二倍體矮牽牛花粉母細胞異常減數分裂的觀察與核型分析

魏 躍，蔡善亞，董 慧，史紅林，嵇 怡

(1 江蘇農林職業技術學院，江蘇鎮江 212400；2 南京農業大學 園藝學院，南京 210095)

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二倍體矮牽牛花粉母細胞異常減數分裂的觀察與核型分析

魏 躍1,2，蔡善亞1，董 慧1，史紅林1，嵇 怡1

(1 江蘇農林職業技術學院，江蘇鎮江 212400；2 南京農業大學 園藝學院，南京 210095)

以夏季高溫時期二倍體矮牽牛花蕾為材料，采用常規制片法，對花粉母細胞異常減數分裂進行觀察并選取終變期進行染色體核型分析。結果發現:異常減數分裂主要表現為具有多核仁、二價體提前分離成單價體、赤道板外的染色體，姊妹染色單體提前分離、不均等分離，落后和丟失染色體，具有微核的三分體和四分體，中期Ⅱ紡錘體定位發生異常出現融合紡錘體和八字形紡錘體可導致2n花粉產生；矮牽牛終變期核型公式為K(2n)=2x=14=10m+4sm(2SAT)，其中第1、4、5、6、7號為中部著絲粒染色體，第2號(具有隨體)、3號為亞中部著絲粒染色體，染色體相對長度組成為 2n=14=4M1+10M2，核型分類為2A型。研究表明，矮牽牛異常減數分裂可導致2n花粉和不育花粉的產生，利用終變期進行核型分析具有材料豐富、二價體形態清晰不需人為配對分析等優點，為矮牽牛細胞學研究提供了新方法。

矮牽牛；花粉母細胞；減數分裂；2n花粉；核型分析

矮牽牛(PetuniahybridaVilm.)又名碧冬茄、撞羽朝顏和靈芝牡丹，為茄科矮牽牛屬一年生草本花卉，性喜溫暖多在夏秋季開花，花色艷麗多姿花期長具有較高觀賞價值，廣泛應用于廣場、庭院和露天花壇等的美化裝飾與綠化，被喻為“世界花壇花卉之王”。近些年來，國內研究人員對矮牽牛開展了遺傳多樣性[1]、組織培養[2]、多倍體[3]、基因克隆[4]和遺傳轉化[5]等方面研究，但對其細胞學研究相對較少，僅有蔡華等[6]利用根尖進行了核型分析并證實二倍體矮牽牛染色體數目為2n=14，魏躍等[7-8]也對二、四倍體矮牽牛花粉母細胞減數分裂過程進行過初步細胞學觀察。夏季高溫會降低花粉育性，研究表明小麥[9]、百合[10]不育花粉形成與花粉母細胞減數分裂小孢子和雄配子發育異常有關，但目前矮牽牛還沒有相關研究；未減數分裂配子即2n配子的發生在植物界是較普遍的現象，據Veilleux[11]統計已在13個科85個種或種間雜種中發現過2n配子的產生，國內學者在大白菜[12]、小白菜[13]、草莓[14]和甜柿[15]等作物中都發現了自然產生的2n配子并對形成的細胞學機制進行了研究，但目前矮牽牛也沒有類似研究報道。

本研究以夏季高溫時期二倍體矮牽牛花蕾為材料，對花粉母細胞減數分裂的異常現象進行觀察和分析，并對終變期染色體進行核型分析，試圖從細胞學角度闡明不育花粉和2n配子形成的機制。該研究為矮牽牛2n配子的遺傳研究和有性多倍化育種應用奠定細胞學基礎，相關的核型分析對研究矮牽牛演化與分類、與其它物種的親緣關系、遠源雜交及遺傳工程中染色體鑒別具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試材料為栽培廣泛的二倍體矮牽牛品種‘夢幻’，購自浙江虹越花卉有限公司,在江蘇農林職業技術學院園藝試驗基地塑料大棚進行栽培，2014年4月6日穴盤播種、5月2日移入育苗缽、5月24日移入直徑20 cm塑料花盆，6月14日進入始花期。

1. 2 方 法

1.2.1 不育花粉和2n配子的觀察統計 分別于6～7月連續陰雨天(白天溫度22～25 ℃)、7月連續高溫天(白天33～36 ℃)的早上11:00～12:00時，取矮牽牛花粉粒于載玻片上，參考李潤芳等[16]方法用1%醋酸洋紅染色5 min 后，在光學顯微鏡下觀察計數可育花粉(染色深、大小正常、外形圓的)和不育花粉(不染色或染色淺、外形皺縮畸形)數目。不育花粉率=不育花粉數/花粉總數×100%。根據花粉直徑大小[17]確認2n花粉。在顯微鏡下用顯微測微尺測量花粉的直徑并統計2n花粉數，2n花粉百分率=2n花粉數/花粉總數×100%。

1.2.2 減數分裂觀察方法 晴天上午8:00至11:00每隔1 h取矮牽牛的幼小花蕾，用卡諾氏固定液(無水乙醇∶冰醋酸體積比為3∶1)固定24 h后，經90%、80%乙醇梯度脫水最后轉入70%乙醇4 ℃下保存備用。用1 mol/L鹽酸60 ℃恒溫水浴花蕾約2～3 min，蒸餾水沖洗3～4次，從花蕾中剝取花藥，用1%醋酸洋紅染色常規染色、壓片，火焰拷片2 s分色[18]，在德國ZEISS.Imager.A1光學顯微鏡鏡檢并照相。

1.2.3 核型分析方法 分別取50個分散良好、著絲點清晰的終變期分裂相進行染色體計數，從中分別選取5個染色體完整、形態與著絲點清晰的分裂相拍照。利用Photoshop軟件進行染色體圖像處理分析，染色體相對長度系數按Kuo等[19]的方法劃分，染色體相對長度(某染色體的長度/全組染色體平均長度×100%)、臂比、著絲粒指數、著絲粒位置及類型按照Levan等[20]的方法計算分類，核型分析采用李懋學等[21]制定的標準。根據Arano[22]的方法計算染色體不對稱系數(染色體長臂總長度/染色體組總長度×100%)，核型分類參照Stebbins[23]的分類標準。

2 結果與分析

2.1 花粉粒育性統計

7月連續高溫時期隨機取樣共觀察統計了570個成熟花粉粒，其中不染色或染色淺、外形皺縮畸形的花粉粒為不育花粉(圖1，A)，不育花粉粒82個不育率為14.39%；6～7月連續陰雨天共觀察統計了620個成熟花粉粒，不育花粉29個，不育花粉率為4.68%，可見高溫可導致矮牽牛產生較多不育花粉。

2.2 2n花粉統計

花粉直徑大小通常被作為未減數花粉的一個判斷依據[17]，隨機取樣共觀察530個成熟花粉粒，發現二倍體矮牽牛存在著少量的2n花粉(圖1，B)，未減數2n花粉的平均直徑為(40.1±2) μm，減數n花粉平均直徑約為(30.2±3) μm，未減數花粉的平均直徑約為減數花粉的1.33倍，2n花粉直徑明顯大于減數n花粉，經統計2n花粉百分率為1.51%。

2.3 減數分裂適宜取樣期

為確定適宜的減數分裂取樣時期，在晴天上午8:00至11:00每隔1 h取樣，每個時間段均制30個片子進行觀察。表1表明早9點左右分裂相最多平均每個制片可達16.2個，此時氣溫約為25～29 ℃比較適宜減數分裂、花粉母細胞處于分裂旺盛期為最佳取樣期；11點取樣制片中的分裂相最少降低為8.1個，減數分裂活動的降低可能與此時溫度過高達到30～35 ℃有關。

2.4 花粉母細胞減數分裂觀察

二倍體矮牽牛花粉母細胞的減數分裂過程基本正常符合二倍體植物減數分裂的規律，但也有一些異常行為，其動態特征如下：

A.敗育花粉粒(箭頭示)；B.2n花粉粒(箭頭示)圖1 花粉(×210)A. Aborted pollen grains (arrow showing); B. 2n pollen grains (arrow showing)Fig.1 Pollen(×210)

取樣時間Samplingtime單個制片減數分裂相數Numberofmeiosiseveryslide8：0013．79：0016．210：0010．511：008．1

前期Ⅰ：除了具有一個正常核仁(圖2，A)，還可觀察到核內具有雙核仁(圖2，B)。終變期大多數細胞核內分布著7個同源配對的棒狀或環狀二價體，也觀察到少數二價體結合不緊密甚至提前分離成二個單價體(圖2，C～D)，異常比率為3.63%。

中期Ⅰ：配對的二價體排列于赤道板上，大多數二價體能同步分離，也有少數比率為5.51%的細胞出現二價體分離延遲(圖2，E)。

后期Ⅰ：同源染色體被紡錘絲均等牽引拉向兩極，少數細胞出現落后染色體(圖2，F)。在后期Ⅰ拉向極區染色體的1對姊妹染色單體一般不分離，只有少數細胞中1～2對姊妹染色單體提前發生分離(圖2，G～K)。其中2對姊妹染色單體有2∶2均等分離(圖2，G)，還有1∶3不均等分離(圖2，H)；1對姊妹染色單體除在同極發生分離(圖2，Ⅰ)，還有其中一染色單體反向牽引至另一極(圖2，J)或滯留在主核外成為丟失染色體(圖2，K) 這將導致不均等分離，后期Ⅰ異常比率統計為4.79%。后期Ⅰ中產生的落后、丟失和核外滯留染色體將導致四分體時期產生微核[16]，染色體不均等分離則導致各種非整倍體配子形成[24]。

中期Ⅱ：此期有5.37%的細胞含有排列在赤道板外的染色體(圖2，L)，2個紡錘體因角度和相距程度不同，表現為4種形式：平行紡錘體(圖2，L)、融合紡錘體(圖2，M) 、八字形紡錘體(圖2，N)和垂直紡錘體(圖2，O)。

中期Ⅱ融合紡錘體的二組染色體彼此非常靠近(圖2，M)，末期Ⅱ時整個花粉母細胞內的4個子核呈二極分布每一極含雙核，隨后的四分體胞質分裂只形成1個分裂溝形成二分體(圖2，P)實現了核重組，最終發育成2個2n花粉。如有落后或丟失染色體，則形成微核、1個非整倍體配子和1個2n配子(圖2，Q)。

中期Ⅱ八字形紡錘體(圖2，N)在后期Ⅱ分離的四組染色體將可能只牽引至三極，其中一極由于二組染色體融合，染色體數目為n=2x=14，而另兩極各包含有1組染色體(圖2，R)。四分體時期胞質分裂將形成三分體(圖2，S)，最終發育成1個2n花粉和2個n花粉。在觀察到的四種形式的紡錘體中，以平行紡錘體和垂直紡錘體最為普遍，二者比率約合為87.3%，而融合紡錘體、八字形紡錘體比率之和為12.7%。

后期Ⅱ：多數細胞中姊妹染色單體正常分離移向兩極，約有比率為7.75%細胞中出現落后染色體(圖2，T)。

A～B.終變期(A.單核仁，B.雙核仁)；C～D.終變期(單箭頭示二價體提前分離成2個單價體，雙箭示隨體)；E.中期Ⅰ；F.后期Ⅰ；G.后期Ⅰ(箭頭示2對姊妹染色單體2∶2均等分離)；H.后期Ⅰ(箭頭示2對姊妹染色單體3:1不均等分離)；I.后期Ⅰ(箭頭示1對姊妹染色單體分離)；J.后期Ⅰ(單箭頭示染色體留在主核內，雙箭頭示反向牽引染色體)；K.后期Ⅰ(單箭頭示染色體滯留在主核外，雙箭頭示反向牽引染色體)； L.中期Ⅱ，平行紡錘體；M.融合紡錘體；N.八字形紡錘體；O.后期Ⅱ,垂直紡錘體；P.二分體；Q.1個微核+二分體；R.后期Ⅱ，兩極染色體融合；S.三分體；T.后期Ⅱ；U.四分體(左右對稱型)；V.四分體(四面體型)；W.1個微核+四分體；X.2個微核+四分體；圖2 矮牽牛花粉母細胞減數分裂(×1300)A-B.Diakinesis(1.mononucleolus,2.binucleolus);C-D.Diakinesis(single arrowhead indicated bivalent dividing into two univalent in advance, double arrowhead indicated satellite); E.Metaphase Ⅰ;F.Anaphase I;G.Anaphase Ⅰ(arrowhead indicated 2:2 equational division of two pairs of sister chromatids);H.Anaphase Ⅰ(arrowhead indicated 3:1 unequal division of two pairs of sister chromatids);I.Anaphase Ⅰ(arrowhead indicated one pairs of sister chromatids dividing);J.Anaphase Ⅰ(single arrowhead indicated chromosome staying outside of the main nucleus, double arrowhead indicated reverse moving chromosome);K.Anaphase Ⅰ(single arrowhead indicated chromosome staying outside of the main nucleus, double arrowhead indicated reverse moving chromosome);L.Metaphase Ⅱ, parallel spindle; M.Fusing spindle; N.Tripolar spindle;O. Anaphase Ⅱ,Vertical spindle; P.Dyad; Q.Dyad with one micronuclei;R.Anaphase Ⅱ,Chromosomes of two polars converging; S.Triad;T. Anaphase Ⅱ;U.Tetrad(isobilateral);V.Tetrad(tetrahedral);W.Tetrad with one micronuclei;X.Tetrad with two micronucleiFig.2 Meiosis of pollen mother cells in petunia (×1 300)

四分體時期：大多數為正常四分體，主要為左右對稱型(圖2，U)和四面體型(圖2，V)。由于落后或丟失染色體往往導致微核形成，觀察到少數具有1～2個微核的四分體(圖2，W～X)和1個微核的二分體(圖2，Q)；由于紡錘體的異常定位使后期Ⅱ的染色體牽引和末期Ⅱ的核排布方式改變，從而形成二分體(圖2，P)和三分體(圖2，S)。四分體時期各種異常比率總和為8.0%。

對花粉母細胞減數分裂6個時期百分率進行平均，每個時期約有5.84%的花粉母細胞減數分裂表現異常(表2)。

2.5 減數分裂終變期染色體的核型分析

二倍體矮牽牛終變期核型分析的染色體數為7對二價體，未觀察到非整倍性變異現象，證實了二價體矮牽牛2n=2x=14，同時發現2號染色體具有隨體(圖2,C～D)，這與Smith等[25]報道一致。

核型參數值見表3，終變期1～7號染色體絕對長度的變化范圍在3.04～4.30 μm之間，相對長度的變化范圍在12.27%～17.34%之間，相對長度系數(某染色體長度/染色體組的平均長度)[19]，在0.86～1.22之間，其中第1、2對為中長染色體(M1)，第3～7對為中短染色體(M2)。臂比(長臂/短臂)變化范圍為1.04～2.48，著絲粒指數為28.74%～49.02%，著絲粒位置為中部著絲粒m和亞中部著絲粒sm，其中第1、4、5、6、7號為中部著絲粒染色體(m)，第2、3號為亞中部著絲粒染色體(sm)。

表2 減數分裂各時期染色體行為異常的花粉母細胞百分率

表3 花粉母細胞減數分裂終變期的核型參數

注：＊表示具有隨體

Note：＊indicate satellite

表4 花粉母細胞減數分裂終變期的核型分析

圖3 減數分裂終變期分裂相及其核型圖(×2 000)Fig.3 Diakinesis chromosomes and karyotype(×2 000)

圖4 減數分裂終變期染色體核型模式Fig.4 Idiogram of diakinesis chromosomes

表4顯示，矮牽牛終變期核型公式為K(2n)=2x=14=10m+4sm(2SAT)，染色體相對長度組成為 2n=14=4M1+10M2。染色體長度比(最長/最短)比值為1.41，臂比大于2的染色體比例為14.29%，不對稱系數為58.88%，為較對稱類型，按照Stebbins[23]核型分類標準，矮牽牛核型分類均為2A型，屬于較原始類型。減數分裂終變期分裂相及核型圖見圖3，染色體核型模式見圖4。

3 討 論

通過觀察二倍體矮牽牛花粉母細胞減數分裂過程，發現減數分裂過程中各時期絕大多數花粉母細胞的分裂行為正常，只有5.84%細胞表現減數分裂異常，主要表現為具有多核仁、二價體提前分離成單價體、赤道板外的染色體，姊妹染色單體提前分離、不均等分離，落后染色體、丟失染色體，具有微核的二、三分體和四分體。本試驗中夏季高溫矮牽牛花粉不育率達到14.39%，大于花粉母細胞減數分裂平均異常率5.84%，這表明高溫可能還導致雄配子體發育異常率升高、致使不育花粉進一步增加[10]，這還需要試驗證實。

羅雙霞等[26]觀察到大白菜2n-1單體在減數分裂后期Ⅰ單體染色體的姊妹染色體有提前分離現象，軒淑欣等[27]觀察到同源四倍體結球甘藍減數分裂的終變期、中期Ⅰ出現單價體，后期Ⅰ出現提前解離的姊妹染色單體，認為這導致四倍體結球甘藍遺傳不穩定、結實性較差。本試驗中矮牽牛終變期也出現少數二價體結合不緊密提前分離成單價體現象，與上述作物相同，后期Ⅰ姊妹染色體提前分離與前期Ⅰ單價體提前形成有很大相關性，容易導致染色體不均等分離和各種非整倍體雄配子的產生。分子細胞學研究已證明姊妹染色體的黏著是由黏著素介導的。當細胞分裂至中后期過渡時，分離酶催化的酶解導致著絲點區域的黏著素蛋白質環開環，使黏著素從染色體上解離，啟動姊妹染色體的分離[28]。張新忠等[29]通過檢查辣椒小孢子母細胞減數分裂染色體行為，觀察到熱激或低溫處理影響聯會復合體的穩定性，偶線期的花粉母細胞經過熱激或低溫處理后聯會復合體的形成受到抑制形成FDR重組核，導致終變期二價體提前解體。在高溫逆境下，矮牽牛前期Ⅰ花粉母細胞的聯會復合體是否也提前發生分離、產生單價體與分離酶酶解離機制等還有待于進一步研究。

根據遺傳效應，可將2n配子分為FDR(first division restitution)和SDR(second division restitution)2種類型。FDR型配子具有每一對同源染色體的各1個染色單體，SDR型則擁有同源染色體其中一條染色體的2個姊妹染色單體，FDR型和SDR型配子各傳遞親本70%和40%的雜合性，FDR型配子的高度雜合性決定了其高效傳遞親本雜合性和上位性的能力，在育種中有較高的利用價值[30]。在大白菜[12]、小白菜[13]和草莓[14]等研究中，在減數分裂Ⅱ紡錘體定位發生異常、同源染色體發生再組合，形成的FDR型重組孢子含有整套親本染色體組中的所有非姊妹染色單體。本試驗在花粉母細胞減數分裂中期Ⅱ觀察到平行、三極和融合紡錘體等類似紡錘體定位異常現象導致重組2n配子形成，故矮牽牛2n花粉也應屬于FDR型，在遺傳育種中具有較好的利用前景。

目前進行核型分析主要有兩種方法, 一是對有絲分裂細胞(主要為根尖細胞)染色體進行核型分析，二是對處于減數分裂染色體進行核型分析，前人核型分析的研究報道絕大多數都是以根尖體細胞為材料，只有少量報道利用減數分裂進行核型分析[31-32]。利用花粉母細胞減數分裂進行矮牽牛核型分析主要有2個優點，第一矮牽牛是草本花卉花期長開花多，確定花蕾大小形態特征后，可以容易獲得大量處于減數分裂的花粉母細胞，對植株生長不會產生影響；而利用有絲分裂進行核型分析，材料一般都為種子萌發后的根尖，材料稀少而且切取根尖對植株以后生長不利，對于種子量較少的試驗對象不適合。第二利用體細胞有絲分裂進行染色體核型分析時，需要對核內染色體進行逐一測量、比對配對，工作量較大而且配對容易發生錯誤。而終變期被認為是減數分裂過程中最理想的觀察染色體時期，此時二價體端化、染色單體分離收縮程度高、形態清晰，二價體之間排斥力使它們分散，便于觀察。二條同源染色體處于自然配對狀態，省去比對步驟避免人為配對錯誤。

蔡華等[6]以矮牽牛有絲分裂中期根尖細胞為材料進行核型分析，認為第1、2、4、5、6號是中部著絲粒(m型)染色體，第3、7號為亞中部著絲粒(sm型)染色體，核型公式為2n=2x=14=10m+4sm，屬于“2B”型，全套染色體上均無隨體。而本研究表明矮牽牛第1、4、5、6、7對為中部著絲粒染色體(m型)，第2、3對為亞中部著絲粒(sm型)染色體，矮牽牛終變期核型公式雖也為2n=2x=14=10m+4sm(SAT)，但屬于“2A”型。本研究與蔡華對第2和第7號染色體核型有分歧，可能與減數分裂終變期和有絲分裂中期染色體的不同形態差異有關。Smith等[25]曾用熒光顯微鏡觀察矮牽牛單倍體根尖細胞的染色體，用熒光強度變化曲線研究了著絲粒位置和隨體，認為第7號染色體臂比(長臂/短臂)在1～1.22之間，2號染色體臂比1.7且具有隨體。本研究第7號染色體臂比為1.22，2號染色體臂為1.75且具有隨體，與Smith等[25]的結論較為接近。

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(編輯:潘新社)

Observations of Abnormal Meiosis and Karyotype Analysis for Pollen Mother Cells in DiploidPetuniahybridaVilm.

WEI Yue1,2, CAI Shanya1, DONG Hui1, SHI Honglin1, JI Yi1

(1 Polytechnical College of Agriculture and Forestry, Zhenjiang, Jiangsu 212400,China; 2 Horticultural College of Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095,China)

In order to illuminate cytological mechanism of small amount 2n pollen existing in petunia, high sterile rate of petunia pollen in hot summer and explore chromosomal karyotype analysis in meiosis period, we conducted the observation of abnormal meiosis and karyotype analysis in meiosis diakinesis period by conventional plate method using flower buds of diploid petunia plant in hot summer as material. The results showed that abnormal meiosis was mainly characterized by multinucleolus, bivalent and sister chromatids dividing beforehand, chromosomes outside metaphase plate, unequal segregation, lagged chromosomes, lost chromosomes, triad and tetrad with micronucleus. These abnormal meiosis behaviour could cause the production of abortive pollen. In metaphase Ⅱ, fusing spindles, tripolar spindle in which spindle were orientated abnormally could easily lead to 2n pollen formation, the occurrence of 2n pollen percentage was 1.51% through statistics. The karyotype formula ofPetuniahybridaVilm. in meiosis diakinesie was K(2n)=2x=14=10m+4sm(SAT), which had 5 pairs of metacentric chromosomes (chrom. No.1,4,5,6,7), 2 pairs of submetacentric chromosomes(chrom. No.2 and 3, No.2 with satellite). Relative length was 2n=14=4M1+10M2, belonging to 2A type. The abnormal meiosis ofP.hybridacould lead to the production of 2n pollen and sterile pollen, the advantages of karyotype analysis in diakinesis for petunia included abundant materials, clear bivalents form and without artificial pairing analysis, etc al. It provided a new method for study on petunia cytology.

PetuniahybridaVilm.; pollen mother cells; meiosis; 2n pollen; karyotype analysis

1000-4025(2016)12-2440-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2440

2016-10-24;修改稿收到日期:2016-11-22

江蘇省科技廳自然科學基金(BK20131243)；江蘇省農業科技自主創新資金(CX(15)1021)；江蘇農林職業技術學院科研項目(2013kj003)

魏 躍(1970-)，男，博士，副教授，主要從事園藝花卉細胞學與遺傳育種研究。E-mail:1069125418@qq.com

Q253;Q343.2+4

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