新型喹乙醇殘留標志物人工半抗原的設計及其在動物組織殘留檢測中的應用

白玉惠，王鶴佳，劉智宏，黃耀凌，徐士新

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

新型喹乙醇殘留標志物人工半抗原的設計及其在動物組織殘留檢測中的應用

白玉惠，王鶴佳，劉智宏*，黃耀凌，徐士新

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

為提高酶聯(lián)免疫方法測定喹乙醇殘留標志物(MQCA)的檢測性能，設計了一種新型MQCA人工半抗原，該半抗原既完整保留MQCA分子特征性基團和結(jié)構(gòu)，又具有便于和蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)的基團-NH2。通過三步化學反應合成該半抗原，將其與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)成為免疫抗原后，進一步制備特異性抗體,研制了MQCA酶聯(lián)免疫試劑盒，靈敏度高，特異性好，IC50為1.94 μg/L。建立了測定動物性產(chǎn)品中MQCA殘留量的直接競爭酶聯(lián)免疫法，測定豬肝、豬肉、雞肉、雞蛋中MQCA的檢測限分別為0.42、0.23、0.28、0.28 μg/kg。豬肉中不同添加濃度MQCA(1, 2, 4 μg/kg)的回收率為70%～97%；批內(nèi)、批間變異系數(shù)均低于12%。本試劑盒可同時快速檢測大批樣品，有望在MQCA殘留檢測中發(fā)揮重要作用。研究有助于指導小分子藥物半抗原的合理設計，為現(xiàn)有的半抗原設計方法提供新的理念和思路。

喹乙醇殘留標志物；半抗原設計；酶聯(lián)免疫分析；殘留檢測

喹乙醇(OLA)，分子式C12H13N3O4，是喹噁啉類抗菌藥物的典型代表，其主要代謝物為3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)。由于OLA對大多數(shù)動物有明顯的致畸作用，對人也有潛在的三致性，即致畸、致突變和致癌[1-2]，很多國家規(guī)定禁止或限制使用OLA。作為指定的主要殘留標志物，MQCA用于監(jiān)控OLA在畜牧生產(chǎn)中的違禁使用情況。利用儀器方法檢測MQCA的技術相對復雜、耗時長、成本高[3-5]，而酶聯(lián)免疫方法(ELISA)具有快速、靈敏、簡便、有效等優(yōu)點，能滿足目前生產(chǎn)鏈所需要的大量樣本的快速篩選和現(xiàn)場檢測的要求。

目前已有檢測MQCA方法主要是直接在MQCA分子的-COOH位置設計改造抗原[6]。這種偶聯(lián)情況下，MQCA的部分特征性基團和結(jié)構(gòu)(-COOH、氮雜環(huán))很可能不能充分暴露作為B淋巴細胞的抗原表位，進而影響抗體靈敏度或特異性。因此，連接位點的選擇對于抗體質(zhì)量至關重要，這就要求對半抗原進行科學合理的設計與改造。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 OLA，MQCA，喹噁啉-2-羧酸(QCA)，乙酰甲喹，辣根過氧化物酶(HRP)，人血清蛋白(HSA)，吐溫20，甘油，弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，西格瑪化學試劑公司(北京)。卡巴氧，喹烯酮，百靈威科技有限公司。全脂奶粉,Becton-Dickingson 公司(美國)。四甲基聯(lián)苯胺, 硫酸(H2SO4),北京化學試劑公司。去離子水由Milli-Q系統(tǒng)(Millipore, MA)純化制備。其它試劑均為分析純，使用前未經(jīng)純化。

ELISA測定通過sunrise酶標儀完成，核磁共振氫譜通過瑞士BRUKER DRX300MHz核磁共振儀完成，所用液質(zhì)聯(lián)用儀為島津LC-MS 2020。1.2 (緩沖)溶液體系 使用的(緩沖)溶液包括：(1)包被緩沖液：0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液(pH9.6)；(2)PBS緩沖液(pH7.2)：含有0.01mol/L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉的水溶液；(3)洗滌液：含有0.05%(質(zhì)量百分含量)吐溫-20的PBS緩沖液；(4)顯色液A：濃度為1 mg/mL的四甲基聯(lián)苯胺溶液(溶劑為二甲基甲酰胺)；(5)顯色液B：含有0.2 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸的水溶液，pH5.0；(6)終止液：1 mol/L硫酸溶液。

1.3 半抗原的合成 喹乙醇殘留標志物人工半抗原分子結(jié)構(gòu)如圖1所示，既完整保留MQCA分子特征性基團和結(jié)構(gòu)，同時又具有氨基(-NH2)便于和蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)，該半抗原簡稱為AMQCA。

圖1 半抗原分子AMQCA結(jié)構(gòu)圖

半抗原分子的合成路線如圖2所示。

(1)將650 mg乙酰乙酸乙酯溶于20 mL蒸餾水，加入N-溴代丁二酰亞胺(NBS)1.06 g，再加入4-硝基鄰苯二胺750 mg，反應過夜。用乙酸乙酯萃取，濾液減壓蒸干得化合物2。(2)取500 mg化合物2溶于無水乙醇15 mL，加入氯化亞錫570 mg，室溫反應4 h。加入20 mL 1mol/L NaOH 溶液，二氯甲烷萃取，濾液減壓蒸干，得化合物3。(3)取230 mg化合物3溶于甲醇和水(5 mL∶2 mL)的混合溶液，加入氫氧化鋰120 mg，室溫反應過夜。減壓蒸干得化合物4，即圖1所示產(chǎn)物AMQCA。

分別采用LC-MS和核磁共振方法表征制備的半抗原。

圖2 喹乙醇殘留標志物半抗原的合成路線圖

1.4 人工免疫抗原的合成 將25 mg AMQCA溶于2 mL水，加入2 mL 1 mol/L鹽酸水溶液，然后依次加入20 mg亞硝酸鈉和200 mg人血清白蛋白，混勻，于2～8 ℃及120 r/min條件下攪拌反應2 h，然后在PBS緩沖液中透析以除去未與蛋白結(jié)合的AMQCA。將制備的AMQCA-HSA保存于-20oC備用，結(jié)構(gòu)示意圖見圖3。采用紫外可見吸收光譜(UV-vis)對制備的免疫抗原進行表征，以確定是否偶聯(lián)成功，并計算半抗原/蛋白質(zhì)的分子結(jié)合比。

圖3 喹乙醇殘留標志物人工抗原的結(jié)構(gòu)示意圖

1.5 酶結(jié)合物的制備 將5 mg AMQCA溶于1 mL水，然后逐滴加入0.5 mL EDC水溶液(含5 mg EDC)和0.5 mL NHS水溶液(含3 mg NHS)并混勻，于4℃攪拌5 min，加入1 mL 20 mg/mL HRP溶液(將辣根過氧化物酶溶于PBS緩沖液，得到HRP溶液)并于4 ℃、120 r/min攪拌反應16 h，在生理鹽水中透析，得到酶標抗原AMQCA-HRP濃溶液，用等體積甘油稀釋后，-20oC保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 動物免疫 動物福利和實驗程序嚴格遵循北京市實驗動物福利倫理審查條例(2005)，以及涉及動物的生物醫(yī)學研究的國際指導準則(1985)，并經(jīng)中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所動物福利倫理審查委員會同意。試驗過程盡量做到減輕動物痛苦，減少動物數(shù)量。

采用3只新西蘭大耳兔(北京維通利華實驗動物技術有限公司)作為免疫動物，以制備的AMQCA-HSA人工抗原為免疫原。首次免疫用乳液按照如下方法配制：2 mL濃度為2 mg/mL(以蛋白濃度計)的免疫原水溶液與2 mL完全弗氏佐劑乳化。加強免疫用乳液按照以下方法配制：2 mL濃度為2 mg/mL(以蛋白濃度計)的免疫原水溶液與2 mL不完全弗氏佐劑乳化。首次免疫采用背部皮下多點注射以及后腳掌趾間注射(免疫原的劑量為1 mg /只)；加強免疫采用大腿肌肉注射(免疫原的劑量為0.5 mg /只)，每次免疫間隔2周，最后一次不加免疫佐劑直接肌肉注射，最后一次加強免疫7 d后采血，收集血清，即為多克隆抗體。

1.7 用棋盤滴定法確定抗體及酶結(jié)合物效價 分別取來自3只兔子的多克隆抗體，用包被緩沖液梯度稀釋，得到系列抗體稀釋液。在酶標板每孔分別加入150 μL上述抗體稀釋液，37 ℃靜置2 h，然后4 ℃靜置12 h，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，拍干。每孔加入250 μL含5%(質(zhì)量百分含量)脫脂牛奶的PBS緩沖液，37 ℃溫育1 h，棄去孔內(nèi)液體，干燥。取上述酶標板，分別加入0濃度標準溶液(即PBS緩沖液)和含10 ng/mL MQCA的PBS緩沖液(50 μL/孔)，然后每組再分別加入100 μL系列稀釋酶標抗原溶液，混勻并靜置孵育30 min。用洗滌液洗滌酶標板3次并用吸水紙拍干，每孔加入100 μL顯色液并避光顯色15 min，最后每孔加入100 μL終止液，用酶標儀測定450 nm處吸光值(A450值)。

加入0濃度標準溶液的孔的吸光度值為B0。加入含10 ng/mL MQCA的PBS緩沖液的孔的吸光度值為B。B0大于1.5且抑制率為50%以上判斷為陽性。百分吸光度值越低，抗體靈敏度越高。按此要求血清抗體效價達1∶5000。選取3只兔子中效果最好的血清抗體用于進一步試驗。

抑制率(%) = [1-(B/B0)] × 100%

1.8 直接競爭免疫測定 取制備好的多克隆抗體，用包被緩沖液稀釋，得到蛋白濃度為0.2 μg/mL的溶液。在酶標板每孔分別加入150 μL抗體稀釋液，37℃靜置2 h，然后4 ℃靜置12 h，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，拍干。每孔加入250 μL含5%(質(zhì)量百分含量)脫脂牛奶的PBS緩沖液，37 ℃溫育1 h，棄去孔內(nèi)液體，干燥。每孔加入50 μL MQCA標準品溶液(濃度分別為：0、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0 μg/L)，然后每孔加入100 μL酶標抗原溶液(0.1 mg/L)，并于室溫孵育30 min。用洗滌液洗滌酶標板3次并用吸水紙拍干，每孔加入100 μL顯色液并避光顯色15 min，最后每孔加入100 μL終止液，用酶標儀測定450 nm處吸光值(A450值)。1.9 特異性測定 選擇與MQCA結(jié)構(gòu)和功能類似的5種藥物，將MQCA配制成如下濃度：0、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0 μg/L，其它5種類似藥物配制成如下濃度：0、10、30、100、300、1000 μg/L。用本試劑盒按照上述直接競爭免疫法測定標準曲線，得到各藥物50%抑制濃度，與MQCA50%抑制濃度相比，得出一系列交叉反應率(CR)，按以下公式計算：

CR (%) = (IC50,MQCA/IC50,類似物) × 100%

1.10 豬肝、豬肉、雞肉、雞蛋樣品檢測限測定 用制備的試劑盒測定各個空白樣品(已確認不含MQCA的豬肝、豬肉、雞肉、雞蛋，各20份)的A450值，每個樣品進行2次重復取平均值。將各樣品的A450平均值分別代入標準曲線(0、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0 μg/L)中，獲得各樣品中的測定值，按測定平均值加3倍標準差計算檢測限。

豬肝、豬肉、雞肉、雞蛋樣品前處理方法如下：稱取2(±0.02)g均質(zhì)樣品至50 mL離心管中，加入8.0 mL乙酸乙酯，渦旋混勻；加入4 mL 1.5 mol/L鹽酸水溶液，渦旋混勻，用振蕩器振蕩5 min，5000 r/min室溫離心5 min；取5 mL上清液至另一50 mL離心管中，加入3 mL 33.3%(質(zhì)量百分比)NaCl水溶液，渦旋混勻，5000 r/min室溫離心5 min；取4.0 mL上清液至10 mL干凈玻璃試管中，于50 ℃～60 ℃水浴氮氣流下吹干；在玻璃試管中加入1 mL正己烷，渦旋溶解干燥殘留物，然后加入1 mL水，渦旋混勻，靜置分層；除去上層有機相，取下層水相，用水稀釋至兩倍體積，即為待測樣本溶液。

1.11 添加回收試驗 空白豬肉樣品中分別添加MQCA使其濃度為1.0、2.0、4.0 μg/kg，每個濃度分別制備6個樣品，采用上述前處理方法進行處理后，用ELISA方法進行測定。

添加回收率(%)計算公式如下：

回收率=實測值/添加值×100%

2 結(jié)果

2.1 半抗原的鑒定 LC-MS圖譜結(jié)果如下，(ESI, m/z)：204 [M+H]+。圖譜中，得到m/z 比為204的主峰，對應半抗原的[M+H]+。

核磁共振圖譜如圖4所示，1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 7.71 (d,J= 9.0 Hz, 1 H), 7.29 (dd,J= 9.0, 1.8 Hz, 1H), 6.92 (d,J= 1.8 Hz, 1H), 6.13 (br, 2H), 2.68 (s, 3H)。氫化學位移值、質(zhì)子的裂分峰數(shù)與半抗原相一致。

以上結(jié)果表明，半抗原的結(jié)構(gòu)式為圖1所示。

圖4 喹乙醇殘留標志物半抗原的核磁共振氫譜

2.2 人工抗原的鑒定 AMQCA與載體蛋白HSA通過重氮化反應偶聯(lián)。為了證明偶聯(lián)成功，分別對AMQCA溶液(a)、HSA溶液(b)以及AMQCA-HSA溶液(c)進行紫外(250～400 nm)光譜掃描，發(fā)現(xiàn)吸收峰有明顯變化，見圖5。

圖5 紫外可見光譜 (a) AMQCA (b) HSA (c) AMQCA-HSA

2.3 試劑盒檢測限、靈敏度、特異性、精密度和準確度

2.3.1 試劑盒檢測限 在不含MQCA的豬肝、豬肉、雞肉、雞蛋各20份空白樣品的測定基礎上，計算得到該ELISA方法在豬肝、豬肉、雞肉、雞蛋中的檢測限分別為0.42、0.23、0.28、0.28 μg/kg。

2.3.2 試劑盒靈敏度 50%抑制濃度(即IC50，指0 μg/L吸光度值的50%處所對應的MQCA濃度)常作為評價競爭ELISA試劑盒靈敏度的指標。用試劑盒分別測定5次標準曲線的IC50在1.8～2.1 μg/L范圍之內(nèi)，平均值為1.94 μg/L。本試劑盒抑制曲線和標準校正曲線見圖6。

圖6 試劑盒抑制曲線(A)和標準校正曲線(B)(每個點為重復5次測定的平均值)

2.3.3 試劑盒特異性 特異性測定結(jié)果如表1所示，表明該試劑盒能特異性測定MQCA而不受其它類似物干擾。

表1 試劑盒特異性試驗結(jié)果

2.3.4 精確度和準確度 通過添加回收試驗，對該方法的精確度和準確度進行評估。批內(nèi)變異系數(shù)是通過測定6個平行樣品計算得到，批間變異系數(shù)是3個不同批次試劑盒分別測定6個平行樣品計算得到。測定結(jié)果見表2。

3 討論與小結(jié)

3.1 半抗原AMQCA的優(yōu)點 眾所周知，小分子由于不能誘導動物產(chǎn)生免疫應答而不具備免疫原性。因此，AMQCA不能直接用作免疫抗原，而是需要與蛋白質(zhì)載體連接。試驗設計的半抗原AMQCA與MQCA結(jié)構(gòu)相似，唯一區(qū)別在于苯環(huán)上遠離-COOH的位置多一個-NH2。將AMQCA作為半抗原具有以下優(yōu)點：(1)完整保留MQCA分子特征性基團和結(jié)構(gòu)(氮雜環(huán)、-COOH等)；(2)具有便于和蛋白質(zhì)載體進行偶聯(lián)的基團-NH2；(3)特征性基團和結(jié)構(gòu)遠離偶聯(lián)位置，不容易受到蛋白質(zhì)載體屏蔽，可充分暴露而成為抗原表位，利于高靈敏度和特異性抗體的制備。

表2 豬肉精確度和準確度的試驗結(jié)果

3.2 半抗原與蛋白質(zhì)載體的偶聯(lián) 紫外可見光譜(圖5)中，AMQCA在260 nm處具有很大的吸收峰，這可能是由于其分子中具有較多共軛結(jié)構(gòu)(-C=C-，-C=O，-C=N-)。HSA在278 nm處的吸收峰來自于分子中色氨酸和酪氨酸殘基[7]。對于AMQCA-HSA，偶聯(lián)形成的-N=N-將半抗原和蛋白質(zhì)連接起來，同時也將各個共軛體系連接，導致340 nm附近新的吸收寬峰的出現(xiàn)。此外，根據(jù)先前報道的方法[8-9]，計算半抗原AMQCA和人血清白蛋白的偶聯(lián)比為8∶1，即8個半抗原分子結(jié)合1個人血清白蛋白。

3.3 MQCA試劑盒的性能 將制備的抗體用于ELISA試劑盒的研制，其各方面性能均良好。IC50比已有報道的ELISA方法的IC50降低2～3倍[6,10-11]。與文獻[6]報道直接在MQCA分子的-COOH位置設計改造抗原并在此基礎上建立測定動物可食性組織中MQCA的ELISA方法相比，本方法在豬肉中測定MQCA的檢測限降低了8倍，在雞肉中測定MQCA的檢測限降低了6倍。此外，本方法在豬肝中測定MQCA的檢測限比Shen等[10]方法降低2.4倍，并且與HPLC-MS/MS方法測定雞組織中MQCA的檢測限具有可比性[12]。

本方法特異性高，抗體對MQCA高度敏感(CR為100%)，而對QCA稍有反應(CR為3.6%)，但是對乙酰甲喹、喹乙醇、卡巴氧、喹烯酮等幾乎無反應(CR<0.1)，因此測定MQCA時不受類似物(例如QCA)干擾。可能的原因有以下兩個：第一，設計的半抗原AMQCA與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)后，由于偶聯(lián)位置遠離分子特征性基團和結(jié)構(gòu)，氮雜環(huán)、-COOH以及-CH3不容易受到蛋白質(zhì)載體屏蔽，仍能同時暴露而成為抗原表位；第二，從結(jié)構(gòu)上看，MQCA比QCA的-COOH鄰位多一個-CH3，導致抗體對MQCA以及QCA反應率相差迥異。Jiang等[6]在MQCA分子的-COOH上接入間隔臂后偶聯(lián)載體蛋白作為抗原，制備的抗體對具有喹噁啉母環(huán)結(jié)構(gòu)的多種藥物均有反應，這也從另一個方面說明本文設計的半抗原結(jié)構(gòu)能大大提高抗體特異性，并且本方法解決了上述文獻中假陽性率高的問題。

此外，該試劑盒測定豬肉中1.0、2.0和4.0 μg/kg MQCA添加濃度的回收率范圍為70%～97%，批內(nèi)變異系數(shù)CV≤12%，批間變異系數(shù)CV≤12%。說明本方法的精確度和準確度能夠滿足要求，并且具有較好地重現(xiàn)性和可重復性。

本文設計了一種新型MQCA人工半抗原，該半抗原既完整保留分子特征性基團和結(jié)構(gòu)并使其充分暴露而成為抗原表位，同時又具有連接基團便于和蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)制備人工抗原，進而利于高靈敏度和特異性抗體的制備。人工半抗原合成原料試劑簡單、低廉，易于購買,采用的化學反應安全，易于操作。制備的特異性抗體用于MQCA酶聯(lián)免疫試劑盒，建立了測定動物性產(chǎn)品中MQCA殘留量的直接競爭酶聯(lián)免疫法。該方法具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準確度等特點，可同時快速檢測大批樣品，有望在MQCA殘留檢測中發(fā)揮重要作用。更重要地，本研究有助于指導小分子藥物半抗原的合理設計，為現(xiàn)有的半抗原設計方法提供新的理念和思路。

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(編輯：陳希)

A Novel Hapten Design for Marker Residue of Olaquindox and Its Application on the Veterinary Residue Detection in Animal Tissues

BAI Yu-hui, WANG He-jia, LIU Zhi-hong*, HUANG Yao-ling, XU Shi-xin

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

In order to improve the detection performance of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for maker residue of Olaquindox (MQCA), a novel hapten of MQCA was designed. This hapten keeps the characteristic structure and goups of MQCA, additionally, it can be easily coupled with protein carrier according to its -NH2. The hapten was synthesized involving in three steps. Based on its coupling with protein to become the immunogen, polyclonal antibodies were prepared. A rapid direct competitive ELISA was established to detect MQCA in animal tissues. The antibody showed high sensitivity and high specificity, with the IC50being 1.94 μg/L. The limits of detection of MQCA in liver, pork, chicken, and egg were 0.42, 0.23, 0.28 and 0.28 μg/kg, respectively. The average recoveries ranged from 70% to 97% at different spiked levels (1, 2 and 4 μg/kg) in pork for MQCA, and the intra/inter-day coefficients of variation were below 12%. The prototype kit could be advantageously used for the screening of large groups of samples, and has potential to play important role in the detection of MQCA. In addition, this study may help to guide the antigen design of small molecule medicine more reasonably, and supply new concept for the hapten design.

maker residue of Olaquindox; Hapten Design; ELISA; residue detection

白玉惠，博士，從事獸藥殘留檢測方法研究及試劑盒研發(fā)工作。

劉智宏。E-mail: liuzhihong@ivdc.org.cn

2015-12-02

A

1002-1280 (2016) 02-0022-07

S859.84