高效液相色譜-二極管陣列檢測器用于獸藥非法添加物質檢查的優劣性分析

韓寧寧，徐嫄，于麗娜，張璐，戴青，趙暉

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

高效液相色譜-二極管陣列檢測器用于獸藥非法添加物質檢查的優劣性分析

韓寧寧，徐嫄，于麗娜，張璐，戴青，趙暉*

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

闡述了高效液相色譜-二極管陣列檢測器在獸藥非法添加物質檢查應用中的優勢與局限：其優勢在于方法特異性強、儀器普及面廣、操作簡單；局限在于無法鑒別光譜圖庫外的未知化合物，部分化合物在不同色譜條件下光譜圖差異大難溯源，無法檢出無紫外吸收的化合物。另外，進一步對應用該法的發展趨勢進行了展望，以期對獸藥非法添加打擊治理工作提供參考。

獸藥；非法添加；高效液相色譜-二極管陣列檢測器；優勢；局限；發展趨勢

隨著獸藥產業市場競爭的激烈化，某些獸藥生產企業為了降低生產成本，或者提高產品的治療效果，在獸藥制劑中非法添加處方外成分，甚至添加國家明令禁止使用的成分，對獸藥行業的健康發展帶來了極為惡劣的影響。近年來，國家對獸用藥品處方外非法添加的打擊力度逐年增大。2014-2015年，農業部連續兩年將獸用抗菌藥處方外非法添加專項檢查作為全國農產品質量安全監管工作重點之一，2015年7月，出臺《全國獸藥(抗菌藥)綜合治理五年行動方案》，明確要求強化非法獸藥查處力度。與此同時，以高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-PDA)為主導的獸藥處方外非法添加檢查方法也日益成熟，農業部目前頒布的相關公告中大部分涉及該法[1-11]。本文通過總結日常檢驗工作中使用HPLC-PDA法進行非法添加物質檢查的經驗，歸納出該法在相關應用中的優勢與不足，并對非法添加物質檢查的發展趨勢進行了展望。

1 HPLC-PDA在獸藥處方外非法添加物檢查應用中的優勢

1.1 方法特異性強，不易誤判 具有紫外發色團的常見獸用化學藥品的紫外光譜圖信息特異性強，且可根據光譜形狀大致分類(如解熱鎮痛類、磺胺類、氟喹諾酮類等獸藥)，易于非法添加物的初步分類判斷。通過保留時間與紫外光譜圖的對比可基本鎖定目標添加物，再通過液相軟件中的純度判斷功能與PDA光譜匹配功能，可進一步確認目標添加物，不易造成誤判錯判。

1.2 儀器普及面廣，利于推廣應用 高效液相色譜法作為一種分離效率高、選擇性好、操作自動化的儀器方法，自20世紀60年代后期發展起來后得以迅速推廣，現行的二〇一〇年版《中國獸藥典》中收載的抗菌藥，具有紫外吸收且成分單一的品種，大多采用HPLC法。而20世紀80年代發展起來的二極管陣列檢測器，由于一次進樣可以得到豐富的定性定量信息，數據處理快速簡便，已逐漸發展為高效液相色譜儀的標準配置。相對于液相質譜聯用儀動輒上百萬的采購價格，HPLC-PDA幾十萬甚至國產儀器十幾萬的價格更易于為檢驗單位所接受。目前我國的獸藥檢驗領域，從國家所至市級所，以及各大中型獸藥企業，HPLC-PDA已較為普及。儀器的普及面廣，是檢驗方法得以推廣應用的根基。

1.3 操作簡單，對人員環境要求低 相對于MS復雜的配置與參數調節，HPLC-PDA組成相對簡單，實驗涉及的參數選擇也僅有流速、柱溫、波長、進樣量等幾個，實驗人員經相應培訓后即可操作。儀器放置于普通分析實驗室即可，不需要特殊的防塵、降噪及恒溫環境。

2 HPLC-PDA在獸藥處方外非法添加物檢查應用中的局限

2.1 PDA光譜圖庫覆蓋面有限，無法鑒別庫外的化合物 作為非法添加物檢查方法研究的牽頭單位，中監所化藥室目前已建立了70余個品種的常見獸用化學藥品PDA光譜圖庫。然而，根據目前的檢驗結果可知，非法添加物的涉及范圍是十分廣泛的，人用藥(如沙丁胺醇[7]、頭孢噻肟[11]等)及具有抗菌作用的輔料(如苯甲酸等)均有檢出。相對于多級裂分的高分辨質譜能夠提供精確分子量與碎片離子峰而言，PDA僅能提供未知物的光譜圖及最大吸收波長等信息，對于光譜圖庫外的未知添加物的結構解析信息指向性較差。雖然通過擴充光譜圖庫可以使其覆蓋面增大，但僅憑光譜圖這一信息對于未知添加物的結構推斷而言信息量過少。

2.2 部分化合物在不同色譜條件下光譜圖差異較大，難以溯源 結構中含有對酸性或堿性條件不穩定的基團(如β-內酰胺環、酰胺鍵等)的化合物，可能受酸性或堿性流動相的影響而降解，產生的色譜圖實際上是降解物的色譜圖。我們在檢驗中即發現，頭孢噻肟(結構中含有β-內酰胺環)在酸性色譜條件[磷酸溶液-乙腈(取磷酸3.0 mL，加水至1000 mL，用三乙胺調pH值至3.0，加乙腈53 mL，搖勻)為流動相A，乙腈為流動相B，甲醇為流動相C，A∶B∶C為85.5∶5.0∶9.5]下的光譜圖與在中性色譜條件[磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉3.0 g，加水1000 mL使溶解，加三乙胺0.5 ml，用飽和氫氧化鈉溶液調節pH值至7.0)-甲醇(70∶30)]下的光譜圖不完全一致，參見圖1-圖2。分析可能是由于酸性色譜條件導致β-內酰胺環3號位的側鏈斷裂，降解物的紫外發色團與頭孢噻肟有差異所致(圖3)。雖然目前的光譜數據庫中已包含了目標化合物的色譜條件，但對于未知化合物，當不同色譜條件下光譜圖變化較大，又沒有考慮色譜條件酸堿性的影響時，很難僅通過光譜圖對未知添加物進行溯源。

圖1 頭孢噻肟在中性色譜條件下的光譜圖(待發表)

圖2 頭孢噻肟在酸性色譜條件下的光譜圖(待發表)

圖3 頭孢噻肟在酸性色譜條件下降解原理示意圖(待發表)

2.3 無法檢測沒有紫外吸收的未知添加物，容易造成漏篩 PDA檢測器僅對具有紫外發色團的化合物產生響應，對沒有紫外吸收的化合物僅有少數品種(如卡那霉素[12]、鹽霉素[13])可通過柱前或柱后衍生法進行檢測。農業部目前發布的非法添加物檢查公告中，沒有一項是針對無紫外吸收的化合物。采用該法進行篩查，對于無紫外吸收的化合物，尤其是抗生素類(如大環內酯類、氨基糖苷類、聚醇醚類等)容易造成漏篩。

3 應用HPLC-PDA進行非法添加物檢查的發展趨勢

3.1 進一步擴大完善光譜圖庫，加強推廣普及光譜圖庫的覆蓋面決定了篩查范圍的大小。隨著非法添加物檢查工作的推進，我們正不斷的將新發現添加物的光譜圖補充進數據庫，將數據庫圖譜整理成冊的工作也正在進行中。然而，在全國范圍內進行非法添加物的長期專項打擊治理，還需要各省市級獸藥檢驗單位的積極參與與信息共享。

3.2 建立常見獸用化學藥品質譜數據庫，形成PDA-MS聯合篩查新常態 雖然UPLC-MS法在非法添加物質檢查中已有所應用[14-16]，但目前農業部批準的涉及該法的公告僅2個，尚未形成法律體系，難以形成打擊力度。目前農業部發布的非法添加物檢查公告中，涉及UPLC-MS法的僅有兩個方法[9]。目前常見獸用化學藥品多級高分辨質譜數據庫的信息尚不完善，難以形成篩查規模。因此急需建立獸用化學藥品，尤其是沒有紫外吸收的化學藥品質譜數據庫，以完成PDA篩查后的MS二級篩查，進一步避免漏篩。

3.3 引入近紅外光譜、拉曼光譜等快速篩查方法的預篩機制 近紅外光譜及拉曼光譜由于操作簡便快速、無需更多樣品前處理步驟而在人用藥品非法添加物質檢查中得以應用[17]，二者適于安在快檢車中執行飛行檢查、專項檢查等特殊任務。然而，目前在獸用藥品非法添加物質檢查領域，二者均未得到應用。若將二者引入PDA篩查之前的預篩步驟，可快速鎖定非法添加可疑樣品，再應用PDA進行進一步驗證，可較大程度的提高非法添加物質篩查工作效率。

[1] 中華人民共和國農業部公告第1848號. 黃芪多糖注射液中非法添加解熱鎮痛類、抗病毒類、抗生素類、喹諾酮類等11種化學藥物(物質)檢查方法和肥豬散、健胃散、銀翹散等中獸藥散劑中非法添加氟喹諾酮類化學藥物(物質)檢查方法[S].2012.

[2] 中華人民共和國農業部公告第1868號. 氟喹諾酮類制劑中非法添加乙酰甲喹、喹乙醇等化學藥物檢查方法[S].2012.

[3] 中華人民共和國農業部公告第1924號. 氟苯尼考粉和氟苯尼考預混劑中非法添加氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星的檢查方法[S].2013.

[4] 中華人民共和國農業部公告第1934號. 氟苯尼考制劑中非法添加磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶的檢查方法[S].2013.

[5] 中華人民共和國農業部公告第1956號. 乳酸環丙沙星注射液中非法添加對乙酰氨基酚檢查方法[S].2013.

[6] 中華人民共和國農業部公告第2085號. 阿莫西林可溶性粉中非法添加解熱鎮痛類藥物檢查方法[S].2014.

[7] 中華人民共和國農業部公告第2508號.注射用青霉素鉀(鈉)中非法添加解熱鎮痛藥物檢查方法等11個獸藥非法添加化學藥物(物質)檢查方法[S].2014.

[8] 中華人民共和國農業部公告第2278號.魚腥草注射液中非法添加甲氧氯普胺檢查方法[S].2015.

[9] 中華人民共和國農業部公告第2320號.魚腥草注射液中非法添加林可霉素檢查方法等3個獸藥非法添加化學藥物(物質)檢查方法[S].2015.

[10]中華人民共和國農業部公告第2333號.扶正解毒散中非法添加茶堿、安乃近檢查方法等5個獸藥非法添加化學藥物(物質)檢查方法[S].2015.

[11]中華人民共和國農業部公告第2353號.硫酸安普霉素可溶性粉中非法添加頭孢噻肟檢查方法[S].2016.

[12]張明媛，常靚，劉長海，等.柱前衍生化高效液相色譜法檢測硫酸阿米卡星注射液中卡那霉素含量的改進[J].藥學實踐雜志，2013，31(5)：343-346.

[13]徐恩民，劉少寧，李淑花，等.高效液相色譜法測定鹽霉素預混劑中鹽霉素A的含量[J].中國獸藥雜志，2013，47(8)：52-54.

[14]胡興娟，吳寧鵬，董瑞靜，等.UPLC-MS/MS測定4種獸藥制劑中非法添加阿托品的方法研究[J].中國獸藥雜志，2014，48(11)：49-52.

[15]魏秀麗，高迎春，張傳津，等.UPLC-MS/MS法測定中獸藥中非法添加物金剛烷胺[J].中南藥學，2014，12(4)：363-366.

[16]高迎春，魏秀麗，楊林，等.TLC及UPLC-MS/MS法檢測中獸藥散劑中磺胺類藥物[J]. 中獸醫醫藥雜志，2010，(3)：41-44.

[17]韓瑩.非法添加藥物成分快速檢測方法研究及應用進展[J]. 中國藥物濫用防治雜志，2015，21(2)：106-110.

(編輯：李文平)

Advantages and Disadvantages of HPLC-PDA Method Used in the Inspection of Illegal Adulteration in Veterinary Drugs

HAN Ning-ning, XU Yuan, YU Li-na, ZHANG Lu, DAI Qing, ZHAO Hui*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

The advantages and disadvantages of HPLC-PDA method used in the inspection of illegal adulteration in veterinary drugs were elaborated. This method has good specificity, widespread popularity, and simple operation. However it cannot identify the unknown compounds out of PDA spectral library or compounds without UV absorption, and some compounds which have different PDA spectra under different chromatographic conditions are difficult to trace. The development trend of the application of this method was prospected in order to provide reference for the renovation of illegal adulteration in veterinary drugs.

veterinary drugs; illegal adulteration; HPLC-PDA; advantages; disadvantages; development trend

韓寧寧，碩士，從事抗生素檢驗檢測工作。

趙暉。E-mail:171977364@qq.com

2016-01-28

A

1002-1280 (2016) 04-0066-04

S859.79