糖尿病性神經痛大鼠脊髓背角突觸數量的體視學研究

林菁艷，陳靜，黃三，林靜，馬丁，彭彬

(1.川北醫學院附屬醫院麻醉科，川北醫學院麻醉學系；2.南充市中心醫院；3.川北醫學院細胞化學研究室，四川 南充 637000)

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糖尿病性神經痛大鼠脊髓背角突觸數量的體視學研究

林菁艷1，陳靜2，黃三1，林靜1，馬丁1，彭彬3

(1.川北醫學院附屬醫院麻醉科，川北醫學院麻醉學系；2.南充市中心醫院；3.川北醫學院細胞化學研究室，四川 南充 637000)

目的：探討糖尿病性神經痛(painful diabetic neuropathy,PDN)大鼠脊髓背角突觸數量的變化。方法：10只健康成年雄性SD大鼠，隨機分為兩組(n=5)：PDN組和對照組(C組)。PDN組采用腹腔注射6%STZ 60 mg/kg建立糖尿病大鼠模型，C組腹腔注射等容生理鹽水。注射后72 h測定空腹血糖(FBG)，以FBG>11.1 mmol/L為糖尿病建模成功。注射STZ前1 d及血糖升高后第4、7、14、28 天分別測定大鼠的機械痛閾。第28天測痛后取L5段脊髓，進行突觸素免疫組織化學染色，采用光學體視框交替計數一側脊髓背角內突觸的數量。結果：PDN組大鼠FBG均達糖尿病診斷標準，自FBG升高后 4 d開始痛閾降低，至28 d時未恢復。與C組比較，PDN組L5節段脊髓背角內突觸數量增加(P<0.05)。結論：PDN大鼠脊髓背角突觸數量增加，突觸數量增加可誘導PDN的發生。

糖尿病性神經痛；中樞敏化；突觸可塑性；骨髓背角

糖尿病性神經痛(painful diabetic neuropathy,PDN)是神經病理性疼痛的一種類型，是糖尿病常見的并發癥之一。其主要表現為感覺麻木，自發性疼痛，痛覺過敏和異常疼痛[1]等。文獻報道，其發病率為20%～47%[2-3]，長期慢性疼痛嚴重影響患者的生活。由于目前對其發病機制了解不多，故而臨床治療滿意度并不高。過去曾認為其發生機制主要為周圍神經病變，外周神經敏化。目前，越來越多的研究顯示，PDN的發生不僅存在周圍神經系統病變，中樞神經系統的可塑性改變(中樞敏化)也是其可能機制[4-5]：PDN大鼠脊髓背角內谷氨酸能神經元興奮性突觸后電位增強[6]，N-甲基-D天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體和γ-氨基丁酸B(GABAB)受體失衡[6]，脊髓背角內傷害感受性神經元回路改變[7]及感覺神經傳入纖維增多[8]。據此我們推測：上述脊髓背角內的可塑性變化，可能造成PDN大鼠脊髓背角內感覺神經元之間建立新的突觸聯系，導致突觸數量增加，從而導致脊髓背角內感覺神經元興奮性增強，感受野擴大，其相應的外周感受野對同樣刺激的感受增強，閾值降低，進而引起自發性疼痛、痛覺過敏和異常疼痛，導致PDN的發生發展和維持。目前尚未見PDN大鼠脊髓背角內突觸數量的相關報道。因此，本研究擬采用體視學方法——光學體視框來觀測PDN大鼠脊髓背角內突觸和神經元數量的變化，為PDN發生的中樞敏化機制增添新的解剖學資料。

1 方法

1.1 動物選擇及分組

健康成年SD雄性大鼠10只，體重220～250 g，由川北醫學院實驗動物中心[許可證號：SCXK(川)2008-18]提供。隨機分為兩組(n=5)：PDN組和生理鹽水對照組 (C組)。所有動物單籠喂養，自由進食飲水，晝夜交替。適應3 d后進行實驗。對動物的所有處理均符合本院倫理委員會關于實驗動物倫理學要求。

1.2 糖尿病大鼠模型的制備

所有動物適應性喂養3 d后禁食12 h，分別經腹腔注射6% STZ (sigma公司，美國)60 mg/kg和等容積的生理鹽水。72 h后取尾靜脈血，以強生倍優型血糖儀及配套試紙測定大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，以FBG>11.1 mmol/L為糖尿病造模成功標志[9-11]。

1.3 機械痛閾測定

分別于注射STZ前1 d、FBG升高后第1、7、14、28 天時采用動態平板Von Frey測痛儀(Ugo Basil，37450，意大利)采用改良“up and down”法測定大鼠雙側后足的50%縮腿閾值[12-14](PWT)：將大鼠放在一鐵絲網架上，用透明塑料觀察框罩住。待大鼠適應環境15 min，并處于清醒、安靜狀態(無走動，無洗臉、瘙癢等動作)，以測痛儀依次交替刺激大鼠一側后肢第4、5趾底，從低到高選擇刺激力度，刺激力度從10 g開始，若無反應，則以2 g的間距逐漸增加刺激力度。為避免對大鼠造成損傷，最大刺激力度為30 g，每個力度刺激6～8 s，重復4次，相鄰刺激位置間隔一定距離，以避免出現耐受現象。4次刺激一旦有1次出現陽性反應，則繼續該刺激2次，6次刺激中有3次陽性反應的刺激力度則為該側后足的50%縮腿閾值。

1.4 切片制備

FBG升高后第28天時，測試痛閾后經腹腔注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，開胸，經左心室插管至升主動脈，剪開右心耳，以生理鹽水灌注沖洗血液。待右心耳流出液體變清亮后，以4%多聚甲醛經心臟灌流內固定。待大鼠頸部及肝臟僵硬時，灌注結束。分離脊髓，取L5節段石蠟包埋。沿垂直于脊髓長軸的方向，從中連續切取30張14 μm厚的切片，按照等距隨機原則，每隔6張抽取一張切片，抽取的第一張切片在前6張切片中隨機選取，共抽取5張切片。按這種方法抽選出2套切片，分別進行甲苯胺藍尼氏染色(顯示神經元為主)和突觸素的免疫組織化學染色(顯示突觸前終末為主，其數量即突觸數量)[14-15]。

1.5 突觸素免疫組織化學染色

切片經常規脫蠟至水，經0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液抗原修復、3%H2O2去離子水消除內源性過氧化物酶活性和山羊血清封閉非特異性抗原后，滴加小鼠抗大鼠突囊泡蛋白單克隆抗體(稀釋度1∶500，Millipore公司，美國) 4 ℃孵育24 h。依次加入生物素二抗、辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(北京中杉金橋生物技術有限公司)，每一操作步驟期間用0.01 mol/L的PBS液沖洗3 min×3次。DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分色，常規脫水，透明，封片。另取相鄰切片，采用正常山羊血清代替一抗作為陰性對照。

1.6 尼氏染色

切片常規脫蠟至水后，置入57 ℃的0.01%甲苯胺藍溶液中染色5 min，自來水終止，經95%乙醇分色后，常規脫水，透明，封片。

1.7 體視學估計

對各組內切片脊髓背角的左右側交替進行觀測，以消除動物自身因素可能造成的誤差。采用現代體視學設備NewCAST系統(Visiopharm公司，丹麥)及BX51型光學顯微鏡(Olympus公司，日本)，在電腦上進行觀測。先在低倍物鏡下勾勒出所選定側脊髓背角區域[12-13]并測定其面積(A)。UPlanSApo油鏡(×100, 數值孔徑1.40)下進行計數。組織圖像的最終放大倍數為2 240。

1.7.1 突觸的計數 參照文獻[14-16]介紹的方法進行計數：首先在勾選區域的最左上角隨機確定第一個測試視野，然后按照0.2 μm的間距利用電動載物臺在勾選區域內由系統自動等距抽選視野。油鏡下，每個視野疊加2個面積為57.02 μm2的長方形測試框。

從切片上表面向下0.5 μm的光學切片平面開始，手動調節向下連續聚焦觀察3 μm厚的切片組織，根據光學體視框計數法則[9-11,14]計數體視框(每個體視框的體積為57.02 μm2×3 μm=171.06 μm3)內的突觸素顆粒的數量。

所計數的突觸素顆粒的總數除以用于計數的體視框總體積即得單位體積脊髓背角內的突觸的數量(Nv，即數密度)。將所得突觸數量乘以1 mm長脊髓節段內脊髓背角的體積(A×1 mm)，即得每1 mm長脊髓內所測突觸的數量(不考慮切片壓縮)。

1.7.2 神經元計數 系統自動的等距隨機抽選一定的脊髓背角區域，在每個視野上隨機疊加一個面積為2 074.22 μm2的長方形光學體視框。脊髓背角區域內的測試總面積設定為脊髓背角橫切面積的5%。從切片上表面向下0.5 μm的光學切片平面開始，向下連續聚焦觀察7 μm厚的切片組織，根據光學體視框計數法則計數體視框(體視框的體積為2 074.22 μm2×7 μm=14 519.54 μm3)內的神經元核仁數。所計數的核仁總數除以用于計數的體視框總體積即得單位體積脊髓背角內的核仁數量。脊髓背角內每個神經元的細胞核內通常都有且只有1個核仁，很少有2～3個核仁，因此我們估計的核仁數等于神經元數。將所得神經元數量乘以1 mm長脊髓節段內脊髓背角的體積，即得每1 mm長脊髓內所測神經元的數量(不考慮切片壓縮)。

1.7.3 突觸/神經元比值 以單位長度脊髓背角內的突觸數量除以神經元數量，即得突觸/神經元比值。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠血糖及機械痛閾

PDN組大鼠在注射STZ72h后FBG均>11.1mmol/L，且不隨時間推移而下降，同時還伴隨皮毛光澤度下降、色黃，精神萎靡等癥狀。

與造模前及C組相比，PDN組大鼠在FBG升高后4d開始出現痛閾降低，至術后28d時未恢復(P<0.05，表1)。

表1 空腹血糖升高前后各時間點大鼠50%縮爪閾值的變化(n=5)

組別升高前1d升高后4d升高后7d升高后14d升高后28dPDN組18.8±0.613.8±0.4*#10.6±0.7*#11.8±1.4*#11.0±0.6*#C組19.2±0.817.6±1.717.6±0.718.0±0.517.8±0.5

*P<0.05,與血糖升高前相比;#P<0.05,與C組相比。

2.2 L5節段脊髓背角內體視學測量

與C組相比，PDN組大鼠在FBG升高后28 d時單位長度脊髓背角內突觸數量及突觸/神經元比值明顯升高(P<0.05)，而神經元數量及兩組大鼠脊髓背角面積無顯著性差異(P>0.05)(表2，圖1)。

表2 血糖升高后第28 d時各組大鼠的L5段脊髓背角內體視學結果(n=5)

PDN組C組脊髓背角面積(mm2)0.56±0.060.51±0.08突觸數量(106/mm長脊髓)16.05±2.72*11.82±2.69神經元數量(103/mm長脊髓)71.98±12.4968.07±9.54突觸/神經元比值224.08±22.30*172.20±18.20

*P<0.05，與C組相比。

3 討論

STZ通過直接破壞大鼠胰島β細胞而誘發糖尿病，廣泛用于糖尿病動物模型的制備[20-21]。本研究根據文獻及預實驗結果選取STZ 60 mg/kg用于建立糖尿病大鼠模型。PDN組大鼠在注射STZ后72h的FBG均達到糖尿病診斷標準。在FBG升高后第4d出現機械痛閾明顯降低，至28 d時未恢復。說明PDN建模成功并持續發展。

體視學(stereology)是始于20世紀60年代的一門學科，是利用所測結構的圖像的幾何特征來定量研究所測結構本身的幾何特征(包括體積、表面積、長度、數目等)的方法學[19]。體視學方法中的系統抽樣和體視框的運用，提供了較高水平的解剖分辨力，在粒子定量研究方面較傳統的基于對灰度值、光密度的比較等方法有著更為客觀和準確的優勢[22]。

采用體視學的新工具——光學體視框，我們前期實驗[14-15]已經證明，坐骨神經損傷后的神經病理性痛大鼠其脊髓背角的可塑性改變主要發生在L5節段，因此本研究中主要觀測了L5節段突觸和神經元數量的變化。

研究表明：PDN的發生機制不僅僅是周圍神經病變，中樞敏化也在其發生發展中起著重要作用。脊髓背角是疼痛信息傳遞和整合的初級中樞。PDN的外周神經病變導致傷害性傳入沖動增加，可導致初級感覺神經元過度興奮，進而引發脊髓背角傷害感受性神經元興奮性增高，突觸聯系發生功能性或質的變化，進而發生中樞敏化，導致痛覺過敏或自發痛。PDN大鼠脊髓背角內神經回路發生重組，感覺神經纖維傳入增多[8]，因此可能建立新的突觸聯系，導致PDN大鼠脊髓背角內突觸數量增多。本研究采用現代體視學方法，證明了PDN大鼠L5節段單位體積脊髓背角內突觸數量明顯增多而神經元數量無顯著性改變。同時，考慮到脊髓在組織學處理過程中可能產生的變化，我們還計算了突觸/神經元比值。這一比值不受參照空間(脊髓背角)體積改變的影響，其結果與突觸數量的變化具有一致性，說明單個神經元所擁有的突觸數量增加。

突觸數量的增加可能導致神經元的一系列功能變化：谷氨酸能神經元興奮性突觸后電位增強[6]，突觸內神經遞質和神經調質的合成與釋放增加，感覺神經元沖動的發放和傳導頻率增加、速度增快，從而導致糖尿病性神經痛患者自發性疼痛、痛覺過敏和異常疼痛的發生。而增加的突觸中興奮性或抑制性突觸的比例，以及其他脊髓階段內甚至更高一級中樞——大腦中相關區域是否有相應的突觸可塑性改變尚有待進一步研究。

綜上所述，PDN大鼠脊髓背角內突觸數量增多，可能導致感覺神經元興奮性增加，其相應的外周感受野對同樣刺激的感受增強，閾值降低，感受野擴大，進而引起自發性疼痛、痛覺過敏和異常疼痛，導致PDN的發生發展和維持。本研究為闡明PDN發生的中樞機制增添了新的解剖學證據，提示脊髓背角突觸數量的增加可能是導致糖尿病性神經痛患者中樞敏化和自發痛、痛覺過敏及異常疼痛的解剖學基礎。也為糖尿病性神經痛的治療提供了新的思路：抑制脊髓背角內感覺傳入纖維的增加和突觸數量的增多。

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(學術編輯：文曉紅)

Stereological study on the synaptic number in the rat spinal dorsal horn with painful diabetic neuropathy

LIN Jing-Yan1,CHEN Jing2,HUANG San1,LIN Jing1,MA Ding1,PENG Bin3

(1．DepartmentofAnesthesiology,NorthSichuanMedicalCollege,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege；2.NanchongCentralHospital；3.CytochemicalResearchLaboratory,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective：To investigate the plasticity change of the synaptic number in the rat spinal dorsal horn with painful diabetic neuropathy.Methods：10 healthy adult male SD rats were randomly divided into 2 groups (n=5): the PDN group and the control group.Rats in the two groups were intraperitoneally injected with 6%STZ 60mg/kg or normal saline respectively.72 hours after injection,fasting blood glucose (FBG) were measured,FBG>11.1 mmol/L were considered a successful diabetes mellitus model.1day before injection and4,7,14,28 days after increasing of FBG,the mechanical pain threshold were measured.28 days after increasing of FBG,the L5 segment of spinal cord were separated and stained with synaptophysin immunohistochemisty.The numerical density of synapses in the spinal dorsal horn was estimated respectively.Results：In the PDN group,FBG rose after injection of STZ,and the pain threshold decreased 4 days after increasing of FBG.Compared to control group,numerical density of synapses increased significantly in the spinal dorsal horn in the PDN group (P<0.05).Conclusion：The rat model of PDN is associated with increase of the synaptic numbers in the spinal dorsal horn of L5 segment.

Painful diabetic neuropathy;Central sensitization;Synaptic plasticity;Spinal dorsal horn

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.06.008

四川省科技廳項目(2013JY0161)；四川省教育廳重點項目(16ZA0238，15ZA0214)

2016-08-28

林菁艷(1979-)，女，博士，副教授。

彭彬，E-mail: 340255492@qq.com

時間：2017-1-3 22∶01

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170103.2201.016.html

1005-3697(2016)06-0809-04

R741

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