3種熒光標記根瘤菌數量測定方法比較

李佳歡，鄧 波，漫 靜，張佳良，劉 靜，李東琴

(1.中國農業大學動物科技學院,北京 100193； 2.吉林農業大學動物科技學院，吉林 長春 130118)

3種熒光標記根瘤菌數量測定方法比較

李佳歡1，鄧 波1，漫 靜1，張佳良2，劉 靜1，李東琴1

(1.中國農業大學動物科技學院,北京 100193； 2.吉林農業大學動物科技學院，吉林 長春 130118)

試驗以綠色熒光蛋白標記的中華苜蓿根瘤菌菌株Sm1021為試驗材料，將平板涂布法、膜過濾法、流式細胞術3種微生物計數方法測得結果進行對比，以平板涂布法為基準，觀察膜過濾法與流式細胞術的準確性。結果表明:利用膜過濾法測定根瘤菌數量可獲得與平板涂布法相近的結果,但在操作層面上具有一定制約，且測定成本較高，只有在某些特定情況下具有應用優勢；流式細胞術測定的結果與平板涂布法所得結果間存在顯著的差異，但由于菌類的數量基數較大，可進行粗略的統計估算。此外，當菌液中菌量較大時，流式細胞術的準確性增加(P=0.495)。

熒光標記；平板涂布法；膜過濾法；流式細胞術；根瘤菌

豆科植物與根瘤菌共生形成的根瘤具有高效的固氮能力，所固定的氮素約占生物固氮總量的65%[1-2]。在發達國家，接種高效根瘤菌以提高豆科植物的產量已成為廣泛使用的農業措施[3]。但在田間條件下，人工接種的高效根瘤菌的占瘤率很低，并不能達到預期效果[4]。接種菌在植株根際的定殖是其與植株發生共生作用的前提。研究報道，根瘤菌在植株根系的定殖數量，尤其是在根尖的定殖數量對根瘤菌的競爭結瘤能力有顯著影響[5-7]。準確、快速測定根瘤菌的數量對于制定科學、合理的提高接種菌占瘤率的方法具有指導意義。

平板涂布法(spread plate method,SPM)是根瘤菌計數常用的方法[8-10]。其所需材料簡單、成本較低，但操作繁瑣,工作量大。顯微鏡直接鏡檢法(Direct microscope counting,DMC)利用顯微鏡直接對可染色微生物進行鏡檢計數，主要包括涂片法、瓊脂薄片法、膜過濾法。此方法操作簡單，試驗周期較短。其中，膜過濾法相比于其他兩種方法制樣均勻、制片簡單、無需培養，用于可被特異染色微生物的計數[7,11-12]，但準確性受細胞染色質量，環境因素影響較大，使用范圍受限。隨著分子生物學的發展，微生物標記手段逐漸成熟，熒光蛋白標記技術得以完善，如綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)等[13-14]。此類標記蛋白在適當波長的光的照射下便可發射熒光，能量消耗較小。利用熒光顯微鏡測定熒光標記的菌株的數量可減小鏡檢法的主觀判斷誤差及染色偏差。

流式細胞術是近年來新興的熱門技術，該技術基于流式細胞儀的應用可準確快速測定生物細胞大小、數量、活性狀態或其他精量指標如膜電勢、胞內鈣濃度等并進行細胞分選[15]，具有快速、準確、信息量大等優點。流式細胞儀的許多應用是基于內置光源對熒光物質的激發而設計。帶有熒光蛋白的微生物樣本不需進行任何染色處理便可被高效識別分選并計數。研究結果報道，流式細胞儀可準確計數<15 μm的細胞，如網織紅細胞、白細胞等[16-18]。但此類細胞體積較大，便于識別。對于細菌細胞來說，直徑小，數量多，利用流式細胞儀計數的準確性有待驗證。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒、培養基 綠色熒光蛋白標記的Sm1021菌株(GFP-Sm1021)由中國農業大學王濤教授實驗室饋贈。

根瘤菌培養基配方：YEM培養基[19]，甘露醇10 g，酵母浸粉0.4 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.5 g，1 000 mL水(固體培養基加15 g瓊脂)。

1.1.2 試驗儀器及分析軟件 Millipore直徑25 mm針頭式過濾器，Whatman孔徑0.25 μm，直徑25 mm微孔濾膜， 奧林巴斯熒光顯微鏡BX53，流式細胞儀BD FACS Calibur，流式細胞儀獲取分析軟件為cellquest pro，754型分光光度計，數據分析軟件為SPSS 18.0。

1.2 試驗方法

在抗性平板上取GFP-Sm1021菌落接種YEM液體培養基，28℃，180 r/min振蕩培養48 h為種子液。取500 μL種子液接種至含50 mL YEM液體培養基的150 mL錐形瓶中，18個重復。28℃，180 r/min振蕩培養，每4 h取樣1次，每次取出1瓶菌液，利用分光光度計在600 nm波長下測定吸光度，繪制GFP-Sm1021吸光度曲線。用平板涂布法、膜過濾法、流式細胞術3種方法測定每個時期樣品所含根瘤菌數量，繪制GFP-Sm1021數量曲線。

平板涂布法參考文獻[20]方法進行，在395 nm波長簡易紫外燈下計發光菌落數量。

膜過濾法參考文獻[12]，取1 mL適當稀釋度的菌液利用可換膜針頭式濾器進行過濾，無菌水沖洗針筒內壁。用鑷子小心取出濕潤的濾膜平鋪于載玻片上，有菌面朝上。在濾膜中央滴加1滴香柏油，蓋上蓋玻片。在蓋玻片上滴加一滴香柏油，放在熒光顯微鏡下，100倍油鏡下鏡檢。隨機抽取10個視野進行熒光根瘤菌計數。注意控制菌液濃度，使每個視野內的菌的數量介于20～70。根據公式計算1 mL菌液所含根瘤菌數量。

式中：N為1mL樣本菌液所含根瘤菌數量，d為濾膜直徑，F為顯微鏡視場數，M為顯微鏡物鏡放大倍數，n為視野內看到的根瘤菌細胞數量的平均值,k為所取菌液的稀釋倍數。

流式細胞術測定：采用熒光標記后的根瘤菌為試驗樣品，省去熒光標記過程。將菌液調節至合適濃度，盡量保證測定過程中流式細胞儀計數小于500個/管，以提高測定精確度。

調節后的樣品放入流式管中待測。流式細胞儀的使用方法參照BDFACSCalibur使用說明進行。

2 結果與分析

2.1 GFP-Sm1021的吸光度曲線

利用YEM液體培養基培養GFP-Sm1021，其在600 nm波長處的吸光度曲線呈“S”形，0～12 h吸光度增加緩慢，12 h后開始進入對數生長期，吸光度快速增加，40 h后吸光度增加速率減慢(圖1)。由于菌液濃度與其吸光度在一定范圍內呈現正相關關系，可根據吸光度值大致估計菌液中的根瘤菌數量。

圖1 GFP-Sm1021 吸光度曲線Fig.1 Absorbance curve of GFP-Sm1021

2.2 GFP-Sm1021數量測定結果

利用平板涂布法測定根瘤菌數量，所得數量曲線如圖2所示。由根瘤菌的吸光度曲線分析，在12～40 h，菌液中根瘤菌的吸光度處于對數期增長期，但通過測定根瘤菌的數量曲線可知，在20 h之后，根瘤菌菌液中的活菌增加量減少。由此，在根瘤菌生長的對數后期，由于空間、營養等因素的限制，根瘤菌的死亡量增大，總體活菌數量基本維持在穩定值。

圖2 GFP-Sm1021 數量曲線Fig.2 Dynamic of the number of GFP-Sm1021

利用吸光度值可大致估計對數生長前期菌液中的根瘤菌數量，但此法并不能估算對數生長后期的活菌數量，因為對數生長后期死亡根瘤菌的數量逐漸增加多，影響菌液吸光度與活菌數量間的相關性。 目前，常用的微生物數量的測定方法為平板涂布法，試驗將膜過濾法、流式細胞術測定結果與之進行對比(圖2)，并對平板涂布法與濾膜法、流式細胞術所測得的數據進行配對樣本T檢驗，觀察平板涂布法與膜過濾法、流式細胞術測得的數據間差異顯著性(表1)。

表1 3種方法測得數據間差異顯著性分析

分析可知，利用微孔濾膜截留樣品中的微生物，在熒光顯微鏡下直接鏡檢，測定熒光根瘤菌的數量與平板計數法間沒有顯著性差異，數量曲線基本重合，數值差異大多不超過平板涂布法的3%。膜過濾法可用來代替平板涂布法，進行快速的根瘤菌數量測定。但此方法僅限于可熒光染色或已進行熒光標記的菌種，有一定的局限性。此外，大量重復是膜過濾法進行的前提，以保證數據準確性。

利用流式細胞儀的分選功能，可測定并計算菌液中的菌量。在菌體熒光標記的基礎上，流式細胞儀的內置光源可激發熒光，捕捉樣品中的發光體。然而，流式細胞術在根瘤菌計數上的準確性鮮有報道。試驗利用流式細胞儀測得的數據與平板涂布法測得的數據進行比較，發現二者測得結果間存在顯著差異，尤其是在菌液濃度較低時，流式細胞術測得結果甚至可達平板涂布法的6倍以上。但在培養20 h后菌液中活菌數量增大，流式細胞術的準確性增加(P=0.495)，二者間的差值大多不超過平板涂布法測得數量的20%。

3 討論

20世紀60年代，Shimomura 等從從維多利亞多管水母中首次分離純化出生物發光蛋白質，得到綠色熒光蛋白(GFP)，并在2008年因此獲得諾貝爾化學獎。隨后，綠色熒光蛋白廣泛應用于多種細菌、真菌、植物和哺乳動物細胞的研究[21-22]。GFP是由238個氨基酸殘基組成的酸性單體球狀蛋白，能夠抵抗高溫及性劑，分子量為27～30 kD，可在長波紫外光的照射下發射綠光。因其靈敏、穩定、無毒害、光譜等優點常用作標記物[23-24]，在根瘤菌標記上的應用也較為普遍。

雖然膜過濾法已常用于微生物數量的檢測，尤其是水體中大腸桿菌的測定[25]，但筆者在試驗過程中發現膜過濾法雖可在短時間內測定微生物的數量，但并不像部分文獻中提到的簡單易行，存在一定的局限性。①國產微孔濾膜與可換膜過濾器的質量標準尚不能滿足此項測定，只能選用進口濾膜及濾器，造成了此方法的成本提高；②為保證計數方便和測定結果的準確性，要保證視野內細胞數量在一定的數量范圍內，不能過多或過少，這就意味著對于未知濃度的樣本來說，需進行多次預實驗確定合適的稀釋度，增加工作量與試驗成本；③由于濾膜在負壓過濾過程中會被壓出輕微褶皺，而且在鏡檢的過程中需在濾膜的中央滴加香柏油以排除蓋玻片與濾膜間的空氣，導致微生物細胞向凹陷處的移動，干擾試驗結果。基于以上原因，只有在某些特定條件下，如快速測定樣品，樣品中有兩種以上熒光標記(便于一次性同時測出)，樣品中雜菌過多等，膜過濾法才具有明顯優勢，否則應采用平板涂布法。

隨著流式細胞儀的普及，利用流式細胞術進行細胞的分選、計數已逐步應用于微生物領域。許多試驗結果表明，流式細胞術在進行水體微型浮游植物[26]、酵母菌[27]、細菌[28-29]計數，檢測DNA含量和細胞的倍性水平[30-31]、觀測細胞凋亡[32]時均表現出較高的準確性。但在此次試驗中，利用流式細胞儀測定熒光標記根瘤菌的數量時，并未獲得十分準確的結果。原因有幾點：①根瘤菌體積較小，儀器不能精確識別；②部分前人試驗僅選取了幾個樣本，樣本量過少或樣本間的菌量差異過小，不足以代表流式細胞術計數的準確性。同時反映出應用流式細胞儀進行細菌計數時，當菌量處于某一數量級時才可達準確水平。本試驗中，流式細胞儀測得的培養20 h后的樣品菌量與稀釋平板法相近(P=0.495)也可支持這一結論。此外，雖然在樣品中根瘤菌數量較少時利用流式細胞儀測定根瘤菌數量得出的結果與稀釋平板法得出的結果間存在顯著差異，但由于菌類數量的數量級較高，測定的數據間差距并未達到一個數量級以上，對于某些雜菌多，不適于平板培養的樣品，可利用流式細胞儀進行粗略、快速地估計，從而提高工作效率。

4 結論

膜過濾法可快速測定樣品中熒光根瘤菌數量，操作過程不需嚴格無菌條件。但此方法成本昂貴，不易操作，僅在快速測定數據、樣品中熒光標記種類較多或雜菌干擾時具有使用優勢。流式細胞術測得的熒光根瘤菌的數量并不精確，但由于菌類數量的基數較大，可用來粗略估測樣品中熒光根瘤菌數量。

[1] 陳文新,汪恩濤,陳文峰.根瘤菌-豆科植物共生多樣性與地理環境的關系[J].中國農業科學,2004(1):81-86.

[2] 史曉霞,師尚禮,楊晶,等.豆科植物根瘤菌分類研究進展[J].草原與草坪,2006(1):12-17.

[3] Vlassak K M,P J V,Graham P H.Factors Influencing Nodule Occupancy by Inoculant Rhizobia[J].Critical Reviews in Plant Sciences,1997,16(02):163-229.

[4] Duodu S,Brophy C,Connolly J,etal.Competitiveness of a native Rhizobium leguminosarum biovar trifolii strain for nodule occupancy is manifested during infection[J].Plant and Soil,2009,318:117-126.

[5] J Brockwell,RR Gault,LJ Morthorpe,etal.Effects of soil nitrogen status and rate of inoculation on the establishment of populations of Bradyrhizobium japonicum and on the nodulation of soybeans[J].Australian Journal of Agricultural and Resource Economics,1989(40):753-762.

[6] R R Young,J Brockwell.Influence of soil pH on the development of symbiosis in field-grown acid-sensitive and acid-tolerant annual medics.Australian Journal of Experimental Agriculture[J].1992(32):167-173.

[7] McDermott T R,Graham P H.Bradyrhizobium japonicum Inoculant Mobility,Nodule Occupancy,and Acetylene Reduction in the Soybean Root System[J].1989,55(10):2493-2498.

[8] Lopez-Garcia S L,Vazquez T E,Favelukes G,etal.Rhizobial position as a main determinant in the problem of competition for nodulation in soybean.Environmental microbiology[J].2002,4(4):216-224.

[9] 張曉霞,王平,馮新梅,等.外源基因標記的紫云英根瘤菌在水稻根部的定殖研究[J].生態學報,2003(4):771-776.

[10] 王浩,繩志雅,隋新華,等.用gfp基因標記法研究大豆根瘤菌在大豆根部定殖結瘤情況[J].微生物學雜志,2006(2):1-4.

[11] 晏榮軍,尹平河,林小濤.熒光顯微鏡細菌計數方法研究[J].海洋技術,2005(1):64-66.

[12] 趙海萍,李清雪,陶建華.海洋細菌熒光顯微計數法及其應用[J].河北工程大學學報(自然科學版),2007,24(1):57-60.

[13] 陳力玉.基于三親本雜交的熒光標記根瘤菌的構建及其穩定性檢測研究[D].蘭州：甘肅農業大學,2013.

[14] 陳力玉,張淑卿,李劍峰,等.接種熒光標記根瘤菌對苜蓿幼苗生長的影響[J].草原與草坪,2013(6):1-8.

[15] 謝小梅.流式細胞術[J].中國生物工程雜志,2003,23(9):100-103

[16] 鄒德學,吳志成,盧麗華.采用流式細胞術對白細胞分類計數的評估[J].檢驗醫學,2009(8):606-610.

[17] 李勝男,王秀娟,周建,等.利用流式細胞儀計數微型浮游生物的方法[J].湖泊科學,2015(5):757-766.

[18] 曹永獻,姚遠,張飚,等.流式細胞儀計數網織紅細胞方法評價[J].檢驗醫學,2004(3):200-202.

[19] Anolles C C,Favelukes G.Quantitation of Adsorption of Rhizobia in Low Numbers to Small Legume Roots[J].Applied and Environmental Microbiology,1986,52:371-376.

[20] 吳金水,林啟美,黃巧云,等.土壤微生物生物量測定方法及其應用[M].北京:氣象出版社,2006：3-5.

[21] 鄧超,黃大昉,宋福平.綠色熒光蛋白及其應用[J].中國生物工程雜志,2011,31(1):96-102.

[22] Chalfie M,Tu Y,Euskirchen G,etal.Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene-Expression[J].Science,1994,263:802-804.

[23] 王洪偉.綠色熒光蛋白標記的豌豆根瘤菌的獲得與功能分析[D].重慶：西南大學,2009.

[24] 吳沛橋,巴曉革,胡海,等.綠色熒光蛋白GFP的研究進展及應用[J].生物醫學工程研究,2009(1):83-86.

[25] 郝江燕,胡文忠,馮敘橋,等.食品中大腸桿菌生物檢測方法的研究進展[J].食品工業科技,2013(15):370-375.

[26] 徐兆安,高怡,吳東浩,等.應用流式細胞儀監測太湖藻類初探[J].中國環境監測,2012(4):69-73.

[27] 朱永澤.流式細胞術快速檢測假絲酵母菌藥物敏感性方法的建立及應[D].杭州：浙江大學,2014.

[28] 王寧,劉寧.流式細胞術快速檢測生乳中細菌總數[J].食品工業科技,2007(9):197-200.

[29] 劉曉露.利用流式細胞儀對飲用水中細菌的快速檢測[D].北京：北京林業大學,2014.

[30] 田新民,周香艷,弓娜.流式細胞術在植物學研究中的應用——檢測植物核DNA含量和倍性水平[J].中國農學通報,2011(9):21-27.

[31] 柳青慕,王赟文,王小山.流式細胞儀快速檢測鴨茅與多花黑麥草染色體倍性的研究[J].草業科學,2012(3):403-410.

[32] 娜仁圖娜拉,閆雷,趙瑞杰,等.流式細胞術及其在細胞凋亡檢測中的應用[J].中國組織工程研究與臨床康復,2009(27):5353-5356.

Accuracy comparison of three methods on fluorescence labelled rhizobia counting

LI Jia-huan1，DENG Bo1，MAN Jing1，ZHANG Jia-liang2，LIU Jing1，LI Dong-qin1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing,100193,China；2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JiLinAgriculturalUniversity,ChangChun130118,Chian)

Rhizobia strain Sm1021 marked with GFP (GFP-Sm1021) was used as an experimental strain to compare the counting accuracy of spread plate method(SPM),membrane filter method(MFM) and flow cytometry method (FCM).The results showed that the number of rhizobia counted by MFM was similar to SPM,however,MFM had some technical restrictiveness and higher experimental cost.There was a significant difference on the counted number between FCM and SPM,however,FCM can be used as a rough counting method because of the larger population of rhizobia.In addition,the accuracy of flow cytometry was better when the number of rhizobia was increased.

fluorescent mark；spread plate method；direct microscope counting；flow cytometry；rhizobia

2016-05-27；

2016-09-29

國家牧草產業技術體系(CARS-35)

李佳歡(1992-)，女，內蒙古通遼人，碩士研究生。 E-mail：410243571@qq.com 鄧波為通訊作者。

S 182；S 541

A

1009-5500(2016)06-0055-05