沙咪珠利對小鼠精子畸形和骨髓細胞微核的影響

王東亮，聶巧，李龍飛，李宇琛，陳鴻雨，陳秀云，卜仕金

(1.揚州大學獸醫學院，江蘇揚州 225009；2.揚州大學醫學院，江蘇揚州 225001)

沙咪珠利對小鼠精子畸形和骨髓細胞微核的影響

王東亮1，聶巧1，李龍飛1，李宇琛1，陳鴻雨1，陳秀云2，卜仕金1

(1.揚州大學獸醫學院，江蘇揚州 225009；2.揚州大學醫學院，江蘇揚州 225001)

為評價沙咪珠利的安全性，對其進行了小鼠精子畸形和骨髓細胞微核試驗研究。選擇健康ICR小鼠隨機分為受試物高、中、低劑量組，陽性對照組和陰性對照組，進行精子畸形試驗和骨髓細胞微核試驗，計算精子畸形率和微核率。結果顯示，受試物各劑量組精子畸形率與骨髓細胞微核率與陰性對照組比較，差異不顯著(P>0.05)，與陽性對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。表明沙咪珠利對小鼠精子和骨髓細胞微核無影響，不具有遺傳毒性。

沙咪珠利；精子畸形；骨髓細胞微核

三嗪類抗球蟲藥是一種廣譜、高效、安全的化學合成藥物，能有效預防和治療雞球蟲病[1]。沙咪珠利是國內自主研發的新型三嗪類抗球蟲藥，難溶于水，易溶于二甲基亞砜。初步研究結果表明沙咪珠利屬于低毒藥物，安全性高，抗球蟲效果好，抗球蟲指數(ACI)達150～200，且與地克珠利、妥曲珠利等三嗪類化合物無交叉耐藥現象，具有廣闊的應用前景[2-3]。目前國內外對沙咪珠利的一般毒理學進行了研究報道，但關于沙咪珠利潛在的遺傳毒性未見相關報道。本實驗采用小鼠精子畸形試驗及小鼠骨髓細胞微核試驗探討沙咪珠利對小鼠遺傳毒性的影響，了解沙咪珠利作為新型抗球蟲藥是否具有致突變作用，以期為沙咪珠利新藥的充分開發和安全應用提供毒理學資料。

1 材料與方法

1.1 試劑與器材 沙咪珠利，含量98.6%，產品批號20130308，由中國農業科學院上海獸醫研究所提供；環磷酰胺(CP)，山西普德藥業有限公司生產，產品批號：20140703，國藥準字H14023686；小牛血清：浙江天杭生物科技有限公司，批號：130919；甲醇(分析純)，1%伊紅染色液，Giemsa染液。CX2型OLYMPUS顯微鏡、電子天平、注射器、乳頭吸管、解剖剪、鑷子、灌胃針頭。1.2 實驗動物 清潔級健康ICR小鼠，體重18～20 g，購自揚州大學比較醫學中心。動物生產許可證號：SCXK(蘇)2007-0001，使用許可證號：SYXK(蘇)2007-0005。小鼠自由采食和飲水，飼料和飲水均符合動物飼養標準。試驗前在實驗動物房環境中適應性飼養1周，灌胃前停食12 h，不限制飲水。

1.3 劑量設計及分組 ICR小鼠120只，精子畸形試驗組60只，全部為雄性；骨髓微核試驗組60只，雌雄各半。小鼠隨機分為試驗高、中、低劑量組，陽性對照組和陰性對照組，每組12只。沙咪珠利對小鼠經口染毒的半數致死量(LD50)≥5000 mg/kg，依據沙咪珠利LD50，試驗時設2500 mg/kg(高)、1250 mg/kg(中)、625 mg/kg(低)3個劑量組。陽性對照組選用40 mg/kg環磷酰胺，陰性對照組選用無菌水[2,4]。

1.4 小鼠精子畸形試驗 各試驗組每天給藥1次，連續5 d，首次給藥后第35天頸椎脫臼法處死小鼠，每個試驗組選用10只小鼠，取附睪制片。低倍鏡找到背景清晰、精子重疊較少的部位，高倍鏡下檢查精子形態，每只動物檢查1000個精子，對畸形精子進行分類計數并統計精子畸形率[4-6]。1.5 小鼠骨髓細胞微核試驗 各試驗組分別連續2次給藥，間隔時間24 h，第二次染毒后6 h頸椎脫臼法處死小鼠，取胸骨骨髓制片，選擇細胞完整、分散均勻、染色良好的區域在油鏡下計數。每只動物計數1000個嗜多染紅細胞(PCE)，分別計算雌、雄小鼠各試驗組的PCE/RBC比值和PCE微核率[4,5,7]。

2 結果與分析

2.1 小鼠精子畸形試驗 沙咪珠利的小鼠精子畸形試驗結果見表1，從表中可以看出，沙咪珠利的三個劑量組的精子畸形率經統計學處理與陰性對照組比較,差異不顯著(P>0.05)，而陽性對照組與三個給藥劑量組、陰性對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，差異極顯著。

組別劑量/(mg·kg-1)動物數檢查精子數畸形精子類別無鉤香蕉形無定形胖頭尾折疊雙頭形雙尾形畸形精子總數畸形精子數(x±SD)精子畸形率/%陰性對照無菌水1010×10006421111855622022.00±1.412.12±0.13受試物25001010×10007117107875722222.20±1.752.14±0.1512501010×10006418110766721821.80±1.402.11±0.136251010×10006516118554621921.90±1.972.11±0.19陽性對照(CP)401010×1000143832421917152554454.40±3.985.07±0.35**

注：同列數據無肩標表示試驗組與陰性對照組相比，差異不顯著(P>0.05)，**表示試驗組與陽性對照組相比，差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗 實驗結果見表2。各組嗜多染紅細胞與成熟紅細胞比值(PCE/RBC)在正常范圍內。沙咪珠利三個劑量組雌、雄小鼠骨髓含微核嗜多染紅細胞(PCE)率與陰性(溶劑)對照組比較，差異不顯著(P>0.05)，而陽性對照組與試驗組、陰性對照組微核率比較(P<0.01)，差異極顯著，差異有統計學意義。受試物同一劑量組內雌、雄小鼠之間的微核無明顯的性別差異。

組別劑量/(mg·kg-1)動物數檢查PCE數PCE/RBC比值PCE微核率/‰雄性雌性雄性雌性陰性對照無菌水550001.09±0.051.05±0.042.97±0.692.96±0.72高劑量2500550001.07±0.061.02±0.013.16±0.813.16±0.80中劑量1250550001.11±0.061.04±0.012.96±0.982.96±0.97低劑量625550001.06±0.041.05±0.073.16±0.862.98±0.71陽性對照(CP)40550001.08±0.071.02±0.0215.65±1.51**15.95±1.67**

3 討論與小結

精子畸形是指精子的形狀改變和畸形精子數量增多。正常情況下，人或哺乳動物的精液中可能存在少量畸形精子[8]。正常小鼠的精子畸變范圍一般在0.8%～3.4%[9]。小鼠精子畸形試驗可檢測環境因子對精子畸形生成、發育的影響，而且對已知的生殖細胞致突變物有高度敏感性，故此實驗適用于檢測新型三嗪類抗球蟲藥沙咪珠利在體內對生殖細胞的致突變作用。不同品系小鼠的精子畸形率基礎值差異較大，綜合統計分析表明ICR小鼠自發畸變率低，更適合作為小鼠精子畸形試驗材料[10]。從精子畸形實驗結果可知，精子畸形主要發生在頭部，類型主要是無定型和無溝型，與蔣英芝等[11]研究結果一致。沙咪珠利各劑量組的精子畸形率與陰性對照組比較差異不顯著，而與陽性對照組比較差異極顯著，差異有統計學意義，說明在本實驗條件下，沙咪珠利對小鼠精子畸形無影響。馮秀娟[12]報道的妥曲珠利對小鼠精子畸形研究結果與本實驗結果相似，張奧博等[13]報道的近年開發的新型三嗪類化合物納川珠利對小鼠精子畸形研究也有相似結果。

微核的形成往往是受到細胞遺傳毒物作用的結果，微核率的變化可反映所檢測藥物的遺傳毒性。微核試驗是新藥、食品添加劑、農藥、化妝品等毒理學安全性評價的必做試驗[14]。余明澤等[15]研究表明胸骨骨髓的微核率高于股骨骨髓，染毒30 h的微核率高于24 h和48 h，故小鼠骨髓細胞微核試驗可優先選用胸骨髓制片染毒30 h檢測。從骨髓細胞微核試驗結果可知，沙咪珠利各劑量組雌、雄小鼠骨髓含微核嗜多染紅細胞(PCE)率與陰性(溶劑)對照組比較差異不顯著，而與陽性對照組微核率比較差異極顯著，且受試物同一劑量組內雌、雄小鼠之間微核無明顯的性別差異。說明在本實驗條件下，沙咪珠利不能引起小鼠骨髓細胞微核增加。

小鼠精子畸形和骨髓細胞微核試驗均屬于體內試驗，遺傳毒性試驗同時還研究了沙咪珠利對體外中國倉鼠肺細胞染色體畸變的影響，實驗結果顯示受試物組與陰性對照組比較均無差異。因此可判斷沙咪珠利不具有遺傳毒性，此結果為沙咪珠利后續的毒理研究和臨床應用研究提供了參考資料。

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(編輯：侯向輝)

Effects of Ethanamizuril on Sperm Deformity and Bone Marrow Cell Micronucleus of Mice

WANG Dong-liang1, NIE Qiao1, LI Long-fei1, LI Yu-chen1, CHEN Hong-yu1, CHEN Xiu-yun2, BU Shi-jin1

(1.VeterinaryMedicineCollege,YangzhouUniversity,Yangzhou，Jiangsu225009,China；2.MedicineCollege,YangzhouUniversity,Yangzhou，Jiangsu225001,China)

In order to evaluate the security of ethanamizuril, the sperm deformity and bone marrow cell micronucleus of ethanamizuril, healthy ICR mice were randomly divided into sample high group, sample medium group, sample low group, positive control group and negative control group, made sperm abnormality test and bone marrow micronucleus test, then calculated the sperm deformity rate and micronucleus rate. The results showed that ethanamizuril in each group was no statistical differences compared with negative control group (P>0.05). When compared with positive control group, the differences was statistically significant (P<0.01). Indicated ethanamizuril has no effect on sperm deformity and bone marrow cell micronucleus of mice, it has no genetic reproductive toxic to mice.

ethanamezuril; sperm deformity; bone marrow cell micronucleus

江蘇高校優勢學科建設工程(PAPD)

王東亮，碩士，從事獸醫藥理及毒理學研究。聶巧，碩士，從事獸醫藥理及毒理學研究，為共同第一作者。

卜仕金。E-mail：pushijin@aliyun.com

2016-02-24

A

1002-1280 (2016) 04-0045-03

S859.796