紫花苜蓿根腐新病原-厚垣鐮孢菌生物學特性研究

柏玉晶，張貞明，姚玉玲，薛 莉，張振粉，楊成德

(1.甘肅農業(yè)大學植物保護學院 ，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省草原技術推廣總站， 甘肅 蘭州 730010；3.甘肅農業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

紫花苜蓿根腐新病原-厚垣鐮孢菌生物學特性研究

柏玉晶1，張貞明2，姚玉玲1，薛 莉1，張振粉3，楊成德1

(1.甘肅農業(yè)大學植物保護學院 ，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省草原技術推廣總站， 甘肅 蘭州 730010；3.甘肅農業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

針對紫花苜蓿根腐致病菌厚垣鐮孢菌(Fusariumchlamydosporum)在不同溫度、光照、pH和多種碳氮源條件下的生物學特性，采用菌餅法進行了測定，并對不同碳氮源下菌落產色素情況進行了連續(xù)觀察。結果表明：該病原菌在5～40℃均可生長，最適溫度為25℃；當pH 4.0～12.0時均能生長，最適宜pH為7.0；全黑暗條件有利于菌絲生長，菌絲生長最適碳源、氮源分別為山梨醇和蛋白胨，碳源氯醛糖及除蛋白胨以外8種氮源均不利于菌絲的生長。含不同碳氮源培養(yǎng)基可誘導菌絲產生不同色素，且顏色變化差異大，在不同的生長階段，色素顏色也會發(fā)生變化。

苜蓿根腐病；厚垣鐮刀菌；生物特性；色素

紫花苜蓿(Medicagosativa)耐干旱貧瘠，再生性強，產草量高，粗蛋白含量高，素有牧草之王的稱號，是畜牧業(yè)首選青飼料，在世界各國廣泛種植。近幾年，隨著我國草地畜牧業(yè)的發(fā)展和農業(yè)產業(yè)結構的調整，苜蓿種植面積逐步擴大，已居世界第6位。但是由于我國苜蓿品種單一和利用年限的增長，尤其是苜蓿根腐病發(fā)生日趨嚴重，已嚴重威脅到苜蓿產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。據(jù)報道，苜蓿根腐病在美國、加拿大、澳大利亞、俄羅斯、日本和阿根廷等國家[2-7]及國內新疆、甘肅、青海和內蒙古等地嚴重發(fā)生[8-11]，全世界每年造成的產量損失在20%，嚴重發(fā)生的地塊達到40%[12]，使苜蓿固氮能力降低，植株衰弱，單產和品質下降。國內外先后報道的苜蓿根腐病病原菌中鐮孢菌達14種，國內報道有尖孢鐮孢(F.oxysporum)、銳頂鐮孢(F.acuminatum)、半裸鐮孢(F.semitectum)、茄鐮孢(F.solani)、串珠鐮孢(F.moniliforme)和擬枝孢鐮孢菌(F.sporotrichioide)[8,13-14]。從試驗前期研究發(fā)現(xiàn)，從甘肅省苜蓿根腐病樣分離獲得的厚垣鐮孢菌(F.chlamydosporum)經致病性測定發(fā)病率達75%，可引發(fā)苜蓿根腐病，據(jù)報道該病原菌還可引起多種植物病害[15-18]。因此，為了有效防控由病菌引起的苜蓿根腐病，試驗對厚垣鐮孢菌的生物學特性開展了研究，并對碳氮源利用能力及產色素情況進行觀察，以期為明確該病害的發(fā)生規(guī)律及防控措施的制定提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌種

供試菌株厚垣鐮刀菌由植物病理實驗室提供。

1.2 溫度對菌絲體生長的影響

菌株25℃恒溫培養(yǎng)5 d，用直徑5 mm的打孔器于菌落邊緣打取菌餅接于PDA平板中央，分別置于0～45℃(間隔5℃)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3次重復，第5 d用十字交叉法測量菌落直徑，利用SSPSS 19.0軟件和Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

1.3 光照對菌絲體生長的影響

設24 h/d連續(xù)光照、12 h光照12 h黑暗光暗交替和24 h/d全黑暗3個處理，將5 mm的菌餅接種于PDA平板中央，最適溫度下培養(yǎng)，3次重復，其他方法同1.2。

1.4 pH對菌絲體生長的影響

用0.1%的HCl和0.1%的NaOH將PDA培養(yǎng)基pH調節(jié)至4.0～12.0(間隔1.0)，最適溫度下培養(yǎng)，3次重復，其他方法同1.2。

1.5 碳、氮源對病原菌生長的影響

基礎培養(yǎng)基：KH2PO40.5 g、K2HPO40.6g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.1 g、CaCl20.1g、水1 000 mL和瓊脂12 g。

1.5.1 碳源對病原菌生長的影響 基礎培養(yǎng)基加入0.5%蛋白胨，再分別加入葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、氯醛糖、2%可溶淀粉9種碳源，配制含不同碳源的固體培養(yǎng)基，以無碳源為對照，最適溫度下培養(yǎng)，3次重復，其他方法同1.2，并拍照。

1.5.2 氮源對菌絲體生長的影響 基礎培養(yǎng)基加入葡萄糖(2%)，再分別加入天門冬酰胺、甘氨酸、L -酪氨酸、蛋白胨、尿素、KNO3、NH4NO3、NH4Cl、0.5%NH4H2PO49種氮源，配置含不同氮源的固體培養(yǎng)基，以不含氮源為對照，最適溫度下培養(yǎng)，3次重復，其他方法同1.2。

1.5.3 不同碳氮源培養(yǎng)對菌落產色素的影響 連續(xù)觀察不同碳氮源培養(yǎng)條件下菌落產色素情況及色素變化狀況。

2 結果與分析

2.1 溫度對菌絲體生長的影響

菌株在5～40℃均可生長，0～25℃菌絲生長速率隨溫度的升高顯著升高，30～40℃顯著下降(P<0.05)，其中，在25℃時菌落直徑可達8.03 cm，顯著高于其他溫度條件，為最適生長溫度；0℃和45℃菌絲不生長(圖1)。

圖1 溫度處理下病原菌菌絲的生長狀況Fig.1 Effect of tempreture on mycelium growth

2.2 光照對菌絲體生長的影響

全黑暗條件下菌絲生長最快，培養(yǎng)5 d菌落直徑可達7.07 cm，顯著高于全光照和光暗交替條件(P<0.05)，表明黑暗有利于菌絲生長，光照對病原菌菌絲的生長有一定的抑制作用(圖2)。

圖2 光照處理下病原菌菌絲的生長狀況Fig.2 Effect of illumination on mycelium growth

2.3 pH對菌絲體生長的影響

菌絲在pH 4.0～12.0均可生長，pH為7.0時菌絲生長最快，菌落直徑可達7.70 cm，在pH 6.0～9.0菌絲生長速率差異不顯著(圖3)。

圖3 pH處理下病原菌菌絲的生長狀況Fig.3 Effect of PH on mycelium growth

2.4 碳、氮源對病原菌生長的影響

2.4.1 碳源對菌絲體生長的影響 菌絲均生長較快，在第5 d時菌絲長滿培養(yǎng)皿，其中，以山梨醇為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長最快，菌落直徑達8.42 cm，其次為甘露醇和麥芽糖，菌落直徑分別為8.28和8.23 cm；D-木糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖培養(yǎng)基菌落直徑均明顯大于對照，但可溶性淀粉和氯醛糖對菌絲生長有抑制作用，其中氯醛糖顯著低于其他碳源，且菌絲稀薄，近透明；在含不同碳源培養(yǎng)基上菌落均為圓形，D-木糖、葡萄糖和蔗糖培養(yǎng)基菌落邊緣不整齊。試驗結果表明，山梨醇是F.Chlamydosporum生長的最佳碳源，氯醛糖對菌絲生長有明顯的抑制作用(表1)。

表1 碳氮源處理下菌絲的生長
Fig.1 Effect of C-source and N-source on the mycelial ofFusariumchlamydosporum

碳源菌落直徑/cm氮源菌落直徑/cm山梨醇8．42a蛋白胨7．82a甘露醇8．28abCK6．63b麥芽糖8．23b硝酸鉀6．28cD?木糖7．93c甘氨酸5．45d葡萄糖7．82cL?酪氨酸4．97e蔗糖7．67d天門冬氨酸4．87e乳糖7．6d硝酸銨4．37fCK7．27e尿素3．67g可溶性淀粉7．25e氯化銨2．5k氯醛糖2．58f磷酸二氫銨2．38k

2.4.2 氮源對菌絲體生長的影響 在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上，菌落直徑達7.82 cm，與對照差異顯著(P<0.05)，有顯著的促進作用，硝酸鉀、甘氨酸、L-酪氨酸、天門冬氨酸、硝酸銨、尿素、氯化銨和磷酸二氫氨均對該菌的生長有顯著抑制作用(P<0.05)，其中磷酸二氫氨對菌絲生長抑制能力最強(表1)。在含不同氮源培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，對照菌落圓形，菌絲白色、絨毛狀、稀疏；尿素培養(yǎng)基菌落圓形，氣生菌絲致密；蛋白胨、硝酸鉀、甘氨酸、L-酪氨酸和天門冬氨酸培養(yǎng)基菌落近圓形，邊緣不整齊，硝酸銨、氯化銨和磷酸二氫氨培養(yǎng)基菌落不規(guī)則。試驗結果表明，F(xiàn).Chlamydosporum生長的最佳氮源為蛋白胨這種有機氮，其次硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，且多數(shù)硝態(tài)氮和銨態(tài)氮都不利于該菌生長。

2.4.3 不同碳氮源培養(yǎng)對菌落產色素的影響 甘露醇、麥芽糖、D-木糖、葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉均可促使菌落產生橘黃至橘紅色色素，其中葡萄糖和蔗糖色素產量最大，隨著培養(yǎng)時間的增長培養(yǎng)基背面整體變?yōu)樽丶t色，菌絲也由白色變?yōu)榈丶t色，并產生大量棕紅色顆粒狀子實體；山梨醇培養(yǎng)基由淡紫紅色逐漸變?yōu)樽仙磷虾谏粚φ諢o色素產生(圖4)。

蛋白胨、甘氨酸、L-酪氨酸、天門冬氨酸和硝酸銨培養(yǎng)基均能產生橘黃色色素，隨著時間的增長色素顏色加深，直至培養(yǎng)基背面全部變色，其中相同時間段內蛋白胨產色素最多，由橘黃色變?yōu)殚偌t色；氯化銨和磷酸二氫銨雖然菌絲生長緩慢，但是培養(yǎng)基背面完全為橘紅色；硝酸鉀培養(yǎng)基產生黃綠色色素，后期培養(yǎng)基背面逐漸全部變?yōu)辄S綠色、綠色至黑綠色(圖5)。

試驗結果說明，含不同碳氮源培養(yǎng)基可誘導菌絲產生不同色素，且顏色變化差異大；在不同的生長階段，色素顏色亦會發(fā)生變化，因此，生產上可以根據(jù)需求，對不同階段的色素進行研究利用。

圖4 不同碳源培養(yǎng)下菌落產色素狀況Fig.4 The pigmeng production of Fusarium Chlamydosporum in different C-source注：a.山梨醇;b.甘露醇;c.麥芽糖;d.D-木糖;e.葡萄糖;f.蔗糖;g.乳糖;h.CK;i.可溶性淀粉;j.氯醛糖

3 討論

苜蓿根腐病是一種典型的土傳病害，病原種類較多，國內外先后報道的該病病原已達29種，但主要由鐮孢菌屬真菌引起。其病原菌對植物體的侵染一方面取決于其自身結構功能和產生的多種次生代謝產物對植株的影響，如真菌菌絲可穿透植物表皮細胞進入植物體，Rocha等從玉米上分離的輪枝鐮孢菌代謝產生的伏馬菌素、AAL毒素具有很強的毒性，能殺死植物細胞核；另一方面也決定于溫度、光照、pH等環(huán)境因素的變化，適宜的環(huán)境因素能促進真菌菌絲生長，菌核萌發(fā)，進而侵染植物體，使植株發(fā)病。因此，病原菌生物學特性的研究是掌握其發(fā)病規(guī)律的基礎，本試驗對不同溫度、光照、pH、碳、氮源下苜蓿根腐病病原菌-厚垣鐮刀菌菌絲的生長進行了研究，結果表明：該菌在溫度5～40℃和pH 4.0～12.0均可生長，在過酸過堿條件下菌絲體仍生長良好，菌絲發(fā)達而致密，說明厚垣鐮孢菌對環(huán)境有較強的適應性，可耐高溫和酸堿，因而只要條件適宜，其可在苜蓿的各個生育期進行侵染；在黑暗條件下菌絲生長最快，而土壤的不透光性正為其生長提供了有利條件。碳源為真菌生長提供了碳素，其氧化過程也為真菌基本生命活動提供了能源，該病原菌喜好山梨醇和甘露醇而較少利用多數(shù)真菌喜歡的葡萄糖、蔗糖等糖類，其可能是因為菌絲的生長受到了環(huán)境因素的誘導而產生了能分解醇類的酶，該酶在分解醇類過程中可釋放更多的能量供菌絲生長[17-18]。在氮源的利用上，該菌能更好的利用蛋白胨這種有機氮，對硝態(tài)氮的利用率低，極不喜好銨態(tài)氮，而銨是參與菌株生長代謝的直接底物，多數(shù)真菌優(yōu)先利用銨態(tài)氮作為氮素營養(yǎng)[19]，潘紅等[20]研究報道尖孢鐮刀菌對氮素的有效利用順序為：銨態(tài)氮>有機氮>硝態(tài)氮，因此，銨態(tài)氮為什么能制約厚垣鐮孢菌菌絲生長有待研究，有報道施氮40 kg/hm2苜蓿干草產量會顯著升高。

圖5 不同碳源培養(yǎng)下菌落產色素Fig.5 The pigmeng production of Fusarium Chlamydosporum in different N-source注：a.蛋白胨;b.CK;c.硝酸鉀;d.甘氨酸;e.L-酪氨酸;f.天門冬氨酸;g.硝酸銨;h.尿素;i.氯化銨;j.磷酸二氫銨

色素廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化妝品等多種工業(yè)領域[21]，近年來，隨著人民生活理念的轉變，人們開始注重色素的品質，天然色素的開發(fā)和應用有了較大發(fā)展。張銀[22]發(fā)現(xiàn)，絲狀真菌中存在大量可食用色素，王風琴等[23]從一株南極真菌中分離得到一種色素，并做了小鼠的毒力測定，確定該色素為可食用色素。真菌色素與其致病力和真菌耐藥性有密切關系，有增強致病真菌侵襲毒力和誘生真菌耐藥性的雙重作用，侯幼紅等[24]報道真菌色素與其菌株的生理代謝和致病性密切相關，是致病性真菌主要的致病毒力因子之一。

4 結論

(1)試驗明確了不同環(huán)境因素對菌絲的生長的影響，為苜蓿根腐病的準確預報和合理防治提供理論依據(jù)，但有關不同環(huán)境因素對厚垣鐮孢菌產孢的影響及苜蓿根腐病的田間防治方法等需在今后做進一步研究。

(2)對不同碳氮源條件下菌株的產色素情況進行了初步觀察，結果表明不同碳氮源和不同的培養(yǎng)時間均可促使該病原菌產生不同色素，但為確定不同色素是否與菌株生理代謝和致病性有關，是否能用于食品、醫(yī)藥等領域，還需對色素種類、產量、產生原因及功能等做進一步研究。

[1] 劉海波,玉永雄.紫花苜蓿根腐病研究進展[J].草原與草坪,2006(3):3-6.

[2] 袁慶華.我國苜蓿病害研究進展[J].植物保護,2007,33(1):6-10.

[3] 楊紅善,常根柱,周學輝,等.美國引進苜蓿品種半濕潤區(qū)栽培試驗[J].草業(yè)學報,2010,19(1):121-127.

[4] Uddin W,Knous T R.Fusarium species associated with crown rot of aifalfa in Nevada[J].Plant Dis,1991,75(1):51-55.

[5] Leath K T,Kendall W A.Fusarium root rot of forage species:Pathogenicity and host range[J].Phytopathology,1978,68:826-831.

[6] Stuteville D L,Erwin D C.Compendium of alfalfa disease (2nd edition)[M].APS Press,1991：43-44.

[7] 李敏權,柴兆祥,李金花,等.定西地區(qū)苜蓿根和根頸腐爛病病原研究[J].草地學報,2003,11(1):83-86.

[8] 嚴林,梅潔人.青海省紫花苜蓿病蟲種類及害蟲天敵的調查[J].植物保護,1994,11(4):14-18.

[9] 曹麗霞,趙存虎,白全江,等.內蒙古中部地區(qū)苜蓿根腐病病原研究[J].華北農學報,2008,23(5):105-107.

[10] 胡清泉.紫花苜蓿根腐病的發(fā)生現(xiàn)狀及防治措施[J].內蒙古草業(yè),2009,21(1):37-39.

[11] 潘龍其,張麗,楊成德,等.紫花苜蓿根腐病原菌-擬枝孢鐮刀菌的鑒定及其生物學特性研究[J].草業(yè)學報,2015,24(10):88-98.

[12] 孔祥輝,劉佳寧,張丕奇,等.東北地區(qū)木耳“白毛菌病”的病原菌[J].菌物學報,2011,30(4):551-555.

[13] 張麗,耿肖兵,王春玲,等.黑龍江省大豆鐮孢根腐病菌鑒定及致病力分析[J].植物保護,2014,40(3):165-168.

[14] Lazreg F,Lakhdar B,Belabid L,etal.First Report of Fusarium chlamydosporum Causing Damping-Off Disease on Aleppo Pine in Algeria[J].Plant Disease,2013,97(11):1506.

[15] Gupta Vijai Kumar,Misra Ashok Kumar.Fusarium chlamydosporum causing wilt disease of guava (PsidiumguajavaL.) in India[J].Archives of Phytopathology and Plant Protection,2012,45(20):2425-2428.

[16] de Oliveira Rocha L,Reis GM,da Silva V N,etal.Molecular characterization and fumonisin production by Fusarium verticillioides isolated from corn grains of different geographic origins in Brazil[J].Int J Food Microbiol,2011,145(1):9-21.

[17] Yamaki S.Property of sorbitol-6-phosphate dehydrogenase and its connection with sorbitol accumulation in apple[J].HortScience,1980,15:268-270.

[18] Bellaloui N,Brown P H,Dandekar A M.Manipulation of invivo sorbitol production alters boron uptake and transport in tobacco[J].Plant Physiol,1999,119:735-741.

[19] 邢來君,李明春.普通真菌學[M].北京:高等教育出版社,1999:100-101.

[20] 潘虹,關鳳芝,吳廣文,等.尖飽鐮刀菌亞麻專化型生物學特性研究[J].東北農業(yè)大學學報,2011,(42)7:50-56.

[21] 楊海濤,李志洲,紅汁乳菇色素穩(wěn)定性的研究[J].氨基酸和生物資源,2004,26(3):27-29.

[22] 張銀.絲狀真菌發(fā)酵生產食品色素的研究[J].中國調味品,2015,40(1):115-118.

[23] 王風琴,許兵,孫云飛.一株南極真菌的鑒定及其分泌色素性質分析[J].中國食品報,2013,13(3):189-195.

[24] 侯幼紅,呂江陵,黃瑛,等.真菌色素與真菌感染[J].中國真菌學雜志,2008,3(6):375-380.

Biological characteristics of Fusarium chlamydosporum, a new pathogen cause alfalfa root rot

BAI Yu-jing1，ZHANG Zhen-ming2,YAO Yu-ling1，XUE Li1，ZHANG Zhen-fen3,YANG Cheng-de1

(1.Collegeofplantprotection,GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070,China； 2.Gansugrasslandtechnicalextensionstation,Lanshou730010； 3.CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem，MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

This study used fungus cake method to determinate the biological characteristics ofFusariumchlamydosporumunder different condition in term of temperature,illumination,pH value,C-sources and N-sources,and observed the situation of pigment produced by mycelium in different C-sources and N-sources.The result showed that the pathogen can grow when the range of temperature from 5℃ to 40℃,and the optimum temperature was 25℃.It can grow when the range of pH were 4.0～12.0,and the optimum pH was 7.0.All dark condition promotes the mycelium growth.The optimum C- sources and N-sources were sorbitol and peptone,C-sources chloralose and other eight kinds of N-sources beside peptone all limited the mycelium's growth.Mycelium can produce different pigment in different C-sources and N-sources,and the change of pigment had great difference.At different growth stages,the color of the pigment was also changed.

alfalfa root rot；Fusariumchlamydosporum；biological characteristics；pigment

2016-01-11；

2016-04-11

甘肅省農牧廳項目；國家自然科學基金(314 60639)和甘肅省自然科學基金項目(145RJZA130)資助

柏玉晶(1989-),女,甘肅景泰人,在讀碩士研究生。 E-mail：1345491709@qq.com 楊成德為通訊作者。

S 435.4

A

1009-5500(2016)06-0049-06