石刁柏雄性偏向核質體DNA的克隆與分析

李書粉，李 旭，王冰肖，袁金紅，鄧傳良，高武軍

(河南師范大學 生命科學學院, 河南新鄉 453007)

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石刁柏雄性偏向核質體DNA的克隆與分析

李書粉，李 旭，王冰肖，袁金紅，鄧傳良，高武軍*

(河南師范大學 生命科學學院, 河南新鄉 453007)

該研究以雌雄異株植物石刁柏為材料，利用基因組消減雜交技術對石刁柏雌雄核基因組中的性別差異核質體DNA(nuclear plastid DNA，NUPTs)進行了分離和分析。結果表明：(1)通過構建消減雜交文庫共獲得了52個雄性偏向序列，序列長度分布在63～297 bp之間，其中有19個差異序列屬于葉綠體來源序列(命名為Ao1～Ao19)，且這些序列與石刁柏葉綠體基因組的相似性均大于84%，Ao19與石刁柏葉綠體基因組相似性為100%。(2)利用基因組半定量PCR對19個NUPTs序列的性別差異分析表明，有4條序列為穩定的雄性偏向NUPTs序列，分別為Ao1、Ao3、Ao10和Ao18。(3)序列比對表明，轉移到核基因組的NUPTs主要來源于葉綠體基因組的反向重復區(包含IRa和IRb區)，說明石刁柏葉綠體基因組重復區序列更容易向核基因組進行轉移形成雄性偏向的NUPTs序列。

石刁柏；性別差異；核質體DNA；雄性偏向

Cloning and Analysis of Male-biased Nuclear Integrants

植物細胞中存在細胞器基因組和細胞核基因組，細胞器DNA能夠轉移進入細胞核從而形成核質體DNA(nuclear integrants of plastid DNA，NUPTs)和核線粒體DNA(nuclear integrants of mitochondria DNA，NUMTs)[1]。其中，NUPTs主要是葉綠體起源的DNA轉移到細胞核并整合到核基因組中形成的[2]。目前，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[3]、水稻(Oryzasativa)[4]、煙草(Nicotianatabacum)[5-6]等多個植物基因組中均發現存在NUPTs序列。核質體DNA的插入是真核生物基因組進化的重要動力[7]。一些研究表明，葉綠體來源的大片段DNA序列的插入會通過逐步衰減[8-9]或擴增來影響染色體的結構及演化過程[10]。

被子植物性染色體相對于哺乳動物來說在進化上較為年輕，因此是研究性染色體起源和演化的重要模式材料。研究表明，NUPTs的插入也可能參與了植物性染色體的演化過程。對雌雄異株植物酸模(Rumexacetosa)和白麥瓶草(Silenelatifolia)葉綠體基因組序列進行染色體定位發現，在這2個物種中核基因組中的葉綠體DNA主要累積在Y染色體上，甚至在酸模整條Y染色體上都散布有NUPTs序列[11]，而白麥瓶草Y染色體上的NUPTs主要分布于著絲粒位置[11]。這些有限的證據表明，NUPTs在Y染色體上并非隨機分布，尤其是在白麥瓶草Y染色體上NUPTs分布于不易發生重復的著絲粒及其側翼區域，說明NUPTs可能參與了XY性染色體之間重組抑制的形成。但是，目前由于該方面研究結果較少，且僅限于少數模式材料，因此NUPTs和植物性染色體之間的關系仍需要進一步研究。

石刁柏是一種重要的多年生雌雄異株草本植物，具有2n=2x=20條染色體，其性染色體X和Y同型[12]，表明其性染色體仍處于進化的早期階段，是研究性染色體起源較為理想的材料之一。但是，石刁柏性染色體上是否存在NUPTs序列，其分布特征如何等仍未見報道。因此，本研究采用雌雄基因組消減雜交方法，分離分析石刁柏核基因組中的性別差異NUPTs序列，為進一步分析NUPTs與石刁柏性染色體起源和演化的關系提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

石刁柏(Asparagusofficinalis)品種“UC309”種植于河南師范大學生命科學學院實驗基地，植株性別通過花器官鑒定。

1.2 方 法

1.2.1 石刁柏DNA提取及檢測 石刁柏DNA用CTAB法進行提取，具體實驗步驟參照文獻[10]。

1.2.2 石刁柏雌雄基因組消減雜交 基因組消減雜交是通過驅趕DNA(driver)和檢測DNA(tester)基因組之間的差異來分離不同基因型間差異序列的方法。在此，以過量的石刁柏雌性基因組DNA作為driver，適量的雄性基因組DNA作為tester，通過消減雜交以獲得石刁柏雄性特異或偏向序列。具體步驟參照文獻[13]進行。取25 μg雄株基因組DNA，加入MboI (10 U/μL) 2.5 μL，在金屬浴37 ℃條件下處理9 h進行酶切，酶切后用純化試劑盒進行回收。將酶切產物和125 μg雌性DNA(在沸水浴中放置60 min進行破碎)混合煮沸15 min變性。反應物室溫下混合振動(100 r/min)復性72 h。將產物用氯仿抽提2次，乙醇沉淀。

將3×10-8μmol去磷酸化處理后的載體PUC119和3×10-7μmol消減產物進行連接轉化。轉化操作根據文獻[14]進行。挑取陽性克隆進行菌落PCR鑒定，篩選插入片段為120 bp以上單克隆進行測序分析。

1.2.3 雌雄性別差異序列的斑點雜交 取1.5 μL菌落PCR擴增產物，分別以雌雄基因組DNA為探針，根據文獻[15]方法進行斑點雜交。探針的標記按照Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2.0(Takara，大連，中國)和DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit試劑盒(Roche，Switzerland)說明書進行。根據斑點雜交結果，篩選出雌雄信號差異顯著的單克隆進行測序。

1.2.4 NUPTs的鑒定及雌雄差異性驗證 將測序得到的差異序列，用Blast進行同源搜索，篩選出與葉綠體基因組有關的序列。采用Primer 6設計引物(表1)，分別以石刁柏雌雄基因組為模板進行PCR擴增，驗證其性別差異性。

表1 引物序列匯總表

根據所得序列設計引物進行基因組半定量分析，每對引物用3個雌性DNA模板和3個雄性DNA模板，以18S為內參。擴增總體系25 μL，分別加入模板DNA(質量濃度30 ng/μL)1.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 1.5 μL，引物(10 μmol/L)各0.5 μL，Taq酶0.1 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，不同退火溫度下1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 性別差異序列的基因組拷貝數分析 利用本實驗室對石刁柏基因組測序數據[16]，運用bowtie2軟件[17]對所得雄性偏向NUPTs進行拷貝數估計。

1.2.6 性別差異NUPTs序列的葉綠體基因組定位 采用DNAMAN軟件對性別差異NUPTs序列和石刁柏葉綠體基因組進行序列比對，以確定這些性別差異NUPTs序列在石刁柏葉綠體基因組的定位，也即來源于葉綠體基因組的具體區域。

2 結果與分析

2.1 石刁柏雌雄株基因組DNA酶切及破碎

石刁柏雄性基因組DNA在100 μL體系下，經過MboI酶切9 h，電泳結果表明，酶切產物呈現均勻彌散狀(圖1，A)。說明酶切效果良好，可以用做Tester DNA。雌性基因組DNA經沸水浴處理 60 min，電泳結果顯示，DNA破碎片段呈連續彌散，片段大小在250～1 000 bp之間，主亮帶集中在500 bp左右(圖1，B)，達到用做driver DNA的要求。

2.2 雌雄基因組DNA消減文庫克隆及篩選

處理后的雄性DNA與雌性DNA消減雜交后，將消減雜交液與酶切純化處理后的pUC119載體連接，轉入大腸桿菌E.coliDH5α感受態細胞中，涂在含有氨芐青霉素的LB培養基平板上篩選后，共獲得6 600個陽性克隆。用通用引物M13進行PCR擴增，獲得2 600個片段長度在120 bp及以上的單一克隆，片段大小在100～450 bp之間(圖2)。

2.3 陽性克隆的斑點雜交

為了進一步驗證所獲得陽性克隆的性別特異性，將452個重組單克隆菌液PCR擴增產物點在尼龍膜上，分別用雌雄基因組DNA為探針進行斑點雜交。共獲得98個雄性特異陽性克隆(部分結果見圖3)進行測序。測序結果利用DNAMAN軟件去掉載體、引物序列、低質量序列和小于60 bp的序列后得到52條序列。其中，最長序列片段長度297 bp，最短序列片段長度63 bp。在52條差異序列中，33條為非葉綠體來源序列，19條序列是葉綠體來源序列，命名為Ao1～Ao19。所有的NUPTs序列石刁柏葉綠體基因組序列相似性在84%以上。

2.4 NUPTs的篩選與驗證

為了進一步驗證所獲得的NUPTs是否是穩定的性別差異序列，利用基因組半定量PCR技術對19個NUPTs進行分析。結果發現，其中4個序列(Ao1、Ao3、Ao10、Ao18)是較為穩定的雄性偏向序列(圖4)。

M. Trans2K marker；A. 1和2為酶切后的石刁柏雄性基因組DNA；B. 1和2為高溫破碎后的石刁柏雌性基因組DNA圖1 石刁柏雄性基因組DNA酶切(A)及雌性DNA破碎(B)電泳圖M. Trans2K marker； A. 1 and 2 represent the genomic DNA of male asparagus after enzyme digestion；B. 1 and 2 represent the genomic DNA of female asparagus after high temperature boilingFig.1 The electrophorogram of enzyme digested male genomic DNA (A) and high temperature broken female genomic DNA (B) of asparagus

M為Trans 2K marker, 1～96為隨機挑取的菌落圖2 部分重組質粒的PCR擴增結果(以M13R和M13F為引物)M indicates Trans 2K marker；1-96 represent randomly selected coloniesFig.2 Partial results of PCR amplification for screening the positive recombinant clones (M13R and M13F as the primers)

A. 克隆與石刁柏雄性基因組DNA探針雜交；B. 克隆與石刁柏雌性基因組DNA探針雜交；箭頭所示為雄性基因組中顯著富集的克隆圖3 部分消減雜交克隆產物的斑點雜交檢測A. The results of clones hybridized with asparagus male genomic DNA probe; B. The results of clones hybridized with asparagus female genomic DNA probe; Arrows represent the clones with preference in male asparagus genomeFig.3 Dot blot hybridization of the clones screened by substractive hybridization (only partial results were shown)

2.5 NUPTs在基因組中的拷貝數估計

為了分析所獲得的4個雌雄基因組差異序列是否屬于重復序列，利用本實驗室石刁柏基因組測序的數據進行拷貝數估計后發現，Ao1、Ao3、Ao10和Ao18的每單倍基因組拷貝數分別為2 514、1 505、1 477和15(表2)，說明這些NUPTs屬于高度重復序列，這也說明核基因組中性別差異的NUPTs在其插入基因組后發生了復制。

M. Trans2K marker；1～3為石刁柏雌性單株基因組DNA；4～6為石刁柏雄性單株基因組DNA圖4 基因組半定量PCR擴增結果M. Trans2K marker；1-3 represent the genomic DNA of female asparagus individuals；4-6 represent the genomic DNA of male asparagus individualsFig.4 Genomic semi-quantitative PCR amplification results

序列Sequence石刁柏基因組Ao?genome總拷貝數Totalcopies每單倍體基因組的拷貝數Copies/1CAo1162582514Ao396751505Ao1095721477Ao189715

2.6 NUPTs的葉綠體基因組定位分析

為了進一步分析所獲得的NUPTs序列在石刁柏葉綠體基因組的位置特征，將所獲得的19個NUPTs在葉綠體基因組進行定位，結果發現19個性別差異NUPTs在葉綠體基因組上的分布并不是隨機的，其中10個NUPTs都分布在葉綠體基因組的反向重復區(IR)(包含IRa和IRb區)，而在短單拷貝序列(SSC)及長單拷貝序列(LSC)區僅有5個NUPTs，說明葉綠體反向重復區序列更容易向核基因組進行轉移，可能和該區域序列高拷貝數有關。

3 討 論

研究表明，葉綠體基因組向核基因組進行轉移會引起染色體或染色質結構的變化，且這些NUPTs在染色體上的分布具有位置特異性。在水稻中發現大多數染色體上NUPTs多分布于著絲粒區域[18-19]，且多數長序列NUPTs會隨著核基因組的膨脹和收縮而出現被復制或被淘汰現象[19]。本研究從石刁柏核基因組中所發現的19個雌雄差異葉綠體序列中有4個為高拷貝的重復序列，說明葉綠體DNA序列在核基因組中的插入頻率較高，且在NUPTs不斷插入演化過程中形成多拷貝重復序列，但是基因組的膨脹是NUPTs拷貝數增加的結果還是原因仍不清楚。從進化上來說，石刁柏葉綠體許多基因也發生了向核基因組的遷移現象，而且這是一個伴隨物種進化的持續過程。本研究通過NUPTs在葉綠體基因組上的位置分析發現，轉移到核基因組上的DNA大部分來自于葉綠體反向重復區，表明石刁柏葉綠體基因組的重復區序列更容易發生細胞核細胞質之間的轉移，這也可能是造成細胞核基因組中某些NUPTs高拷貝數的原因之一。

現代進化理論認為，原始性染色體的性別決定區的重組抑制是性染色體演化過程中最關鍵的一步[20-21]。正是這種重組抑制現象的出現加快了植物性染色體的演化過程，導致了異型性染色體的出現[22]。而一些反轉座子和NUPTs等高拷貝重復序列的插入可以引起性染色體的異染色質化[23]。現有研究證據表明，植物的性染色體上積累有大量的包括NUPTs在內的重復序列[11, 24-25]，這些序列能夠導致Y染色體異染色質化及功能的喪失[25-27]，形成了兩條組成型異染色質的Y染色體[28]。目前，從技術上證明NUPTs等重復序列在染色體上插入所引起的異染色質化可以利用現代細胞學技術來實現。如利用高分辨率的DNA Fiber免疫熒光雜交技術來分析NUPTs鄰近區域染色質的DNA甲基化及組蛋白修飾模式特征，并通過和同屬雌雄同株近緣種的同源染色體進行比較能夠獲得更有價值的結果，為進一步分析NUPTs在植物性染色體演化中的作用提供重要的理論資料。

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(編輯:宋亞珍)

of Plastid DNA fromAsparagusofficinalis

LI Shufen, LI Xu, WANG Bingxiao, YUAN Jinhong, DENG Chuanliang, GAO Wujun*

(College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang, He’nan 453007, China)

In this study, male-biased NUPTs (nuclear integrants of plastid DNA) were isolated and analyzed in the genome ofAsparagusofficinalis, a dioecious plant, by using genome substractive hybridization method. (1) 52 male-biased sequences with size ranged from 63 bp to 297 bp were obtained from the substractive hybridization library. Among these sequences, 19 were originated from chloroplast genome, which were designated as Ao1-Ao19. These sequences all showed high similarity (>84%) with the corresponding sequences in asparagus chloroplast genome, while Ao19 showed 100% similarity with the corresponding sequence in the asparagus chloroplast genome. (2) Genome semi-quantitative PCR revealed that four (Ao1, Ao3, Ao10, and Ao18) out the 19 sequences were stable male-biased NUPTs. (3) Sequence alignment showed the NUPTs were mainly derived from the inverted repeat region (IR) (containing IRa and IRb) of the asparagus chloroplast genome, indicating that the sequences of IR region of chloroplast genome were more preferred to transfer to nuclear genome to form male-biased NUPTs sequences.

Asparagusofficinalis; sex difference; NUPTs; male-biased

1000-4025(2016)12-2385-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2385

2016-10-12;修改稿收到日期:2016-12-02

國家自然科學基金(31470334)；河南省高校科技創新團隊支持計劃(17IRTSTHN017)；河南省教育廳科學技術研究重點項目(13A180525)

李書粉(1983-)，女，博士，副教授，主要從事植物性別決定與分化機制研究。E-mail：lishufen83@163.com

*通信作者:高武軍，教授，主要從事植物性別決定與分化機制研究。E-mail：gaowujun1@163.com

Q789

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