牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的亞細胞定位研究

刁乃超，時坤，李健明，李仲樂，姜園園，劉東旭，王春鳳，杜銳,3*

(1.吉林農業大學動物科技學院，長春 130118；2.吉林農業大學中藥材學院，長春 130118；3. 教育部動物生產及產品質量安全重點實驗室，吉林省梅花鹿生產與產品應用研究室，長春 130118)

牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的亞細胞定位研究

刁乃超1，時坤2，李健明2，李仲樂1，姜園園1，劉東旭1，王春鳳1，杜銳2,3*

(1.吉林農業大學動物科技學院，長春 130118；2.吉林農業大學中藥材學院，長春 130118；3. 教育部動物生產及產品質量安全重點實驗室，吉林省梅花鹿生產與產品應用研究室，長春 130118)

為深入研究牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的生物學功能，了解其在哺乳動物細胞中的亞細胞定位情況，采用RT-PCR擴增牛病毒性腹瀉病毒Changchun184株E2基因，將其克隆至真核表達載體pcDNA3.1/V5HisA中，并進行酶切鑒定和測序分析，將構建的重組質粒pcDNA3.1/V5HisA-E2經脂質體介導轉染至MDBK細胞。繼續培養48 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察E2蛋白在細胞中的亞細胞定位情況。結果表明，E2蛋白在細胞核與細胞質中均有表達，且綠色熒光呈點狀均勻分布。該研究為進一步研究牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的相關功能奠定了基礎。

牛病毒性腹瀉病毒；E2蛋白；亞細胞定位

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)為牛病毒性腹瀉-黏膜病的病原，會引起牛發熱、腹瀉、急性慢性腸炎、懷孕母畜流產或產畸形胎、持續感染等臨床癥狀。該病傳染性強、感染率高，雖有疫苗應用但仍時常爆發。目前還沒有治療該病的特效藥物[1-3]，因此應對其致病的分子作用機制進行深入研究，以期尋求預防和治療該病的新途徑。

蛋白質的代謝以及信號轉導等生物過程都與其亞細胞定位密切相關。病毒蛋白與宿主細胞蛋白之間的相互作用是病毒致病的基礎，成熟蛋白質必須在特定的細胞部位才能發揮其生物學功能[4-5]。BVDV E2蛋白是一種囊膜蛋白，為BVDV的主要保護性抗原，在參與BVDV與宿主細胞的識別、吸附和介導免疫中和反應等過程中起重要作用[6-8]。但目前對E2基因及E2蛋白的研究主要集中在E2基因的表達和E2蛋白抗體的制備以及新型疫苗的研制方面[9-11]，在E2蛋白與宿主細胞的確切分子致病作用機制方面鮮有相關報道。因此，本試驗對BVDV E2蛋白在哺乳動物細胞中的亞細胞定位進行了研究，旨在為進一步研究其生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料1.1.1 病毒、載體和細胞 牛病毒性腹瀉病毒Changchun 184株為本實驗室保存；pcDNA3.1/V5HisA真核表達載體購于Invitrogen公司；E.coliDH5α菌株由本實驗室保存；MDBK細胞購自中國科學院上海細胞庫。1.1.2 主要試劑 DNA Marker DL 15000、 DNA Marker DL 2000、DNA Polymerase、限制性內切酶EcoR I和XhoI、T4DNA連接酶，均購自TaKaRa生物工程有限公司；凝膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒，購自杭州維特潔生化技術有限公司；脂質體轉染試劑盒購自Promega公司，鼠源V5-tag Monoclonal Antibody和FITC標記的羊抗鼠單抗購自Proteintech公司，HRP標記的羊抗鼠IgG購自博士德生物公司。

1.2 方法

1.2.1 E2基因的擴增與克隆 根據GenBank收錄E2(登錄號：AF526380.1)基因序列設計一對引物，上游引物P1：5′- GGAATTCATGCTCCCAGCCTGTAAACCTGAC-3′，引入EcoR I酶切位點；下游引物P2：5′-CCGCTCGAGTTAACCTAAGGTCGTTTGTTCTG-3′，引入XhoI酶切位點，擴增目的片段大小為1122 bp，引物由庫美生物技術有限公司合成。采用Trizol方法，提取BVDV基因組，進行RT-PCR擴增， 反轉錄體系10 μL：MgCl22 μL，10×RT Buffer 1 μL，RNase Free dH2O 3.25 μL，dNTP Mixture 1 μL，RNsae Inhibitor 0.25 μL，AMV 0.5 μL，下游引物P2 0.5 μL，模板1.5 μL；反轉錄條件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min，1個循環。PCR反應體系40 μL：5×PCR Buffer10 μL，DEPC水28.5 μL，TaKaRa Ex Taq HS 1 μL，上游引物P1 0.5 μL。將PCR反應液加入到反轉錄產物中，混勻，按如下條件進行PCR反應。94 ℃ 30 s，60.1 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收純化后與pGEM-T載體連接，轉化到E.coliDH5α感受態細胞，經藍白斑篩選后，小量提取質粒，進行酶切鑒定，并送庫美生物公司測序。

1.2.2 真核表達載體pcDNA3.1/V5HisA-E2的構建及鑒定EcoR I和XhoI分別對pGEM-T-E2和真核表達載體pcDNA3.1/V5HisA雙酶切，回收目的片段后，用T4DNA連接酶16 ℃連接過夜，轉化到E.coliDH5α感受態細胞中，37 ℃培養12～16 h，挑取重組質粒，進行雙酶切鑒定，并將陽性重組質粒送庫美生物技術有限公司測序。測序正確的質粒命名為pcDNA3.1/V5HisA-E2。

1.2.3 真核表達載體pcDNA3.1/V5HisA-E2的轉染 將MDBK細胞接種到鋪有蓋玻片的6孔板中，2.5×105～3×105/mL，待融合度達到70%～80%時，用FuGENE HD將重組質粒pcDNA3.1/V5HisA-E2和pcDNA3.1/V5HisA轉染到MDBK細胞中，同時設空白對照，具體操作參照說明書。

1.2.4 間接免疫熒光檢測 取轉染48 h后MDBK細胞，用PBS洗3遍，每次10 min，4%多聚甲醛室溫固定12 min，PBS洗3遍，5%胎牛血清37 ℃封閉1 h，PBS洗3遍，加入鼠抗V5標簽抗體(1∶200)4 ℃過夜，用4 ℃預冷的PBS洗3遍，加入FITC標記的羊抗鼠IgG 37 ℃孵育1 h，用4 ℃預冷的PBS洗3遍，DAPI室溫染核3 min，甲醇漂洗后加入封片劑封片。用倒置熒光顯微鏡進行觀察。

1.2.5 E2蛋白的亞細胞定位 將制備好的細胞爬片置于激光共聚焦顯微鏡下，觀察E2蛋白亞細胞定位情況。1.2.6 pcDNA3.1/V5HisA-E2表達產物的Western blot 分析 取轉染48 h后MDBK細胞，棄去培養液，PBS漂洗3次后加入裂解液，冰上裂解30 min，將裂解液及細胞碎片收集于1.5 mL EP管中，12000 g離心10 min，取上清20 μL進行SDS-PAGE電泳，濕轉至PVDF膜后用脫脂奶粉封閉。抗體孵育：一抗為鼠抗V5標簽抗體(1∶20000)4 ℃過夜，二抗為HRP標記羊抗鼠IgG(1∶3000)37 ℃孵育1 h，加入ECL顯色液，用化學發光成像系統記錄結果。

2 結果

2.1 E2基因的擴增和克隆 以提取BVDV Changchun184株總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，獲得PCR產物大小約為1000 bp(圖1)，與預期結果一致。EcoR I和XhoI對 pGEM-T- E2雙酶切，獲得大小約為1122 bp的目的片段(圖2)。

2.2 真核表達載體pcDNA3.1/V5-HisA-E2的構建 真核表達載體pcDNA3.1/V5HisA-E2經EcoR I和XhoI雙酶切后，獲得片段大小正確的目的片段和載體片段(圖3)。DNA測序結果表明，E2基因已經插入到pcDNA3.1/V5HisA載體中且方向正確，將其命名為pcDNA3.1/V5HisA-E2。

2.3 E2蛋白間接免疫熒光檢測 將制備好的細胞爬片置于倒置熒光顯微鏡下進行觀察，可以觀察到DAPI將細胞核染成藍色(圖4A)，表達E2蛋白的MDBK細胞呈現綠色熒光(圖4B)。表明pcDNA3.1/V5HisA-E2在MDBK細胞中成功表達。

圖1 E2基因PCR擴增結果

圖2 重組克隆載體的酶切驗證

圖3 pcDNA3.1/V5HisA-E2重組質粒的酶切鑒定結果

2.4 E2蛋白的亞細胞定位分析 在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察(圖5A、B、C)未轉染的MDBK細胞細胞核和細胞質中均未出現綠色熒光；轉染pcDNA3.1/V5HisA-E2的MDBK細胞(圖5D、E、F)細胞核上和細胞質中均呈現點狀均勻分布的綠色熒光。

圖4 pcDNA3.1/V5HisA-E2蛋白間接免疫熒光結果

圖5 pcDNA3.1/V5HisA-E2蛋白的亞細胞定位情況

2.5 E2蛋白Western blot檢測 對轉染細胞裂解后進行Western blot分析(圖6)，轉染pcDNA3.1/V5HisA-E2的MDBK細胞樣品呈現單一的目的條帶(泳道3、4)，大小與預期結果相符， pcDNA3.1/V5HisA空載體(泳道2)和空白對照(泳道1)均無條帶，表明E2蛋白在MDBK細胞中正確表達。

圖6 pcDNA3.1/V5-HisA-E2和pcDNA3.1/V5-HisA的Western blot分析

3 討論

本研究選擇含有V5和HisA雙標簽的真核表達載體pcDNA3.1/V5-HisA來研究目的蛋白的亞細胞定位情況，這與常用的含有綠色熒光蛋白(GFP)標簽的真核表達載體相比，能夠更準確的顯示出目的蛋白在細胞中的分布情況，因為V5-HisA雙標簽分子量(約2 kD)遠小于GFP標簽的分子量(約25 kD)[12]，能夠克服因大的標簽分子量對蛋白亞細胞定位產生的影響。

本試驗選擇MDBK細胞作為E2蛋白表達和定位的對象，這更接近E2蛋白所在的天然宿主細胞模式，更有利于后期E2蛋白與宿主蛋白互作機制的研究。E2蛋白在MDBK細胞中的表達時限由轉染預試驗確定，經脂質體介導轉染的MDBK細胞，分別于轉染后12、24、36、48、72 h用倒置熒光顯微鏡觀察，結果顯示在轉染24 h后E2蛋白開始表達，在轉染48 h時達到峰值并趨于穩定，因此選擇轉染48 h的MDBK細胞做進一步分析。

激光共聚焦顯微鏡觀察轉染48 h的MDBK細胞，結果顯示E2蛋白在細胞核上和細胞質中均有表達，且綠色熒光大多呈點狀均勻分布。此外，在細胞轉染48 h后，轉染有pcDNA3.1/V5HisA-E2的MDBK細胞有少部分出現變圓、皺縮的形態變化，這在轉染pcDNA3.1/V5-HisA空載體和正常MDBK細胞對照組中并沒有出現，這很可能與E2蛋白表達誘導MDBK細胞凋亡或自噬有關[13]。本試驗將pcDNA3.1/V5HisA-E2轉入MDBK細胞，通過激光共聚焦顯微鏡確定E2蛋白定位于細胞質和細胞核中，為進一步篩選與E2蛋白互作的宿主蛋白，研究二者在牛病毒性腹瀉分子致病機制中的作用奠定了基礎。

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(編輯：李文平)

Subcellular Localization Analysis of Bovine Viral Diarrhea Virus E2Protein

DIAO Nai-chao1, SHI Kun2, LI Jian-ming2, LI Zhong-le1, JIANG Yuan-yuan1,LIU Dong-xu1, WANG Chun-feng1, DU Rui2,3*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118 ,China; 2.CollegeofChineseMedicineMaterial,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 3.KeyLaboratoryofAnimalProduction,ProductQualityandSecurity,MinistryofEducationofthePeople'sRepublicofChina,LaboratoryofProductionandProductApplicationofSikaDeerofJinlinProvince,Changchun130118,China)

This experiment was designed to make a thorough study on the biological function of bovine viral diarrhea virus E2protein by investigating its subcellular localization in mammalian cells. The E2gene fragments of Changchun184 were amplified by RT-PCR, cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1/V5HisA, and then identified by restriction enzymes digestion and sequencing analysis. The subcellular location of E2protein in MDBK cells was observed by confocal laser scanning microscope after that the recombinant plasmid pcDNA3.1/V5HisA-E2was transfected into MDBK cells by lipofectin for 48 h. The results showed that the E2protein was expressed in both the nucleus and cytoplasm, and most of the green fluorescence was distributed in a speckled pattern. All of these results will be as a basis for the further research on E2protein’s functions.

bovine viral diarrhea virus; E2protein; subcelluar localization

國家自然基金(31372436)；科技部星火計劃(2014GA660004)

刁乃超，碩士，從事經濟動物疫病的研究。

杜銳。E-mail: durui71@126.com

2016-01-19

A

1002-1280 (2016) 04-0001-05

S852.65+3