Mitochondrial-nuclear interactions and accelerated compensatory evolution:evidence from the primate cytochrome coxidase complex〔J〕.Mol Biol Evol,2012;29(1):337-46.

30Dominic EA,Ramezani A,Anker SD,etal.Mitochondrial cytopathies and cardiovascular disease〔J〕.Heart,2014;100(8):611-8.

31Keogh M,Chinnery PF.Hereditary mtDNA heteroplasmy:a baseline for Aging〔J〕?Cell Metab,2013;18(4):463-4.

〔2015-04-01修回〕

(編輯苑云杰/王一涵)

基金項目：陜西省自然科學基礎研究計劃項目(2012JQ3012)；中央高校基本科研業務費專項資金資助(GK201002042)

通訊作者：張敏(1975-)，女，副教授，碩士生導師，主要從事發育遺傳學研究。

〔中圖分類號〕Q344

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2796-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.109

第一作者：莫菲(1990-)，女，在讀碩士，主要從事發育遺傳學研究。