食管癌Eca109細胞的HPV16-E6基因轉染條件優化

康馨丹，陳衛剛，阮開學，張寧，鄭勇

(石河子大學醫學院第一附屬醫院，新疆石河子832000)

食管癌Eca109細胞的HPV16-E6基因轉染條件優化

康馨丹，陳衛剛，阮開學，張寧，鄭勇

(石河子大學醫學院第一附屬醫院，新疆石河子832000)

目的 確定HPV16-E6基因轉染食管癌Eca109細胞的最佳轉染條件。方法 取體外培養的食管癌Eca109細胞，用中心復合試驗設計分組，轉染條件控制因素包括DNA用量、Lip2000/DNA和饑餓時間，DNA用量分0.65、1.00、1.50、2.00、2.35 μg共5檔，Lip2000/DNA分0.65、1.00、1.50、2.00、2.35 μL/μg共5檔，饑餓時間分0、3、7.5、12、15 h共5檔，共設20個組。轉染24 h后，倒置顯微鏡下觀察各組熒光情況并拍照，用圖像處理軟件計算細胞轉染效率；用CCK-8法測算各組細胞相對存活率。用響應曲面法繪制有交互影響的因素對細胞轉染效率和相對存活率影響的響應曲面，以目的基因細胞數(轉染效率×細胞存活率)最大化為原則，確定最佳轉染條件。在最佳轉染條件下用HPV16-E6基因轉染食管癌Eca109細胞，檢測細胞轉染效率和相對存活率。結果 隨著饑餓時間延長，細胞轉染效率和細胞相對存活率呈下降趨勢。依據饑餓0 h的轉染效率、細胞存活率響應曲面圖，得出最佳轉染條件為(24孔培養板)：DNA用量1.35 μg、Lip2000/DNA1.12 μL/μg(換算成Lip2000用量為1.51 μL)、細胞饑餓時間0 h；轉染效率預測值可達38.68 %，細胞相對存活率預測值為85.09%。在最佳轉染條件下用相同方法轉染，實際轉染效率為39.79 %，與預測值的相對誤差為2.87%。結論 HPV16-E6基因轉染Eca109細胞的最佳轉染條件(24孔板)為：每孔DNA用量1.35 μg，脂質體Lip2000用量1.51 μL，不對細胞進行饑餓處理。

食管癌；人乳頭瘤病毒16；基因轉染效率；細胞相對存活率；實驗設計

人乳頭狀瘤病毒(HPV)是一種具有高度特異性的嗜上皮性病毒，與宮頸癌的發病密切相關，HPV16黏膜高危亞型與食管癌發病的關系尤其密切[1，2]，但其相關程度以及HPV對食管癌細胞的作用機制并沒有明確的定論[3,4]。研究HPV16對食管癌細胞的影響首先要通過基因轉染技術將HPV16核酸片段轉染入食管癌細胞中。陽離子脂質體轉染法是常用轉染方法，但是轉染目標DNA和所用陽離子脂質體LipofectamineTM2000(Lip2000)本身有一定的細胞毒性，過量應用可能導致轉染效率和細胞存活率降低。轉染前是否應該行饑餓處理目前也有爭議。本研究通過陽離子脂質體轉染法，將搭載致癌基因HPV16-E6的重組質粒，轉染入Eca109食管癌Eca109細胞中，并通過中心復合正交試驗設計分析轉染條件(DNA用量、Lip2000/DNA、饑餓時間)對轉染效率和細胞相對存活率的影響，構建轉染效率如細胞相對存活率的響應曲面，確定HPV16-E6基因轉染食管癌Eca109細胞的最佳轉染條件。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 Eca109型食管癌細胞株由石河子大學地方高發病重點實驗室提供。綠色熒光蛋白標記的搭載 HPV16-E6基因片段的pcDNA3.1(+)質粒由上海生工生物工程公司構建。陽離子脂質體Lip2000購自Invitrogen公司。Opti-MEM培養液、DMEM高糖培養基購自Gibco公司。胎牛血清、胰蛋白酶購自HyClone公司。質粒提取純化試劑盒購自天根生化科技公司。CCK-8試劑盒購自東仁化學科技公司。Loading buffer上樣緩沖液、PBS細胞緩沖液、24孔與96孔培養板。熒光倒置顯微鏡為Olympus公司產品。CO2培養箱、超凈臺、核酸濃度分析儀、低溫高速離心機為Thermo Fisher公司產品。酶標儀、電泳儀、紫外凝膠成像儀為Bio-Rad公司產品。

1.2 食管癌Eca109細胞分組及 HPV16-E6基因細胞轉染方法

Eca109細胞貼壁培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，并加入適量的青-鏈霉素混合液，置于37 ℃、5 %CO2培養箱中，隔天換液1次，細胞融合度80 %左右傳代。當細胞處于對數生長期時，使用胰蛋白酶將細胞消化，接種于24孔培養板中，每孔接種細胞數量為1×105個，培養條件保持不變，細胞融合度達到70 %左右進行轉染。設1～20組，各組DNA用量、Lip2000/DNA和饑餓時間見表1。各組先用無血清的DMEM培養基對Eca109細胞進行饑餓處理，達到規定的饑餓時間后進行轉染。各組抽取相應量的的質粒DNA稀釋于50 μL的Opti-MEM培養基中，抽取相應的脂質體Lip2000，同樣稀釋于50 μL的Opti-MEM培養基中，室溫孵育5 min后將二者混合均勻，并靜置25 min得到DNA-Lip2000復合物。將上述復合物均勻滴入各培養孔，然后把培養板放入37 ℃、5 %CO2培養箱中，5 h后更換為含10 %胎牛血清的DMEM培養基終止細胞轉染。

表1 各組轉染條件

1.3 各組轉染效果評價 包括細胞轉染效率和細胞相對存活率兩方面。

1.3.1 各組基因轉染效率測算 細胞轉染24 h后，將細胞培養板置于熒光倒置顯微鏡下放大100倍，每組隨機選取10個視野，分別在可見光和熒光濾鏡下拍照。使用圖像處理軟件Image J進行細胞計數和熒光計數，通過熒光數/細胞數折算出每個視野下的細胞轉染效率，求加權平均數后，最終得出各組的轉染效率。

1.3.2 各組細胞相對存活率測算 采用CCK-8法，另設空白對照組(只加培養液，無細胞)，轉染24 h后，向各試驗組中加入10 μL的CCK-8溶液，在培養箱中孵育1 h左右，使用酶標儀測定450 nm波長的光密度(OD)值。各組細胞相對存活率=(各組OD值/空白對照組OD值)×100%。

1.5 最佳轉染條件的轉染效果驗證 在最佳轉染條件下用1.2中的方法轉染，用1.3中的方法檢測細胞轉染效率和相對存活率。

2 結果

2.1 各組細胞轉染效率和相對存活率 各組細胞轉染效率和相對存活率見表2。

表2 各組基因轉染效率和細胞相對存活率

2.2 最佳轉染條件的優化結果 多元非線性回歸分析結果顯示DNA用量、Lip2000/DNA、饑餓時間均對細胞轉染效率有顯著影響，因素顯著性的主次順序為：饑餓時間>Lip2000/DNA>DNA用量；且DNA用量與Lip2000/DNA對轉染效率的影響存在顯著交互作用，而其他因素之間則無顯著交互作用。DNA用量、Lip2000/DNA和饑餓時間均對細胞相對存活率有顯著影響，顯著性的主次順序為：饑餓時間>Lip2000/DNA>DNA用量；三者對細胞相對存活率的影響無交互作用。

DNA用量對轉染效率的影響具有兩面性。隨著DNA用量增加，轉染效率先逐漸增大，在DNA用量為1.35 μg左右達到最大值，此后隨著DNA的增加逐漸減小。DNA用量與細胞相對存活率呈非線性負相關，隨著DNA用量增加，細胞存活率呈加速下降趨勢，當DNA用量達到2.35 μg時，細胞存活率僅為40 %左右。

Lip2000/DNA比值對轉染效率的影響同樣具有兩面性。當Lip2000/DNA從0.65 μL/μg增大至1.2 μL/μg時，轉染效率由25%提升至30%；當Lip2000/DNA從1.2 μL/μg增大至2.35 μL/μg時，轉染效率開始急劇下降，下降幅度達到20%。當Lip2000/DNA在0.65～1.2 μL/μg的區間內，細胞細胞相對存活率保持相對穩定；當Lip2000/DNA從1.2 μL/μg增大至2.35 μL/μg時，細胞相對存活率呈加速下降趨勢。

隨著饑餓時間延長，細胞轉染效率和細胞相對存活率呈下降趨勢。

饑餓時間與DNA用量、Lip2000/DNA之間不存在顯著交互作用，并且對轉染效率和細胞存活率的影響均為單調抑制作用，因此在細胞轉染時不進行饑餓處理更為適宜。饑餓0 h的細胞轉染效率響應曲面見圖1。最高轉染效率位于響應曲面的中間區域。當DNA用量在1.2 ～1.8 μg區間內、Lip2000/DNA在0.9～1.5區間內，轉染效率可保持在35%以上。饑餓0 h的細胞存活率響應曲面件圖2。DNA和Lip2000用量與細胞存活率的影響呈負相關，當DNA用量與Lip2000/DNA均處于低水平時，細胞存活率可達最大值。DNA用量在0.65 ～1.6 μg區間內、Lip2000/DNA在0.65～1.4區間內，細胞存活率可保持在70%以上。

以目的基因細胞數(轉染效率×細胞存活率)最大化為原則，通過響應曲面法得出最佳轉染條件為(24孔培養板)：DNA用量1.35 μg、Lip2000/DNA為1.12 μL/μg(Lip2000用量1.51 μL)、細胞饑餓時間0 h；轉染效率預測值可達38.68%，細胞相對存活率預測值為85.09%。

2.3 最佳轉染條件的轉染效果 在最佳轉染條件下用相同方法轉染食管癌Eca109細胞，實際轉染效率為39.79%，與響應曲面預測值的相對誤差僅為2.87%。

3 討論

陽離子脂質體轉染法是目前常用的基因轉染技術之一[6]，在使用脂質體Lip2000將目的基因轉染入細胞的過程中，轉染效率會受到諸多因素的影響，因此對轉染條件的優化必不可少。轉染過程中DNA和脂質體均有導致細胞凋亡的作用。為了盡可能多的獲取攜帶HPV16-E6基因的食管癌細胞，在提高轉染效率的同時，還需考慮細胞轉染之后的存活率。

本研究結果顯示，DNA用量、Lip2000/DNA和饑餓時間這三個因素對細胞轉染效率和細胞相對存活率都有影響，并且DNA用量與Lip2000/DNA對轉染效率的影響存在顯著的交互作用。增大DNA用量可形成更多的核酸-脂質體復合物，有利于提高轉染效率，但是細胞本身對DNA的吸收存在飽和度，且過多的DNA會導致核酸-脂質體復合物的氮磷比失衡[7]，細胞毒作用增強，因此過量的DNA會降低轉染效率。適量的提高Lip2000用量可與DNA結合更加充分，形成的核酸-脂質體復合物具有更穩定的空間結構，能有效提高轉染效率[8]。但是，當Lip2000/DNA值較大時，過量的Lip2000分子以游離狀態存在，將細胞膜表面的負電荷中和，從而削弱細胞膜對核酸-脂質體復合物的吸附能力，造成轉染效率降低；另一方面，Lip2000本身對細胞也具有毒性，這是其造成細胞相對存活率下降的主要原因[9]。轉染前對食管癌細胞進行饑餓處理的目的在于，使細胞處于靜息狀態而達到細胞周期的同步化，同時消除血清對轉染效率的影響[10]。有文獻[11]提出，處于饑餓狀態的細胞可以更好的吸收轉染試劑，在一定程度上可以提高轉染效率。而本研究結果表明，饑餓處理會降低細胞轉染效率，過度饑餓會使細胞狀態變差，內吞和膜融合活動減弱，并且造成細胞損傷，不能有效的抵抗DNA和脂質體的毒性作用。另外，饑餓處理時間過長，細胞沒有足夠的營養維持生長，會逐漸裂解、死亡，細胞相對存活率下降。

根據響應曲面對轉染條件優化得出：在24孔培養板上行HPV16-E6基因轉染Eca109細胞，每孔DNA用量1.35 μg，脂質體Lip2000用量1.51 μL，且不對細胞進行饑餓處理時，理論上轉染效率可達到最大值，實際轉染效率為39.79%，完全可滿足后續實驗需求。

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Optimal transfection conditions for HPV16-E6 gene in esophageal cancer Eca109 cells

KANGXindan,CHENWeigang,RUANKaixue,ZHANGNing,ZHENGYong

(TheFirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversityMedicalCollege,Shihezi832000,China)

Objective To find the optimal transfection conditions for transfecting HPV16-E6 plasmid to esophageal cancer Eca109 cells. Methods The in vitro cultured Eca109 cells were selected. We used central composite experiment to design the groups. The control factors of transfection conditions included DNA dosage (0.65, 1.00, 1.50, 2.00, and 2.35 μg), Lip2000/DNA (0.65, 1.00, 1.50, 2.00, and 2.35 μL/μg) and starvation time (0, 3, 7.5, 12, and 15 h) and according to the above, we established 20 groups. After 24 h, the expression of green fluorescent was observed by inverted microscope and then was photographed. The transfection efficiency was evaluated by image processing software, and the cell proliferation by CCK-8. Response surface methodology was used to draw the response surface on effects of interaction factors on cell transfection efficiency and relative survival rate.The optimal transfection conditions were determined based on the principle of maximizing the number of target cells (transfection efficiency×cell survival rate). The transfection efficiency and relative survival rate of esophageal carcinoma Eca109 cells were detected by HPV16-E6 gene transfection under optimal transfection conditions.Results On the basis of cell transfection efficiency without starvation, the response surface showed that the highest transfection efficiency area was located in the middle of the response surface. Without starvation, the response surface of cell survival rate showed that the DNA and Lipo 2000 was negatively correlated with the survival rate. The optimal transfection conditions (24-well plate) determined based on the principle of maximizing the number of target cells (transfection efficiency×cell survival rate): the plasmid amount was 1.35 μg, Lipo2000/DNA ratio was 1.12∶1 μg/μL (converted to Lip2000 dosage of 1.51 μL) and the starvation time was 0 h. The predicted value of transfection efficiency reached 38.68% and the cell survival rate was 85.09%. Under the optimal transfection conditions, the actual transfection efficiency was the highest (39.79%), with the relative error of 2.87% as compared with the predicted value. Conclusion The optimal transfection conditions for transfecting HPV16-E6 plasmid to Eca109 cells for 24-well plate are asfollows: 1.35 μg DNA per well, 1.51 μL Lip2000 liposome, and the cells are not starved.

esophageal cancer; human papillomavinus 16; gene transfection efficiency; cell relative survival rate; experimental design

國家自然科學基金資助項目(81260362)。

康馨丹(1991-)，女，碩士研究生，主要研究方向為消化道腫瘤。E-mail: 75321631@qq.com

簡介：鄭勇(1956-)，男，醫學博士，主任醫師，主要研究方向為消化系統疾病。E-mail: zy2850@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.004

R735.1

A

1002-266X(2016)47-0013-04

2016-08-21)