復合酶法制備海參內臟ACE抑制肽工藝研究

蔡彬新，周逢芳，林則圣

（寧德師范學院生物系，福建 寧德 352100）

復合酶法制備海參內臟ACE抑制肽工藝研究

蔡彬新，周逢芳，林則圣

（寧德師范學院生物系，福建 寧德 352100）

采取復合酶法探討海參內臟中ACE抑制肽的制備工藝，研究溫度、時間、pH值、料液比、酶量5個因素對ACE抑制率和水解度的影響。通過單因素和正交試驗，得到海參內臟ACE抑制肽制備最佳工藝組合為A2B2C3D2，即反應時間為5 h、溫度50℃、酶量2%、pH值為7.5，此條件下海參內臟多肽ACE抑制率可達到55.4% 。

海參；ACE抑制肽；水解度；正交試驗

海參（sea cucumber，Ludwigothurea grisea）為海參綱無脊椎棘皮動物［1］，具有良好的藥用價值。近幾年，在海參中發現許多重要的生理活性物質，如多肽、皂苷、膠原蛋白等［2-3］，研究發現，海參多肽具有很好的降血壓效果［4-5］。內臟作為海參的一部分，在鮮海參加工過程中常被丟棄，如果能從中提取活性物質再利用，不僅可避免因環境污染，而且能提高海洋生物開發利用的附加值。

為使海參內臟加工副產物實現資源化高附加值利用，本研究選用海參內臟作為原料，采用復合蛋白酶水解方法制備海參內臟ACE抑制肽，通過單因素試驗和正交試驗相結合的方法，對復合蛋白酶水解條件進行優化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試海參購于寧德霞浦海參養殖場；中性蛋白酶（酶活力6萬U/g）、風味蛋白酶（20萬U/g）購于北京索萊寶科技有限公司；血管緊張素轉化酶（ACE）、馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）購于Sigma公司；其他化學試劑均為AR試劑，購于國藥集團有限公司。

儀器：MC電子天平（奧豪斯公司），UV2550紫外光分光光度計（日本島津），PB-10PH計（上海般特公司），高速冷凍離心機（sigma公司），1200高效液相色譜儀（安捷倫公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1海參內臟ACE抑制肽制備工藝 將海參內臟洗凈，組織絞碎，取一定量攪碎物，加入2倍體積蒸餾水及適量的復合蛋白酶（中性蛋白酶和風味蛋白酶，1∶1），調節pH值，在一定溫度下，保溫水解一定時間。水解完沸水浴滅酶10 min 后，于4℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液，獲得海參酶解液，測定其水解度和ACE抑制率。

1.2.2單因素試驗 （1）pH值：固定料液比1∶2、水解溫度50℃、水解時間5 h、加酶量2%，探討初始pH值6、6.5、7、7.5、8等5個不同水平對海參內臟ACE抑制率和水解度的影響。

（2）溫度：固定料液比1∶2、pH值7、水解時間5 h、加酶量2%，探討反應溫度為45、50、55、60、65℃等5個不同水平對海參內臟ACE抑制率和水解度的影響。

（3）酶量：固定料液比1∶2、水解溫度50℃、pH值7、水解時間5 h，探討加酶量1%、1.5%、2%、2.5%、3%等5個不同水平對海參內臟ACE抑制率和水解度的影響。

（4）料液比：水解溫度50℃、pH值7、水解時間5h、加酶量2%，探討料液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5等5個不同水平對海參內臟ACE抑制率和水解度的影響。

（5）反應時間：固定料液比1∶2、水解溫度50℃、pH值7、加酶量2%，探討反應時間3、4、5、6、7 h 等5個不同水平對海參內臟ACE抑制率和水解度的影響。

1.2.3正交試驗 根據單因素試驗結果，設計L9（34）正交試驗，以水解時間（A）、溫度（B）、酶濃度（C）、pH（D）4個因素進行試驗，各因素水平見表1。

表1 L9（34）正交試驗因素水平

1.3 測定項目及方法

原料中的總氮含量：采用凱氏定氮法（GB／T 5009.5.2010） 測定。

氨基氮量測定：分別用茚三酮法［6］和甲醛滴定法［7］測定水解度，比較分析兩種方法的測定結果，選擇一種合適的方法進行海參內臟水解液氨基氮量的測定。

式中，A為原料中總氮量，B為水解液中的α-氨基氮量。

水解液ACE抑制率測定：根據Cushman方法［8］改進，取2.0 mg/mL刺參酶解液40 μL，加入25 mU/mL ACE溶液20 μL，于37℃下保溫5 min后加入HHL溶液50 μL開始反應，反應60 min后加入1.0 mol/L HCl 200 μL中止反應，得到反應液，利用HPLC進行分析測定；同時用pH 8.3的硼酸緩沖液40 μL替代刺參酶解液制備反應液，作空白對照。色譜檢測條件：色譜柱Zorbax SB-C18分析柱（4.6×250 mm，填料粒徑5 μm）；柱溫：25℃；流動相∶乙睛-水（25∶75，V/V，各含0.1%三氟乙酸）；流速：1 mL/min；檢測波長：228 nm；進樣量：10 μL。

式中，M為空白對照中馬尿酸的峰面積，N為樣品中馬尿酸的峰面積。

2 結果與分析

2.1 水解度測定方法

茚三酮法和甲醛滴定法測定海參內臟蛋白水解度分別為25.1%和24.2%，說明采用茚三酮法和甲醛滴定法測定海參蛋白水解度差別不大，故兩種方法都可用于測定其水解度。由于茚三酮法所用的顯色劑穩定性較差，導致比色時讀數不穩定，且采用單一的甘氨酸作標準，不同的氨基酸對茚三酮的顯色程度都有一定的偏差，因此本試驗選擇甲醛滴定法測定水解度。

2.2 海參內臟ACE抑制肽制備單因素試驗結果

2.2.1反應溫度對水解度和ACE抑制率的影響 由圖1可知，隨反應溫度的升高，海參內臟蛋白水解度呈先上升后下降的趨勢，溫度為50℃時水解度最高，為26.5%，55～60℃水解度下降較快；同時，ACE抑制率也呈先上升后下降的趨勢，溫度為50℃時，ACE抑制率最高、為48.6%。這可能是由于溫度較低時，升溫能加快反應速度，而溫度過高則會破壞酶結構，反而降低酶解效率。因此選擇50℃作為水解海參內臟多肽的最佳溫度。

圖1 反應溫度對水解度和ACE抑制率的影響

2.2.2反應時間對水解度和ACE抑制率的影響 由圖2可知，隨反應時間的延長海參水解度先上升后平緩，而ACE抑制率4～6 h范圍內呈上升趨勢，6～8 h開始下降。水解度的變化趨勢可能是由于在6 h前，酶量較多，海參蛋白酶解快，但反應6 h后酶已經用完，也可能是海參蛋白已酶解到一定程度使酶與其結合的機率降低，從而導致酶解速度降低；ACE抑制率早期上升趨勢主要是因為隨著水解度增加，多肽量增多導致抑制率增大，而5 h后抑制率降低，可能是過度水解生成了ACE抑制活性較低的小分子多肽。綜合考慮反應溫度對水解度和ACE抑制率的影響，選擇5 h作為水解海參多肽的最佳酶解時間。

圖2 反應時間對水解度和ACE抑制率的影響

2.2.3初始pH值對水解度和ACE抑制率的影響 由圖3可知，當初始pH值較低時，水解度和ACE抑制率都先升高后降低，但總體變化幅度較小。原因可能是雖然每種酶都有最適pH值，由中性蛋白酶和風味蛋白酶組成的復合酶其最適pH值范圍較廣，在6.5～7.5間都適合，對水解效果影響小。

圖3 pH值對水解度和ACE抑制率的影響

2.2.4酶量對水解度和ACE抑制率的影響 由圖4可知，隨著酶量的增加水解度也增加，當加酶量達2.5%左右時，趨于平衡。ACE抑制率在不同的酶與底物濃度下差異顯著，在酶量1%～1.5%的范圍內，ACE抑制率顯著增大；隨后減小，酶量2%～2.5%間ACE抑制率顯著減小，而后趨于平緩。原因可能是初期底物多、酶量少時，酶反應次數多，多數大分子蛋白在較短時間內被降解成小分子肽，而當酶量過高時，受底物數量的限制，水解度不再增加。對于抑制率的現象可能是初期隨著酶解產生有活性的多肽，但隨著酶用量的增大，造成過度水解生成了ACE抑制活性較低的小分子多肽。綜合考慮反應溫度對水解度和ACE抑制率的影響，選擇2%酶量作為水解海參多肽的最佳酶量。

圖4 酶量對水解度和ACE抑制率的影響

2.2.5料液比對水解度和ACE抑制率的影響 由圖5可知，隨著料水比的增加，水解度和ACE抑制率呈遞增趨勢，到料液比1∶2時開始下降。原因可能是反應中水增加，降低了底物與酶的濃度，造成底物與酶結合機會的降低，從而降低酶解效率。ACE抑制率隨著水解度的降低，多肽量減少使抑制率降低，因此選擇1∶2作為試驗水解海參內臟多肽的最佳料液比。

圖5 料液比對水解度和ACE抑制率的影響

2.3 海參內臟ACE抑制肽制備工藝的優化

海參內臟ACE抑制肽單因素分析結果表明，水解度和ACE抑制率變化并不一一對應，但由于制備ACE抑制率效果好的海參內臟多肽是本試驗的主要目的，因此選擇ACE抑制率作為指標，進行4因素（A 時間、B 溫度、C pH值、D酶濃度）3水平L9（34）正交試驗，結果見表2。從表2可以看出，影響ACE抑制率強度的各因素依次為水解時間＞溫度＞酶濃度＞pH，最優組合為A2B2C3D2，即反應時間為5 h、溫度50℃、pH值為7.5、酶量2%。

表2 海參內臟ACE抑制肽制備正交試驗結果

為彌補極差分析方法缺陷，進一步對正交試驗進行方差分析，判斷各因素對ACE抑制率的影響作用是否顯著，結果見表3。由表3可知，水解溫度、水解時間、酶濃度等因素對ACE抑制率影響作用顯著，pH值影響不顯著。

表3 正交試驗方差分析結果

3 結論

多肽的制備方法有酶法、堿法等，酶解法條件溫和，肽的活性破壞小，水解過程中的環境污染小。酶法制備ACE抑制肽常用的酶有多種，不同酶對蛋白的切割位點不同，產生的多肽不同，即使同一種酶在不同條件下其酶解的能力也有很大區別。本試驗選用復合酶酶解海參內臟蛋白產生ACE活性肽，并對海參內臟蛋白的水解條件進行優化，結果表明，影響ACE抑制率強度的各因素依次為水解時間＞溫度＞酶濃度＞pH，即水解溫度、水解時間和酶濃度對ACE抑制率影響作用顯著，pH值對其影響不顯著，最優組合為A2B2C3D2，即反應時間為5 h、溫度50℃、酶量2%、pH值為7.5，在此條件下ACE抑制率55.4%。

［1］ 廖玉麟.中國動物志·棘皮動物門海參綱［M］.北京：科學出版社，1997.

［2］ 馬天舒，葛迎春.海參活性物質的藥理研究進展［J］.特產研究，2003（1）：57-60.

［3］ 趙芹.海參膠原蛋白多肽抗氧化的研究［D］.青島：中國海洋大學，2008.

［4］ 趙元暉，李八方，曾名湧，等.一種低值海參蛋白酶解物降血壓活性的研究［J］.漁業現代化，2009，36（1）：56-59.

［5］ 朱小杰，曾名湧，馬桂蘭，等.海地瓜蛋白酶解物類蛋白反應修飾及其對ACE活性的影響［J］.中國海洋藥物雜志，2011，30（6）：6-12.

［6］ 李理.蛋白質水解產物中多肽得率的測定方法研究［J］.現代食品科技，2010，26（8）：84-86.

［7］ 楊文博，張英華.蛋白質水解度的測定方法研究［J］.中國調味品，2014，39（3）：88-91.

［8］ Fitz Gerald R J，Meisel H.Milk protein-derived peptide inhibitors of Angiotmsin- converting enzyme［J］.BrJNutr，2000，84：33-37.

（責任編輯 鄒移光）

Preparation of ACE inhibitory peptides from sea cucumber viscera by complex enzyme

CAI Bin-xin，ZHOU Feng-fang，LIN Ze-sheng
（Department of Biology，Ningde Normal University，Ningde 352100，China）

The method of complex enzyme was used to prepare ACE inhibitory peptides from sea cucumber viscera， and five factors affecting peptides preparation，such as temperature，time，the ratio of solid toliquid， pH and amount of enzyme were studied.The optimal parameters for the preparation of ACE inhibitory peptides were determined through single factor experiment and orthogonal test as follows：temperature at 50℃ ，time for 5 h，pH 7.5 and amount enzyme of 2%.Under these conditions，ACE inhibitory rate was up to 55.4%.

sea cucumber；ACE inhibitory peptides；degree of hydrolysis（DH）；orthogonal test

TS254.9

A

1004-874X（2016）12-0085-05

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.12.015

2016-08-10

福建省科技重點項目（2014N0016）；寧德市科技局項目（20130139）；寧德師范學院服務海西項目（2012H315）

蔡彬新（1983-），女，碩士，講師，E-mail：binxin3@sina.com;zhoufengfang123@163.com

蔡彬新，周逢芳，林則圣.復合酶法制備海參內臟ACE抑制肽工藝研究［J］.廣東農業科學，2016，43（12）：85-89.