絲狀真菌在纖維素酶合成過程中碳源代謝調控的研究進展

董妙音，王曙陽*，王雨辰，許富強，李文建，陳積紅，劉敬，胡偉

（1.中國科學院近代物理研究所，甘肅蘭州730000；2.中國科學院大學生命科學學院，北京100049；3.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070；4.甘肅微生物育種實驗室，甘肅武威733001；5.蘭州大學基礎醫學院，甘肅蘭州730000）

絲狀真菌在纖維素酶合成過程中碳源代謝調控的研究進展

董妙音1,2，王曙陽1,5*，王雨辰1,3，許富強1,2，李文建1,4，陳積紅1,4，劉敬1，胡偉1

（1.中國科學院近代物理研究所，甘肅蘭州730000；2.中國科學院大學生命科學學院，北京100049；3.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070；4.甘肅微生物育種實驗室，甘肅武威733001；5.蘭州大學基礎醫學院，甘肅蘭州730000）

絲狀真菌可以分泌大量纖維素酶并能有效地降解纖維素底物。在纖維素酶的合成過程中，碳源對產酶微生物有著不可替代的作用，然而對于微生物碳源響應及代謝調控有關的機理仍不是很清楚，從而制約了纖維素酶產業的發展。因此，本文綜述了絲狀真菌中轉錄調控因子對纖維素酶合成過程的影響，探討了真菌在纖維素酶表達過程中對碳源代謝的調控，包括對碳源的響應、碳源對產酶過程的誘導阻遏，并展望了纖維素酶的研究方向。

絲狀真菌；纖維素酶；碳源代謝；調控

纖維素是自然界中存在的最多的一類可再生生物質資源，全世界農作物秸稈年產量超過20億t，而其中將近20%以燒荒的形式燒掉，這不僅造成了嚴重的環境問題，對資源也是一種嚴重的浪費[1-2]。纖維素酶是降解纖維素最有效的生物催化酶，可以使纖維素分解生成葡萄糖的一組酶的總稱，在輕工業如造紙、食品、飼料、環保等領域的應用正日益廣泛。不僅能夠緩解能源危機，而且還可以保護環境，促進全球經濟的可持續發展。

分泌纖維素酶的微生物在自然界中分布廣泛，一般用于工業化生產的主要為絲狀真菌，包括曲霉屬（Aspergillus sp.）、木霉屬（Ttichodermasp.）、青霉屬（Penicillumsp.）等，真菌產纖維素酶的主要特點為酶系全、產量高，并能分泌到細胞外[3]。

碳源的作用對于產酶微生物來說不僅是作為重要的能量供應，還是生物體代謝的底物，其存在種類和數量對產酶過程而言是極其重要的。此外，碳源物質還在微生物的許多生理代謝過程中扮演著調節因子的角色，而且存在著比較復雜的碳源感應系統，在產纖維素酶的絲狀真菌中更是如此[4]。由于碳源的不同而誘導產生的纖維素酶的產量和種類之間也存在著很大的差異，許多產酶微生物對不同碳源響應的差異可能是在進化過程中對環境的適應所形成的[5]。

真菌纖維素酶合成的誘導調控是其菌株自身為更好地適應周圍環境、高效的獲取物質和能量而進行的一系列復雜有序的生理生化過程，其中所涉及的代謝層次和調控途徑復雜多樣，包括外界碳源信號的感應和傳遞、纖維素酶基因的轉錄調控、轉錄后水平修飾等[6]。為了提高纖維素酶的產量的對纖維素底物的降解活性，國內外科學工作者自20世紀60年代開始做了大量的纖維素酶的研究，對纖維素酶的生化性能、降解機制及轉錄調控因子鑒定等做了較為深入的系統研究。但是對于纖維素類誘導性碳源是如何誘導微生物合成大量的纖維素酶以及微生物是如何對外界環境中誘導性碳源進行感應的，其機制仍然不清楚。

本文綜述了國內外關于絲狀真菌在產纖維素酶過程中關于碳源代謝的轉錄水平上調控因子的調控，探討了真菌纖維素酶表達過程中碳源代謝調控的研究現狀，包括對外界環境中碳源的感應、碳源對產酶過程的誘導阻遏等，以期為纖維素酶生產的進一步深入研究、理性改造工業產酶菌株提供新的參考思路。

1　絲狀真菌纖維素酶在表達過程中對轉錄水平的調控

1.1調控因子對轉錄水平的調控

在真菌中，纖維素酶基因的轉錄調控方式復雜多樣，特別是在調控因子的作用下高效有序的完成纖維素酶基因的精確表達。

作為真核的產酶微生物，在纖維素降解酶基因中已經發現了幾類具有重要作用的調控元件，包括轉錄激活因子（XlnR、Xyr1、AceII等），碳源代謝抑制因子（AceI、CreA/Cre1等）。而研究較多的是轉錄激活因子XlnR，最初是在黑曲霉中分離得到的，其DNA結合序列為5'-GGCTAAA-3'，也是絲狀真菌中發現的可以同時調控木聚糖酶和纖維素酶基因的轉錄激活因子[7]。有學者在研究D-木糖對纖維素酶的誘導效應時發現，D-木糖首先引起XlnR的磷酸化[8]，然后進一步調控D-木糖對半纖維素酶的誘導表達。

作為轉錄激活因子XlnR的同源蛋白Xyr1，在瑞氏木霉中作為纖維素酶和半纖維素酶基因主要的轉錄調控因子之一，其缺失可以使所有的誘導物對纖維素酶和半纖維素酶的誘導表達喪失活性。Xyr1具有典型的鋅指類結構，它與啟動子上的靶序列GGC（T/A）3進行結合而行使功能[9]。AceII也是一個鋅指類結構的轉錄激活因子，能夠體外結合cbh1啟動子的GGCTAATAA序列[10]。Xyr1與AceII具有相同的結合位點，所以可以推測Ace2與Xyr1之間可能存在某種相互作用。CreA是絲狀真菌中普遍存在的介導碳源降解物阻遏的含C2H2鋅指結構的轉錄調控因子。CreA/Cre1基因的突變會使菌株喪失葡萄糖阻遏效應，實驗證實，在里氏木霉抗葡萄糖阻遏突變株Rut-C30中，Cre1基因基本丟失，只剩一些片段，但是當轉入全長Cre1時，葡萄糖對纖維素酶表達的阻遏效應又開始恢復[11]。

在大多數情況下，真菌內存在的這些調控因子一般都不是單獨進行調控，而是協同發揮作用，而且在進行調控時，這些調控因子本身都需要進行一些修飾，比如磷酸化、泛素化等而發揮作用。

2　絲狀真菌在纖維素酶表達過程中對碳源的代謝調控

絲狀真菌纖維素酶的誘導表達受碳源的嚴格調控，這不僅表現在不同碳源的誘導調控上，即使是同一碳源，對于不同種類的微生物，其調控和對碳源的感應機制也存在著很大區別。

2.1絲狀真菌對外界環境中碳源信號的響應

絲狀真菌對外界碳源的響應，是碳源代謝調控的第一步，也是基礎代謝非常重要的組成部分。合成纖維素降解酶的絲狀真菌只有在纖維素基質上生長時，才進行大量的纖維素酶合成并分泌到胞外。但是，這些微生物是如何感知外界纖維素碳源的存在，固體不溶性的纖維素分子是如何進入胞內來誘導纖維素酶基因表達的，其機理目前還有爭論。

目前人們普遍接收的觀點是由于基礎水平表達的纖維素酶對胞外的纖維素類物質進行初步地水解，生成具有誘導活性的寡糖小分子如纖維二糖，然后這些寡糖分子被一類膜轉運蛋白轉運至胞內從而誘導纖維素酶基因的高效表達，以進一步降解外界環境中的纖維素類底物[12]。這種最初的誘導性寡糖結合轉運蛋白Cdt1、Cdt2是在粗糙脈孢菌中分離鑒定得到的。Cdt1和Cdt2都屬于主要協助轉運蛋白超家族（major facilitator superfamily，MFS），具有典型的12個跨膜螺旋，且這兩個蛋白本身也具有較高的一致性[13]。ZNAMEROSKI E A等[14]在研究中對Cdt1和Cdt2進行了點突變，結果發現這種點突變能有效地減弱對纖維二糖的轉運活性，但是突變株對胞外纖維二糖的響應以及對纖維的水解活性卻沒有受太大影響，這說明轉運蛋白的轉運活性可能與信號傳導方式和產酶的水解能力沒有明顯的相關性。到目前為止，已經從其他菌株中也鑒定得到了這種寡糖轉運蛋白，如CdtC、CdtD、CdtG等，而且這些轉運蛋白的活性對纖維素酶基因的轉錄有著重要的作用[15]。ZHANG W X等[16]在里氏木霉中分離得到了一種具有纖維二糖轉運活性的轉運蛋白Stp1，發現Stp1是一個多功能的糖轉運蛋白，并且兼有葡萄糖和木糖轉運活性，緊接著對Stp1基因進行敲除，結果發現Stp1的缺失影響了菌株再以纖維二糖為碳源的生長狀況，同時也喪失了纖維二糖對纖維素酶的誘導作用。在整個碳源誘導過程中，這些纖維素等誘導物自身或其中間代謝產物代謝產物作為真正的誘導物與載體轉運蛋白結合并轉運至胞內，然后激活并傳遞纖維素酶表達信號，最終啟動纖維素酶基因的高效表達[17]。

2.2纖維素酶誘導型碳源的調控

纖維素降解酶是一類誘導型酶，所以在纖維素酶合成分泌過程中，存在一定的誘導性碳源對于纖維素酶的高效合成分泌是必需的，同樣，這種碳源的存在也是影響纖維素酶產量和其水解效率的主要因素之一，而且不同的誘導性碳源對纖維素酶的誘導表達作用是不同的。當外界環境中存在有纖維素類誘導性碳源時，這種碳源信號就會被產酶微生物所感應，進而使得細胞被這種信號所誘導而啟動纖維素酶基因的高效表達。

纖維二糖是纖維素降解最主要的可溶性產物，研究表明其對多種真菌纖維素降解酶基因的表達具有很強的誘導活性[18]。有學者研究表明在里氏木霉（Trichoderma reesei）的培養過程中當有較低濃度的纖維二糖存在時，其可以通過一個載體轉運蛋白被轉運進胞內誘導纖維素酶基因的表達，而且該載體轉運蛋白對纖維二糖的轉運活力要高于胞外β-葡萄糖苷酶對纖維二糖的降解活性[19]。這說明只有在低濃度的纖維二糖存在時，才能對纖維素酶基因的表達起誘導作用，因為濃度較高時，還受到胞外β-葡萄糖苷酶活性的影響。所以，纖維二糖對纖維素酶基因表達的調控作用取決于纖維二糖的轉運活性與水解速度的之間的平衡[20]。

此外，槐糖也是一種很重要的誘導碳源，可誘導里氏木霉纖維素酶基因的大量表達。槐糖被認為是將纖維素水解產物經過一些內切葡聚糖酶經過轉糖基作用而形成的產物[21-22]。但是，有研究發現，槐糖的這種碳源誘導效應對產酶菌株具有一定的特異性，如在黑曲霉（Aspergillus niger）中槐糖中并不能起誘導作用[23]，可能是由于黑曲霉（A.niger）較高的β-葡萄糖苷酶水解活性。但是在粗糙脈孢菌（N.crassa）即使將主要的β-葡萄糖苷酶基因進行敲除，槐糖仍然不能誘導纖維素酶基因的表達[24]。

在纖維素酶的誘導表達過程中，有些非纖維素來源的碳源也可以很好的誘導纖維素酶的高效表達，如乳糖。FANG X等[25]以乳糖作為誘導碳源進行產酶研究時，發現加入1%的乳糖后，纖維素酶表達能力大大提升。當微生物生長比較緩慢時，在培養基中添加半乳糖也可以誘導纖維素酶基因的表達[26]，添加乳糖對纖維素酶的誘導機制已經經歷了很長一段時間的研究，包括乳糖的代謝途徑、胞內乳糖的代謝組分析等，雖然發現了幾個可能與纖維素酶誘導相關的寡聚糖，但是仍然沒有清楚的揭示乳糖對纖維素酶的誘導機制[27]。

2.3纖維素酶碳源代謝阻遏的調控

每一種纖維素酶的合成分泌受其作用的碳源代謝終產物的調控，當碳源代謝的終產物累積達到一定的閾值時，細胞將會停止纖維素酶的繼續合成，而這種在纖維素酶合成過程中的碳源代謝終產物主要是葡萄糖[28]。葡萄糖作為公認的在纖維素酶基因表達過程中抑制性的碳源，細胞優先利用葡萄糖代謝產生的能量用于菌株的生長繁殖而非用于纖維素酶誘導產生途徑。ILMEN M等[29]研究發現當產酶微生物生長在非誘導性碳源的培養基上時，利用印記雜交（Northern blotting）雜交里氏木霉（T.reesei）的RNA，但是并沒有檢測出cbh1的信號存在，但是當葡萄糖耗盡時，在培養物中可以檢測到纖維素酶基因的表達。由此可見，在里氏木霉纖維素酶基因的表達過程中存在著復雜精細的碳源抑制調控機制。而大多數絲狀真菌纖維素酶合成過程中，這種碳源的優先代謝阻遏作用就是通過一種阻遏蛋白Crel來實現的[30]。除此之外，在絲狀真菌中還發現幾類參與碳代謝阻遏蛋白Crel的同源蛋白，并且在里氏木霉和曲霉（Aspergillus）中可調控許多纖維素和半纖維素酶基因表達[31]。

3　展望

進入21世紀，纖維素酶的研究將會有著巨大的市場潛力和工業前景，木質纖維素作為地球上儲量豐富的可再生資源，將其轉化為可發酵的糖類，進一步發酵生產乙醇等能源物質或者其他化學產品已成為全球研究的熱點。但目前的研究還存在很多難題，主要表現在關于纖維素酶的誘導物和誘導機理的研究仍然沒有得出確切的結論；發酵所用的菌株生產效率低；酶系統中各組分的比例不均衡；下游分離工作繁瑣，導致纖維素酶的生產成本提高等，這極大地影響了纖維素酶在工業化生產中的應用。

為更深入地研究絲狀真菌在纖維素酶誘導表達過程中對外界碳源的代謝調控機制，在將來的研究中，應該充分運用現代生物技術、分子生物學和基因工程等先進的科學技術，對纖維素酶誘導過程中所涉及的基因、調控因子及代謝通路進行系統深入的研究，對基因調控模式進行探索[32]，并逐步建立絲狀真菌在纖維素酶誘導合成過程中的調控模型，將有助于從分子水平上揭示絲狀真菌在產酶過程中對碳源代謝的調控機理，為進一步發展纖維素酶產業提供強有力的理論指導和技術支持。

了解碳源代謝調控機制，可以利用遺傳改造手段設計和改造產纖維素酶的高產菌株。此外，還能有效地控制誘導碳源，這不僅能夠提高纖維素酶的產量，而且還能增加纖維素酶對纖維素底物的水解效率，還可有效地減緩代謝終產物對纖維素酶生產過程中的阻遏，滿足纖維素酶在實際工業生產中的需求。隨著科技的進步以及人們對纖維素酶研究的深入，相信在不久的將來，纖維素酶的應用范圍會更加廣泛，對社會的可持續發展發揮重要的積極作用。

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Research process of filamentous fungi on carbon source metabolism regulations during cellulase synthesis

DONG Miaoyin1,2,WANG Shuyang1,5*,WANG Yuchen1,3,XU Fuqiang1,2,LI Wenjian1,4,CHEN Jihong1,4,LIU Jing1,HU Wei1
(1.Institute of Modern Physics,Chinese Academy of Science,Lanzhou 730000,China; 2.College of life Science,University of Chinese Academy of Science,Beijing 100049,China; 3.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 700070,China; 4.Gansu Engineering Laboratory of Radiation Induced Mutation Breeding,Wuwei 733001,China; 5.School of Basic Medical Sciences,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China)

Filamentous fungi can secrete a large number of cellulase and can effectively degrade cellulose substrates.In the process of the cellulase synthesis,carbon sources play an irreplaceable role on enzyme-producing microorganism.But the mechanism of microbial carbon source response and metabolism regulation still not clear,which restricts the development of cellulase industry.Therefore,the effects of transcriptional regulation factors in filamentous fungi on cellulase synthesis were summarized,the fungi on carbon source metabolic regulation(including the carbon sources response and the abduction and repression of carbon sources on enzyme production process)in the process of the cellulase expression was discussed, and the research fields of cellulase were prospected.

filamentous fungi;cellulase;carbon source metabolism;regulations

Q939.97

0254-5071（2016）10-0001-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.001

2016-05-23

國家自然科學基金項目（No.11305225）；中國科學院科技服務網絡計劃項目（KFJ-EW-STS-086）；西藏草業專項（Y106460XZO）

董妙音（1992-），男，碩士研究生，研究方向為微生物輻照育種。

王曙陽（1974-），女，副研究員，博士，研究方向為輻射生物學。