不同海拔高原環(huán)境下生存的小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群變化

張曉娜，高世蘭，胡方杰，李積東，蒲小燕，永勝

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001)

不同海拔高原環(huán)境下生存的小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群變化

張曉娜，高世蘭，胡方杰，李積東，蒲小燕，永勝

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001)

目的 觀察不同海拔高原環(huán)境下生存的小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群變化。 方法 分別在400 m、2 200 m和4 200 m的不同海拔條件下飼養(yǎng)小鼠30 d，用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群分布及其表面活化共刺激分子的變化。 結(jié)果 海拔4 200 m和海拔2 200 m低氧暴露30 d后，小鼠脾臟CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比例較對照組(海拔400 m)顯著下降(P均<0.05)，其中，CD4+T細(xì)胞數(shù)較CD8+T細(xì)胞數(shù)下降水平高；CD4+CD28+T細(xì)胞比例也明顯減少(P<0.05)，而CD8+CD28+T細(xì)胞比例無顯著變化。此外，海拔4 200 m低氧組與海拔2 200 m低氧組相比，小鼠脾臟CD3+、CD4+、CD4+CD28+T細(xì)胞數(shù)均明顯下降(P<0.05)。 結(jié)論 高原環(huán)境飼養(yǎng)可以導(dǎo)致小鼠脾臟CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，CD4+T淋巴細(xì)胞活化水平顯著降低。海拔越高作用越明顯。

高原環(huán)境；T淋巴細(xì)胞；淋巴細(xì)胞亞群；白細(xì)胞分化抗原;脾

高原地區(qū)自然環(huán)境惡劣，大氣壓低、氧分壓低、氣候寒冷、輻射強，可以導(dǎo)致高原病，低氧是其中最重要的因素[1，2]。免疫系統(tǒng)是機(jī)體的防御屏障。研究表明，高原低氧環(huán)境可改變機(jī)體免疫功能[3]，表現(xiàn)為T細(xì)胞成熟延緩，增殖被抑制，分泌細(xì)胞因子的能力也發(fā)生改變[4，5]。脾臟作為最大的外周免疫器官，不僅是成熟T、B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞定居的部位，也是產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫的場所[11]。目前高原低氧環(huán)境對脾臟T細(xì)胞亞群分布的影響尚不明確。2016年3～10月，我們觀察了不同海拔高原低氧環(huán)境對小鼠脾臟T細(xì)胞亞群分布的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性BALB/c小鼠30只，4～6周齡，體質(zhì)量20～25 g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。紅細(xì)胞裂解液(Solarbio，北京)；PBS(Hyclone，美國)；anti-Mouse CD3PE、anti-Mouse CD4FITC、anti-Mouse CD8PerCP、anti-Mouse CD28FITC、anti-Mouse CD28PerCP(Ebioscienc，美國)。生物安全柜(Thermo Scientific 1300 SERIES A2，美國)；小型臺式離心機(jī)(Eppendorf 5148R，德國)；FCM(BD FACS Calibur,美國)。

1.2 小鼠分組及飼養(yǎng) 將小鼠隨機(jī)分為A、B、C組，每組10只。A組小鼠飼養(yǎng)于青海省果洛州甘德縣青珍鄉(xiāng)(海拔4 200 m),B組飼養(yǎng)于青海大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心(位于青海省西寧市，海拔2 200 m)，C組大鼠飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院(位于陜西省西安市，海拔400 m)。三組小鼠飼養(yǎng)環(huán)境相同。均喂養(yǎng)30 d。

1.3 小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群檢測 脫頸處死小鼠，用75%乙醇浸泡5 min，超凈工作臺內(nèi)打開腹部左側(cè)皮膚，小心分離皮下組織和腹壁肌肉，露出脾臟，提起，剪去周圍結(jié)締組織。脾臟放入含2 mL PBS的無菌培養(yǎng)皿中，剪成三段，無菌鑷子夾碎，擠壓脾臟。將獲得的細(xì)胞懸液經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾加入無菌試管，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入適量紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，混勻后靜置5 min，待紅細(xì)胞完全破碎，1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗1～2遍。最后用1 mL PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為1.5×106/mL。 將細(xì)胞懸液與熒光單抗混合，分別制備陰性對照管和樣品管，混勻后避光放置25 min，離心棄上清，用2 mL PBS洗兩遍，最后用500 μL PBS重新懸浮。用文獻(xiàn)[12，13]中的方法行流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD28+、CD8+CD28+T細(xì)胞比例及CD4+/CD8+。

2 結(jié)果

飼養(yǎng)30 d時三組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群分布見表1。飼養(yǎng)30 d時，與C組相比，A、B組小鼠脾臟CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD28+T細(xì)胞比例低(P均<0.05)；與B組相比，A組小鼠上述指標(biāo)低(P均<0.05)；三組CD8+CD28+T細(xì)胞比例和CD4+/CD8+相比,P>0.05。

表1 飼養(yǎng)30 d時三組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群比較±s)

注：與C組相比，＊P<0.05；與B組相比，△P<0.05。

3 討論

高原地區(qū)自然環(huán)境惡劣，大氣壓低、氧分壓低、寒冷、輻射強等因素容易引起高原病，低氧為其最主要的特征。低氧不僅能改變機(jī)體的一系列生理機(jī)能，同時也是許多疾病,如休克、癌癥、免疫性疾病等發(fā)生發(fā)展過程中的病理環(huán)節(jié)之一[1]。人在快速進(jìn)入3 000 m以上高原后由于缺氧會發(fā)生急性高原反應(yīng)，嚴(yán)重者可能發(fā)展為高原肺水腫和高原腦水腫[2]，甚至危及生命。

免疫系統(tǒng)是機(jī)體的防御屏障。研究表明，高原低氧可使機(jī)體免疫功能發(fā)生改變[3]。Caldwell等[4]將小鼠脾臟淋巴細(xì)胞置于2.5%低氧環(huán)境中培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞成熟延緩，其分泌細(xì)胞因子的能力也發(fā)生改變。在研究腫瘤免疫時發(fā)現(xiàn)，腫瘤無氧區(qū)的T淋巴細(xì)胞浸潤數(shù)量雖然沒有明顯變化，其功能卻顯著下降[5]。低氧和寒冷均可在一定程度上抑制大鼠脾臟T細(xì)胞的增殖[6]。急性高原肺水腫患者外周血中血漿腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-6、VEGF、內(nèi)皮素-1(ET-1)、免疫球蛋及中性粒細(xì)胞比例明顯增高[7，8]。Phan等[9]研究發(fā)現(xiàn)低氧可導(dǎo)致T細(xì)胞增殖能力下降且細(xì)胞周期延遲。多數(shù)研究認(rèn)為，低氧對血漿免疫球蛋白影響不大，因而B淋巴細(xì)胞功能不受明顯影響[10]。

脾臟作為最大的外周免疫器官，不僅是成熟T、B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞定居的部位，也是產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫的場所[11]。在脾臟的免疫反應(yīng)中，T細(xì)胞是最重要的免疫細(xì)胞之一，在機(jī)體的免疫應(yīng)答中處于核心地位，在固有免疫、獲得性免疫、移植免疫、自身免疫性疾病的發(fā)病、腫瘤免疫及超敏反應(yīng)中都發(fā)揮著重要作用。T淋巴細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中占相當(dāng)比例，根據(jù)其功能特征和表面標(biāo)志，可分為CD4+和CD8+兩個亞群。CD4+T細(xì)胞主要分化為Th1、Th2和Th17三類效應(yīng)細(xì)胞，分別分泌不同的細(xì)胞因子，發(fā)揮不同的免疫效應(yīng)[14]。CD8+T細(xì)胞為細(xì)胞毒性T(CTL)細(xì)胞，是機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)中起關(guān)鍵作用的效應(yīng)細(xì)胞[15]。它能釋放多種細(xì)胞因子和酶，如IL-6、穿孔素、溶細(xì)胞素等、通過溶細(xì)胞作用直接殺傷腫瘤細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示海拔2 200 m和海拔4 200 m高原低氧暴露30 d后，小鼠脾臟CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)均顯著減少，其中，CD4+T細(xì)胞數(shù)較CD8+T細(xì)胞數(shù)下降水平高，整體下降趨勢與大鼠實驗基本相同[16]。提示高原低氧暴露可導(dǎo)致小鼠的細(xì)胞免疫功能降低。T細(xì)胞完全活化需要兩個信號：第一信號由T細(xì)胞抗原受體和MHC/抗原肽結(jié)合提供，第二信號則由協(xié)同刺激受體與配體相互結(jié)合所介導(dǎo)。T細(xì)胞表面存在許多重要的共刺激分子，能夠介導(dǎo)T細(xì)胞的增殖、活化以及效應(yīng)功能的發(fā)揮。其中，CD28分子與抗原提呈細(xì)胞(APC)表面B7分子間相互作用是誘導(dǎo)T細(xì)胞活化的重要輔助信號[17]。根據(jù)是否表達(dá)CD28分子，可將T 細(xì)胞分為CD4+CD28+、CD8+CD28+、CD4+CD28-、CD8+CD28-共4個亞群。CD4+CD28+T細(xì)胞包括大多數(shù)輔助性T 細(xì)胞，CD8+CD28+T細(xì)胞為效應(yīng)性殺傷(又稱細(xì)胞毒性)T細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，海拔2 200 m和海拔4 200 m高原低氧暴露30 d后，小鼠脾臟CD4+CD28+細(xì)胞數(shù)明顯降低，而CD8+CD28+細(xì)胞數(shù)無明顯變化，提示高原低氧暴露使小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞活化水平降低，而CD8+T細(xì)胞活化水平無明顯變化，這也可能是由于低氧暴露過程中先降低后增加而恢復(fù)所致[12]。低氧條件下，小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的改變可能與低氧暴露后糖皮質(zhì)激素、促腎上腺皮質(zhì)激素以及前炎癥因子顯著增加有關(guān)[18，19]。

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2016-06-11)