犬骨髓間充質干細胞體外分離培養及分化鑒定

蒲超，張珊珊，李偉，吳青霞，吳輝

(1.川北醫學院第二臨床學院·南充市中心醫院骨科；2.川北醫學院第二臨床學院·南充市中心醫院神經內科，四川 南充 637000)

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犬骨髓間充質干細胞體外分離培養及分化鑒定

蒲超1，張珊珊2，李偉1，吳青霞1，吳輝1

(1.川北醫學院第二臨床學院·南充市中心醫院骨科；2.川北醫學院第二臨床學院·南充市中心醫院神經內科，四川 南充 637000)

目的：建立犬骨髓間質干細胞(dog bone mesenehymal stem cells，dBMSCs)的體外分離、培養、純化及鑒定的方法。方法：采用密度梯度離心法結合貼壁篩選法分離dBMSCs，并通過不斷傳代進行純化和擴增培養。誘導dBMSCs向成骨、成脂細胞分化，并分別以礦化(鈣)結節茜素紅染色、油紅O染色鑒定。結果：dBMSCs 在體外分離培養擴增，形態呈長梭形成纖維細胞樣，通過成骨、成脂誘導分化鑒定其為dBMSCs。結論：密度梯度離心法結合貼壁篩選法能有效的獲取dBMSCs，所分離培養的dBMSCs同時具有多向分化潛能，是組織工程研究中理想的種子細胞。

組織工程；骨髓間充質干細胞；分離；培養；誘導；分化

骨髓間充質干細胞(bone mesenehymal stem cells，BMSCs)具有較強的增殖能力，多向分化的潛能，而且取材方便、細胞移植后無明顯的移植物抗宿主反應，體外基因轉染率高，能穩定高效的表達轉染基因，被認為是理想的組織工程種子細胞[1-5]。但其在成熟的骨髓中占比例很小，僅占有核細胞的0.001%～0.606%[4]，體外培養不易獲得純化的BMSCs。本實驗建立一種操作簡便、費用低廉、高效分離培養BMSCs的方法，并成功誘導其向成骨、成脂細胞分化。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雜交犬3只，由川北醫學院動物中心提供，30～34周齡，雌雄不限，體重(18±2.2)kg，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.2 主要試劑

Percoll犬淋巴細胞分離液(密度1.073 g/mL)，天津TBD公司；低糖-DMEM(L-DMEM)培養基，美國Sigma公司；胎牛血清，澳大利亞PAA公司；胰酶，美國Sigma公司；EDTA，美國Sigma公司；DMSO，美國Sigma公司。

1.3 dBMSCs的體外分離

以3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)腹腔內麻醉雜交犬，用內含1 mL肝素鈉(3 000 U/mL)的26號骨髓穿刺針刺入髂后上棘，分2～3點抽取骨髓5～8 mL。

1.4 dBMSCs原代培養

上述骨髓標本沿離心管壁緩慢注入到已含4 mL淋巴細胞分離液的2個離心管中，3 000 r/min，離心30 min，緩慢小心吸取中間界面乳白色云霧狀單個核細胞層，加入37 ℃，10 mL PBS液洗2次(2 000 r/min，離心5 min)，加入含10%FBS L-DMEM培養基，以1×108/L密度接種于培養瓶中，37 ℃、5% CO2細胞孵育箱中培養，48 h 后半量換液，72 h后棄去培養基和未貼壁細胞，PBS清洗2次，全量換液，以后每3 d換液1次。

1.5 dBMSCs傳代擴增培養

原代細胞接近80%～90%匯合時，用0.25%胰蛋白酶(含0.03% EDTA )于37 ℃消化90 s，待細胞形態開始皺縮、細胞間隙開始增大時，加入含10%FBS的L-DMEM培養液1.5～2 mL終止消化，并加入3～5 mL PBS，吸管輕輕吹打培養瓶壁，使細胞充分脫落，細胞懸液移入離心管，1 000 r/min，離心3 min，棄上清，沉淀含10%FBS的L-DMEM培養液，按1∶2比例傳代培養，細胞匯合至80%～90%匯合時再次傳代培養。

1.6 dBMSCs形態學觀察

原代及傳代培養的細胞，用倒置相差顯微鏡觀察細胞生長、增殖情況及形態特征。

1.7 dBMSCs的凍存與復蘇

取已匯合達80%～90%的第2代dBMSCs，經消化、離心、收集，用含10%FBS的 L-DMEM培養液調整細胞密度為6×109/L。將細胞凍存液(DMSO∶FBS=1∶3)緩慢滴入同體積的含dBMSCs的上述細胞懸液中，搖勻，DMSO的終濃度為12.5%，dBMSCs的終密度為3×109/L。

dBMSCs的凍存及復蘇應慢凍快融,置于-4 ℃冰箱2 h，置-30 ℃冰箱2 h，置-80 ℃冰箱過夜后取出凍存管直接放入液氮中保存；復蘇時將凍存管從液氮或-80 ℃冰箱中取出，立即置37 ℃水浴并輕輕搖動，1～2 min內迅速解凍。復蘇后的dBMSCs用含10%FBS的L-DMEM培養液培養，觀察其存活情況及形態變化。

1.8 dBMSCs向成骨細胞誘導分化及鑒定

取第3代狀態良好的dBMSCs，以1×104/cm2

接種于24孔板，培養1 d后將培養液更換成含成骨誘導劑的L-DMEM誘導培養液(含100 nM地塞米松，β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、維生素C 50 μg/mL)培養，每3天換液， 21 d后行培養板的礦化(鈣)結節茜素紅染色：PBS緩沖液洗2遍，4 ℃95%乙醇固定10 min，PBS洗3次后，加入0.1%茜素紅-Tris-HCL染液(pH8.3)1 mL，于37 ℃染色30 min，再用PBS洗3次，自然干燥后肉眼及鏡下觀察。

1.9 dBMSCs向成脂肪細胞誘導分化及鑒定

將第3代dBMSCs以1×104/cm2接種于24孔板，待細胞貼壁生長、融合達90%時，加入用成脂誘導液(5%FBS的L-DMEM培養基，100 nM地塞米松,0.5 mM IBMX,50 mM吲哚美辛，0.01 mg/mL胰島素，50 μg/mL抗壞血酸)誘導培養兩周，每4 d換液1次。兩周后倒置顯微鏡下觀察脂滴形成情況，2.5%戊二醛固定15 min后行油紅O染色,倒置顯微鏡下觀察拍照。

2 結果

2.1 dBMSCs原代及傳代培養

犬dBMSCs原代培養細胞48 h，倒置顯微鏡下觀察，在絕大多數圓形細胞的背景中出現出現少許變形細胞，呈橢圓形伴有胞質突起(圖1)。培養第72 h，鏡下見稀疏的略呈梭形細胞、多角形，胞體變大，視野內單個核細胞漂浮生長，密度減小(圖2)。培養第5天，鏡下見形態一致的長梭形細胞，呈群落狀生長(圖3)。培養第7天，可見細胞開始增殖呈集落生長，漩渦狀排列明顯，細胞群落增大，群落中央細胞排列整齊，外圍逐漸稀疏(圖4)。培養第11天，整個培養瓶底見形態一致的長梭形細胞，可觀測到多個漩渦(圖5)。傳代培養后1 d，細胞多數呈梭形，少數呈多角形生長，分布一致，均勻鋪滿瓶底(圖6)，未見原代細胞培養時出現的集落樣生長，傳代后細胞增殖速度明顯加快，匯合達80%～90%需5～6 d。懸浮生長的單個核細胞、血細胞隨多次換液而逐漸被去除。

2.2 成骨誘導培養21 d后行培養板的礦化(鈣)結節茜素紅染色

成骨誘導培養21 d后行培養板的礦化(鈣)結節茜素紅染色，鏡下顯示深紅色礦化結節(圖7)。

2.3 成脂誘導后行油紅O染色

鏡下細胞形態呈類圓形，體積變大，細胞質內出現圓形橘紅色脂肪小滴，淺藍色胞核被擠于細胞一側或中央(圖8)。

3 討論

目前對BMSCs的分離純化和擴增方法有：(1)全骨髓貼壁篩選法：根據BMSCs在塑料培養材質上貼壁生長的特性，通過定期換液除去不貼壁細胞，實現BMSCs的分離、純化；(2)密度梯度離心法：根據骨髓中各細胞成分比重的不同，使用淋巴細胞分離液提取單個核細胞，再進行貼壁培養而分離、純化BMSCs；(3)流式細胞儀分選法：根據BMSCs的細胞表面標記，利用相應的熒光素標記抗體進行篩選；(4)免疫磁珠法：利用BMSCs的細胞表面抗原與連接有磁珠的特異性單抗相結合，在磁場作用下分離細胞；(5)細胞篩選法：即根據細胞大小從骨髓中篩選BMSCs。目前比較公認的BMSCs鑒定標識是不表達造血細胞系的表面抗原，如CD14、CD34 CD38 CD45 等，也不表達淋巴細胞的表面抗原，如CD11a、CD11b等，而在不同的生長階段表現出不同的基質細胞表面抗原及細胞因子受體，如SH2、SH3、CD29、CD44、CD166。但由于目前仍未找到BMSCs特異性的細胞表面標記，故利用流式細胞儀分選法以及免疫磁珠法分離鑒定BMSCs缺乏特異性，鑒定困難，且這兩種方法存在對細胞活性影響大，甚至可以導致細胞完全失活，存在純化后培養困難，實驗條件要求高、費用貴、需要骨髓量大等缺點，目前應用較少。BMSCs在全骨髓中比例很低，細胞篩選法效率低。貼壁法是BMSCs最初的分離培養方法，是由Friedenstein在19世紀70年代中期建立的，至今該方法仍是一種得到廣泛應用的經典途徑[6]。密度梯度離心法不影響細胞活性，但不能排除混雜的成纖維細胞、單核/巨噬細胞等非目的細胞。密度梯度離心結合貼壁培養法，以密度梯度離心有效地除去絕大部分造血細胞，獲得純度較高的單個核細胞，然后根據BMSCs與血系細胞貼壁性能的差異，培養過程中多次更換培養液可去除懸浮生長的血細胞等雜質，最終得到貼壁生長的BMSCs[7-8]。此法操作簡便、費用低廉、效果切實可靠，為一種高效的分離培養BMSCs選擇，在BMSCs的分離、純化過程中被廣泛采用。試驗表明密度梯度離心結合貼壁培養法獲得的BMSCs可傳十多代，仍能保持旺盛的生長和增殖能力。吳勝東等[9]報道采用密度梯度離心結合貼壁培養的方法分離BMSCs純度可達97.7%。

目前BMSCs鑒定方法主要是通過在培養過程中出現分化表型，然后逆推得知是否為BMSCs。多向分化潛能被認為是BMSCs最重要的生物學特征，而決定分化方向的關鍵就是誘導分化的條件，在不同的誘導條件下可向骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、肌細胞和內皮細胞等多種細胞系轉化[10]。誘導分化的機制和條件目前尚未明確，多數觀點認為，BMSCs分化方向與微環境密切相關，不同組織的細胞微環境具有不同的誘導因子，這可能是進入不同組織的BMSCs獲得靶組織的表型，向不同細胞譜系分化的主要原因之一[11-13]。目前，BMSCs體外分化誘導的方法主要有兩種：一是用抗氧化劑作為誘導劑如一巰基乙醇、二甲基亞砜、丁羥醚等[14-15]；二是用生長因子作為誘導劑，如血小板衍生生長因子、表皮細胞生長因子、胰島素樣生長因子等[16-17]。BMSCs具有強大的分化潛能，通過體外培養及誘導分化的方法，由BMSCs可以獲得大量的組織工程種子細胞，滿足臨床治療需要的干細胞來源。

BMSCs有著廣泛的應用前景，但是目前還存在著有待解決的問題：(1)進一步改進BMSCs的分離提取方法，以提高其純度[18]；(2)BMSCs在不同的生長階段變現出不同的標志性抗原，缺乏特異性，鑒定困難；(3)因為BMSCs具有三系分化潛能，其應用需實現精確、高效的誘導分化；(4)BMSCs隨著傳代次數的增多易于失去分化潛能；(5)隨著細胞傳代次數的增加，細胞分化增值潛能下降。因此，建立高效、精確的BMSCs體外分離、培養、誘導分化方法，以及延緩細胞衰老是今后的研究重點。

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(學術編輯：敬保遷)

Isolation,culture,differentiation and identification of dog mesenehymal stem cells in vivo

PU Chao1,ZHANG Shan-shan2,LI Wei1,WU Qing-xia1,WU Hui1

(1.DepartmentofOrthopaedics；2.DepartmentofNeurology,NanchongCentralHospital,SecondClinicalMedscalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege，Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective：To establish a method for isolation，culture，differentiation and identification of bone mallow mesenchymal stem cells(BMSCs) from dog. Methods：dBMSCs were isolated by combination of gradient centrifugation and adherent wall culture，and induced their differentiation into osteoblasts and adipocytes which were identified by histoehemistry staining and oil red staining.Results：The cultured adherent cells showed spindle and polygonal shape.The identification of dBMSCs was carried out by alizarin red staining after induction of osteoblasts and alkaline phosphatase staining after induction of adipocytes.Conclusion：dBMSCs were isolated and cultured successfully from dog ilium bone marrow by combination of gradient centrifugation and adherent wallculture,which possess multi-directional differentiation potential,is the ideal seed cells in tissue engineering research.

Tissue engineering;Bone mesenehymal stem cells;Isolation;Culture;Induce;Differentiation

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.06.001

川北醫學院科研發展計劃項目(CBY11-A-QN09)

2016-08-13

蒲超(1984-)，男，碩士，主治醫師。E-mail：puchao3310@sina.com

李偉，E-mail: subjwdice@126.com

時間：2017-1-3 22∶01

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170103.2201.002.html

1005-3697(2016)06-0782-04

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