川崎病患兒T細胞免疫功能的變化及臨床意義

游文忠，周發為,盧巧，黃華

(湖北民族學院附屬民大醫院,1.小兒內科;2.檢驗科，湖北 恩施 445000)

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川崎病患兒T細胞免疫功能的變化及臨床意義

游文忠1，周發為2,盧巧1，黃華1

(湖北民族學院附屬民大醫院,1.小兒內科;2.檢驗科，湖北 恩施 445000)

目的：觀察川崎病(kawasaki disease，KD)患兒體內T淋巴細胞亞群及相關細胞因子的變化，分析其在KD發病中的意義。方法：選取KD患兒55例設為KD組，同期住院的普通發熱非KD患兒47例設為非KD組，另選取同期門診體檢的健康兒童40例設為對照組。使用流式細胞儀檢測各組兒童外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD19+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+比例，分析ROC曲線特征。使用ELISA法檢測各組兒童血清白介素6(IL-6)、IL-1β及腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。結果：KD急性期患兒組外周血CD3+、CD3+CD8+、CD4+CD25+比例低于非KD組及對照組；CD3+CD4+、CD3+CD19+、CD4+/CD8+比例高于另兩組(P<0.01)。KD組患兒血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平明顯高于非KD組及對照組(P<0.01)，非KD組IL-1β及IL-6水平高于對照組(P<0.01)。KD患兒CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD19+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+ROC曲線對KD的診斷界值分別為54.5%、28.6%、20.4%、26.1%、1.8%、6.0%。結論：KD患兒體內存在T淋巴細胞亞群失衡，表現為CD4+CD25+、CD3+CD8+減少，CD3+CD4+、CD3+CD19+比例及CD4+/CD8+比值升高，且IL-6、TNF-α、IL-1β等細胞因子水平升高，可能參與了KD病理過程。

川崎病;兒童;T淋巴細胞;細胞因子;免疫功能;診斷界值

川崎病(kawasaki disease，KD)又稱皮膚黏膜淋巴結綜合征(MCLS)，是臨床較為常見的血管炎性綜合征，發病機制至今不明，多發于5歲以下嬰幼兒且發病率逐年增加。臨床以持續性發熱、球結膜充血、口唇病變、皮疹、頸淋巴結腫大為主要表現，若治療不及時，易引起小兒后天性心臟病，嚴重影響患兒的健康發育及生活質量[1]。KD的診斷缺乏特異性實驗室指標，僅憑早期臨床表現難以確診，且該病不典型病例發生率高達10%～20%。研究表明遺傳易感性、微生物感染、血管基質的代謝紊亂、T細胞介導的免疫應答失調等因素在KD發病中具有重要作用[2]，其中免疫學異常在該病發病中具有十分重要的作用[3-4]。本研究檢測了KD患兒體內T淋巴細胞亞群及相關細胞因子的變化，分析其在KD發病中的意義，為該疾病的早期診斷提供臨床參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年3月至2015年9月于湖北民族學院附屬民大醫院小兒內科住院治療的KD患兒55例設為KD組，均符合2005年版《實用兒科學》制定的診斷標準[5]。其中男性37例，女性28例；年齡6個月～7歲，平均(2.9±0.7)歲；病程5～10 d，平均(6.2±1.5)d。入組標準：①發熱5 d以上；②手足癥狀：末端梭形腫脹，熱退脫皮；③皮膚多形紅斑；④粘膜改變：口腔粘膜牛肉色，球結膜充血；⑤口唇干裂、楊梅舌；⑥非化膿性頸部淋巴結炎。排除入組前使用免疫功能調節藥物患兒、合并其他免疫系統疾病患兒。選取同時期住院的普通發熱、淋巴結腫大非KD患兒47例設為非KD組，男性27例，女性20例，年齡6個月～6歲，平均(2.7±0.7)歲；病程1～6 d，平均(3.5±1.2)d。另選取同期門診體檢的健康兒童40例設為對照組，男性26例，女性14例；年齡6個月～6歲，平均(2.8±0.6)歲。3組嬰幼兒年齡、性別等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 流式細胞術檢測方法

3組兒童入院后采集靜脈血5 mL置于肝素抗凝管內，-70 ℃保存以備檢測。每份標本分別取抗凝血100 μL，加FITC標記的CD4單克隆抗體、PE標記的CD8單克隆抗體、ProcP標記的CD3+單克隆抗體(均購自美國賽默飛世爾公司)各20 μL，室溫避光孵育15～20 min。4 ℃ 0.01 mol/L的PBS洗滌二次，加1%多聚甲醛0.5 mL，使用Epics XL-MCL流式細胞儀(美國貝克曼公司)，激發光波長488 nm。每份樣本獲取細胞數10 000個，計算陽性細胞的百分數，以相應血液標本做各自同型陰性對照。

1.3 ELISA檢測方法

每份標本分別取抗凝血清100 μL，使用ELISA法檢測血清IL-6、IL-1β及TNF-α水平，嚴格按照說明書操作。

1.4 觀察指標

觀察KD組患兒、非KD組患兒，及對照組兒童外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD19+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+水平，以及IL-6、TNF-α及IL-1β水平，同時分析KD患兒外周血淋巴細胞亞群ROC曲線特征。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 3組兒童外周血各淋巴細胞比較

KD急性期患兒組外周血CD3+、CD3+CD8+、CD4+CD25+比例低于非KD組及對照組；CD3+CD4+、CD3+CD19+、CD4+/CD8+比例顯著高于后兩組兒童，差異均有統計學意義(P<0.01)。非KD組患兒與對照組兒童淋巴細胞差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組外周血淋巴細胞亞群比較±s)

*P<0.01，與非KD組比較； #P<0.01，與對照組比較。

2.2 KD患兒外周血淋巴細胞亞群ROC曲線特征分析

KD患兒CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD19+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+亞細胞群對KD的診斷界值分別為54.5%、28.6%、20.4%、26.1%、1.8%、6.0%，相應特征見表3。

表2 KD患兒外周血淋巴細胞亞群ROC曲線特征(%)

2.3 3組兒童血清細胞因子水平比較

KD組患兒血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平明顯高于非KD組及對照組(P<0.01)，非KD組IL-1β及IL-6水平高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表3 3組兒童血清細胞因子水平比較±s，pg/mL)

*P<0.01，與非KD組比較； #P<0.01，與對照組比較。

3 討論

KD是一種病因不明、急性自限性血管炎性綜合征，主要臨床表現為發熱、頸淋巴結腫大、一過性皮疹、球結膜充血等，若未經及時治療，可并發冠脈損傷、心肌梗死，甚至心源性猝死，是引發兒童后天獲得性心臟病的原因之一[6-7]。

臨床研究表明KD患兒體內存在免疫系統過度激活，T淋巴細胞亞群失衡，即抑制性/細胞毒性T淋巴細胞群(CD4+CD25+、CD3+CD8+)減少，輔助性/誘導性T淋巴細胞群(CD3+CD4+、CD3+CD19+)數目增加，CD4+/CD8+比值升高[8-9]。過度活化的CD4+細胞分泌大量細胞因子，如白細胞介素、腫瘤壞死因子等，可能是引起本病急性發熱反應的原因[10-11]。CD4+CD25+調節性T細胞數目減少，對T淋巴細胞及B淋巴細胞的抑制作用減弱，導致機體抗體分泌增加。本研究結果顯示KD組患兒體內存在免疫異常活化，且CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+的敏感度、特異度相對較高，其診斷界值與KD的診斷結果具有較高符合度，與郭曉軍等[12]研究一致，表明淋巴細胞亞群含量檢測及ROC曲線特征可作為KD簡便的實驗室指標，有助于KD早期診斷。

研究[13]發現，KD患兒急性期血清IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著升高，這可能與冠狀動脈血管炎、腦部血管炎癥等，以及深層次的免疫損傷機制相關。本研究發現KD組患兒上述3項指標均明顯增高。有助于KD的臨床診斷。而韓云坤等[14]研究發現KD急性期患兒的IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著升高，而在亞急性期有所下降，但IL-6水平仍高于對照組，TNF-α、IL-1β與熱性對照組間無顯著性差異，表明KD亞急性期炎癥因子水平檢測對疾病診斷的假陽性可能性較大，在細胞因子檢測方面不及淋巴細胞亞群檢測結果可信度高。

綜上所述，KD患兒體內存在T淋巴細胞亞群失衡及炎癥介質異常，可能參與了KD病理進程。KD患兒外周血淋巴細胞亞群及細胞因子檢測，有助于早期診斷KD患兒，評價疾病狀態，指導治療。

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[14]韓云坤,孫冰,李麗紅,等.川崎病T細胞免疫及細胞因子變化的研究[J].中國實驗診斷學,2011,15(9):1533-1536.

(學術編輯：皮光環)

Changes of T cell immune function and the clinical significance in infants with kawasaki disease

YOU Wen-zhong1,ZHOU Fa-wei2,LU Qiao1,HUANG Hua1

(1.InternalMedicineDepartmentofPediatrics;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,MindaHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityforNationalities,Enshi445000,Hubei,China)

Objective：To observe the changes of T lymphocyte subsets and relative cytokines in infants with kawasaki disease (KD) and to observe their significance in process of KD.Methods：A total of 55 infants with KD were selected as KD group,while 47 infants with non-KD in corresponding period served as non-KD group,and another 40 healthy infants undergoing physical examinations as control group.Flow cytometer (FCM) was used to detect the ratios of peripheral blood CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD3+CD19+,CD4+/CD8+ and CD4+CD25+ in all groups and analyze the curve characters of receiver operating characteristic (ROC).Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) was applied to detect the levels of serum interleukin 6 (IL-6),IL-1β and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in all groups.Results：KD group was evidently lower in the ratios of peripheral blood CD3+,CD3+CD8+ and CD4+CD25+,but markedly higher in the ratios of CD3+CD4+,CD3+CD19+ and CD4+/CD8+ than other two groups (P<0.01).KD group was notably higher in levels of serum TNF-α,IL-1β and IL-6 than other two groups (P<0.01),whereas non-KD groups was significantly higher in levels of IL-1β and IL-6 than control group (P<0.01).The diagnostic critical values of ROC curves of CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD3+CD19+,CD4+/CD8+ and CD4+CD25+ were 54.5%,28.6%,20.4%,26.1%,1.8% and 6.0% respectively.Conclusion：Infants with KD have imbalance of T lymphocyte subsets marked by reduced CD4+CD25+ and CD3+CD8+,increased ratios of CD3+CD4+,CD3+CD19+ and CD4+/CD8+ as well as levels of IL-6,TNF-α and IL-1β,which may participate in the pathological process of KD.

Kawasaki disease;Children;T lymphocyte;Cytokine;Immune function;Diagnostic critical value

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.06.031

2016-06-22

游文忠(1964-)，男，主任醫師。

黃華，E-mail：hhyjxx@sohu.com

時間：2017-1-3 22∶01

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170103.2201.062.html

1005-3697(2016)06-0888-03

R725.4

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