碳青霉烯類抗生素耐藥肺炎克雷伯菌耐藥基因分布和分子分型

楊 夢，王 鵬，徐曉倩，熊長輝，劉曉青，袁 輝，潘歡弘

碳青霉烯類抗生素耐藥肺炎克雷伯菌耐藥基因分布和分子分型

楊 夢，王 鵬，徐曉倩，熊長輝，劉曉青，袁 輝，潘歡弘

目的 探討碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥基因分布及分子分型特征。方法收集38株臨床分離的肺炎克雷伯菌，采用肉湯稀釋法藥敏實驗、改良Hodge試驗、PCR電泳、脈沖場凝膠電泳分型及多位點序列分型測定其耐藥性、耐藥基因型及分子型別。結果對碳青霉烯類藥物亞胺培南、美羅培南、厄他培南耐藥率分別為18.42%(7/38)、28.95%(11/38)、34.21%(13/38)，其中有7株(18.42%)同時耐3種藥物。對阿米卡星、左氧氟沙星、四環素、呋喃妥因、甲氨芐啶/磺胺甲惡唑、慶大霉素耐藥率為23.68%～44.74%，阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑啉、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南、環丙沙星耐藥率均大于52.63%，氨芐西林、哌拉西林耐藥率100%。有11 株肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶表型檢測為陽性，占28.95%(11/38),其中5株攜帶blaKPC基因，均為KPC-2型；4株攜帶blaNDM基因，均為NDM-1型。9株攜帶blaKPC或blaNDM耐藥基因的菌株同源性分析顯示有8種不同PFGE帶型，5種MLST 型別(ST型)。5種ST型為ST11、ST15、ST395、ST1031、ST1412，其中以ST11為主。結論肺炎克雷伯菌耐藥及多重耐藥現象嚴重，肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類藥物的主要的原因是攜帶KPC-2或者NDM-1基因，菌株基因型多態性大，提示病例之間不存在關聯性。

肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶；耐藥基因；分子分型

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是一種重要的機會致病菌，常導致肺炎、支氣管炎、泌尿道和創傷感染等醫院感染。由于高耐藥性而被廣泛關注。碳青霉烯類抗生素是抗菌譜廣、抗菌活性最強的一類β-內酰胺酶抗生素，因其具有對β-內酰胺酶穩定以及毒性低等特點，已成為治療嚴重細菌感染最主要的抗菌藥物之一。但是，隨著碳青霉烯類抗生素在臨床上使用的增加，碳青霉烯類抗生素的耐藥菌株也不斷增加，特別是耐碳青霉烯類抗生素的肺炎克雷伯菌快速增加。耐藥菌株中表達碳青霉烯酶[1-2]，主要是KPC酶和NDM金屬酶。本研究對肺炎克雷伯菌臨床分離株進行菌種鑒定和藥敏試驗，篩選出對碳青霉烯類抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌，并通過脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis typing，PFGE)和多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)方法進行分子分型研究。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 試驗菌株為江西省臨床實驗室分離的肺炎克雷伯菌共38株，分離標本來源為痰液22株、尿液8株、血液4株、引流液2株、傷口分泌物2株，見表1。耐藥表型實驗和耐藥基因檢測的質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603，肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705，肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1706；PFGE分子量標準參考菌株沙門菌H9812。

1.2 主要儀器 VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀 (法國Bio-Mrieux 公司) ；PCR 擴增儀PTC200、脈沖腸凝膠電泳儀CHEF-DRIII system、凝膠成像系統Gel Doc2000(美國Bio-Rad)；電泳儀(北京六一廠)；恒溫培養箱(日本TOKYO RIKAKAI EYELA)；微量高速離心機(德國eppdoff)。

1.3 主要試劑 VITEK 2 Compact 全自動微生物分析儀鑒定卡及GN 14藥敏卡(法國Bio-Mrieux 公司) ，碳青烯酶類藥敏板條(上海星佰有限公司)，TaqDNA聚合酶、dNTPs 、DL2000 Marker、限制性內切酶XbaⅠ、蛋白酶K、TBE(大連TaKaRa公司)，PCR引物合成(上海生工生物公司)，Gold View核酸染料(上海賽百盛公司)，瓊脂糖(GENE 公司)，核酸提取試劑盒(德國QIAGEN公司)。

1.4 菌株復核及抗菌藥物敏感性試驗 菌株復蘇后經VITEK 2 Compact 分析儀鑒定。先用VITEK 2 Compact 全自動微生物分析儀GN14藥敏卡進行藥物敏感性試驗，再用稀釋法對碳青烯酶類藥物進行分析，判讀及結果解釋依照2014年美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI) 文件進行。

表1 實驗菌株來源

Tab.1 Information of strains

菌株編號StrainID標本Specimen菌株編號StrainID標本Specimenkp6sputumkp37sputumkp7sputumkp38woundsecretionkp8urinekp42bloodkp9urinekp44drainagekp10sputumkp45sputumkp11urinekp49sputumkp12sputumkp52sputumkp16urinekp62urinekp22sputumkp66sputumkp24urinekp70sputumkp25bloodkp71sputumkp26woundsecretionkp72sputumkp27sputumkp76sputumkp28sputumkp77urinekp31sputumkp78urinekp32sputumkp79sputumkp33sputumkp96drainagekp34bloodkp99bloodkp36sputumkp105sputum

1.5 碳青霉烯酶檢測(改良Hodge 試驗) 將0.5麥氏濁度單位的大腸埃希菌ATCC25922菌液稀釋10倍后均勻涂布在M-H平板上，中間貼美羅培南紙片(10 μg /片) ，使用1 μL接種環挑取3個過夜生長實驗菌株菌落垂直于藥敏紙片從紙片邊緣開始劃線，長度為20～25 mm，35 ℃孵育16～20 h，美羅培南抑菌圈處出現凹進現象者為改良Hodge試驗陽性，提示該菌株產碳青霉烯酶。陽性質控菌為肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705，陰性質控菌為肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1706。

1.6 DNA提取 挑取一定量的新鮮培養物懸濁于100 μL純水，沸水浴30 min后，10 000 r/min離心5 min，吸取上清液即為DNA模板，-20 ℃以下保存。1.7 基因檢測與分析 以聚合酶鏈反應(PCR)法檢測耐藥基因blaKPC、blaNDM基因，引物由上海生工合成，引物序列和擴增條件詳見表2，所有反應體系為25 μL，含有正向引物(F)和反向引物(R)各1 μL、DNA 模板2 μL，10×Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、ddH2O 16 μL，Taq酶0.5 μL。反應過程各項參數為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min，退火1 min，(退火溫度各基因略有不同)，72 ℃ 1min， 30 個循環，72 ℃延伸7 min。PCR 擴增產物經Gold View核酸染料的1.5%瓊脂糖電泳。用凝膠成像系統觀察結果并拍照。對攜帶blaKPC、blaNDM基因的菌株采用PCR方法擴增基因全長及測序，所測得序列與GenBank已發表的blaKPC-2、blaNDM-1基因序列比對。

表2 基因引物序列、產物大小及退火溫度

Tab.2 Primers product size and annealing temperature used in this study

引物名稱Primername引物序列(5＇→3＇)Primersequences產物大小(bp)Productsize退火溫度(℃)AnnealingtemperatureblaKPC?FATGTCACTGTATCGCCGTCT88256blaKPC?FTTTTCAGAGCCTTACTGCCCNDM?1?UF：TCGCATAAAACGCCTCTG100755NDM?1?LR：GAAACTGTCGCACCTCAT

1.8 PFGE聚類性分析 參照PulseNet China標準實驗方案，實驗菌株和沙門菌H9812均選用XbaI酶切。PFGE電泳系統為Bio-Rad公司CHEF DRIII型，電泳電壓6 V，夾角120°，脈沖條件為6～36 s，18.5 h。獲得的電泳圖像以BioNumerics6.6數據庫軟件進行分型分析。

1.9 MLST分析 對實驗菌株的7個管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB) 參照http：//www．pasteur．fr/recherche/genopole/PF8/mlst/primersKpneumoniae． html 公布的通用引物及退火溫度進行PCR擴增并測序，將序列與數據庫中儲存的序列比對，確定其等位基因譜型及菌株序列型(ST型) 利用官方提供的工具生成Minimum Spanning Trees。

2 結 果

2.1 抗生素敏感性試驗結果 根據美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)推薦的解釋標準。 我們分別用Vitek GN14藥敏板條和上海星佰公司的碳青霉烯類板條開展了抗生素敏感性試驗。

38株肺炎克雷伯菌用GN14板條的藥敏結果，對碳青霉烯類藥物厄他培南、亞胺培南、美洛培南耐藥率為23.68%(9/38)，(菌株號分別為KP11、KP22、KP24、KP25、KP28、KP31、KP33、KP36、KP49)，阿米卡星、左氧氟沙星、四環素、呋喃妥因、甲氨芐啶/磺胺甲惡唑、慶大霉素耐藥率為23.68%～44.74%，阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑啉、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南、環丙沙星耐藥率均大于52.63%，氨芐西林、哌拉西林耐藥率100%，有9株菌同時對3種碳青霉烯類藥物耐藥。

38株肺炎克雷伯菌用上海星佰公司的碳青霉烯類板條進行試驗，其結果為對碳青霉烯類藥物亞胺培南、美羅培南、厄他培南耐藥率分別為18.42%(7/38)、28.95%(11/38)、 34.21%(13/38)，其中有7株(18.42%)同時耐3種藥物(菌株號分別為KP11、KP12、KP22、KP24、KP25、KP26、KP28、KP31、KP33、KP36、KP42、KP44、KP49)見表3。

表3 38株肺炎克雷伯菌菌株的藥敏結果

Tab.3 Antibiotic sensitivity results of 38 K. pneumonia strains

抗菌素名稱antibiotics檢測菌株數No．ofstrainstested敏感菌株數No．ofsensitivestrains中介菌株數No．ofintermediarystrains耐藥菌株數No．ofresistancestrains耐藥率%Resistantrate亞胺培南Imipenem38274718．42美羅培南Meropenem382701128．95厄他培南Ertapenem382501334．21

2.2 碳青霉烯酶檢測結果 經改良 Hodge 試驗檢測，38株肺炎克雷伯菌中有11 株產碳青霉烯酶，占28.95%，分別為KP7、KP11、KP22、KP24、KP25、KP28、KP33、KP36、KP45、KP49、KP105。

2.3 耐藥基因PCR檢測及測序結果 采用blaKPC、blaNDM基因特異引物進行PCR擴增及產物測序，確定菌株是否攜帶blaKPC或blaNDM基因及其型別。38株肺炎克雷伯菌經PCR擴增檢測出5株攜帶blaKPC基因(KP25、KP28、KP33、KP45、KP49、)，4株攜帶blaNDM基因(KP11、KP22、KP24、KP105)，KPC或NDM基因陽性的，通過測序和BLAST比對，與KPC-2或NDM-1基因完全一致。

2.4 PFGE 結果分析 對攜帶blaKPC-2、blaNDM-1耐藥基因的9株菌株進行PFGE分型分析，經XbaⅠ內切酶酶切后進行PFGE分型，其中1株菌(KP45)發生DNA降解未獲得圖譜，其余8株PFGE圖譜條帶清晰。將圖譜錄入BioNumerics軟件進行分析和構建聚類樹(圖1)。結果顯示，8株菌株中PFGE帶型各不相同，相似系數在56%～71%之間。

2.5 MLST分析 通過MLST分型，9株菌分為5種MLST 型別(ST型)。其中攜帶blaKPC-2基因的5株菌分為2種ST型，其中4株為ST11型，1株為ST15型；4株攜帶blaNDM-1基因的菌株分為4種不同的ST型，分別為ST15、ST395、ST1031、ST1412。見表4、圖2。

圖1 8株肺炎克雷伯菌PFGE結果聚類圖Fig.1 Cluster tree of eight K.pneumonia strains based on PFGE patterns

圖2 9株肺炎克雷伯菌MLST分型最小生成樹Fig.2 Minimum spanning tree of nine K.pneumonia strains based on MLST

表4 MLST等位基因和耐藥基因結果

Tab.4 Results of MLST and distribution of antibiotic resistance genes

實驗菌株StrainID耐藥基因AntibioticresistancegenesMLST等位基因譜MLSTprofileST型MLSTtypeJX2014KP11NDM?13?1?2?4?1?1?4ST?395JX2014KP22NDM?11?1?1?1?1?1?1ST?15JX2014KP24NDM?12?5?1?1?4?1?18ST?1412JX2014KP25KPC?21?1?1?1?1?1?1ST?15JX2014KP28KPC?23?3?1?1?1?1?4ST?11JX2014KP33KPC?23?3?1?1?1?1?4ST?11JX2014KP45KPC?23?3?1?1?1?1?4ST?11JX2014KP49KPC?23?3?1?1?1?1?4ST?11JX2014KP105NDM?118?22?18?23?134?13?51ST?1031

3 討 論

肺炎克雷伯菌是最常見的醫院感染菌，可引起下呼吸道、泌尿生殖道、血流、傷口及顱內等感染。隨著碳青霉烯類抗生素這類藥物在臨床上的廣泛應用，碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌菌株逐漸增多并出現播散的現象，給臨床的治療帶來了極大的困難。我們從臨床病例標本中分離出的38株肺炎克雷伯菌，經改良Hodge試驗結果顯示，11株菌產碳青霉烯酶，可見產碳青霉烯酶是造成肺炎克雷伯菌對碳青霉烯酶類抗菌藥物敏感性下降的一個重要原因[3]。

碳青霉烯酶依據Ambler分類有A、B和D 3類，我國耐碳青霉烯類抗生素的肺炎克雷伯菌主要以A類和B類為主。A類碳青霉烯酶，最多見的是KPC型碳青霉烯酶，我國多以KPC-2為主；B類碳青霉烯酶，即金屬酶，包括 IMP、VIM、SPM、GIM、SIM、SFO 和 NDM-1 等[4]，最近幾年報道的超級細菌攜帶的NDM-1也屬于B類酶；NDM-1首次在印度引起暴發感染以來，陸續在世界各地都有報道發現NDM-1引起的感染[5]。中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所2010年首次報道了在屎腸球菌中分離到3株NDM-1細菌。

本實驗有2株菌Hodge試驗陽性(KP7、KP36)，但未檢測到blaNDM或blaKPC基因。這2株菌可能產其它類型的碳青霉烯酶，例如IMP、VIM等。另外有部分菌株的抗生素敏感性試驗結果對碳青霉烯類抗生素耐藥，但是Hodge試驗陰性，提示可能存在產酶以外的耐藥機制。

PFGE可以檢測菌株之間可能存在的流行病學關聯性。本研究中，8株攜帶blaNDM-1或blaKPC-2基因的肺炎克雷伯菌，帶型各不相同，表明存在不同的來源，為散發病例，提示江西雖然檢出攜帶blaNDM-1肺炎克雷伯菌菌株，但未造成局部流行。目前全球范圍內肺炎克雷伯菌播散最廣的克隆是ST258，而中國報道的主要流行株是ST11[6]，本研究結果顯示ST-11為產KPC的肺炎克雷伯菌中主要的克隆型 (4/6)，與文獻[6]報道的一致。ST-11與 ST-258只有一個單基因位點變異(tonB) ，這表明他們之間密切相關。ST-11和ST-258屬于同一個克隆群，CC258。而產NDM-1的肺炎克雷伯菌克隆型為ST-15、 ST-395、ST-1412、ST-1031。ST-15在全球流行非常廣泛，如美國、丹麥、匈牙利、韓國、馬來西亞、新加坡、中國大陸和中國臺灣均有報道[7-9]。本研究檢出2株ST-15，產NDM-1和產KPC-2的菌株各1株。此外，ST395屬于CC258 的亞群 CC292，本研究產NDM-1肺炎克雷伯菌也有1株。此次還檢測到ST-1412新的ST型，已被MLST數據庫確認收錄。

KPC型碳青霉烯酶是一種非金屬碳青霉烯酶，可水解碳青霉烯類、青霉素類、頭抱菌素類和氨曲南等抗生素。由攜帶KPC基因的肺炎克雷伯菌株所致的醫院感染，由于耐藥水平極高，并可在醫院內傳播擴散，對臨床患者的治療造成了極大的困難，因此醫院必須加強監測和控制，以減緩耐藥菌株的產生和傳播。

攜帶NDM-1基因細菌的高耐藥性已經成為威脅人類公共健康的主要危險和治療感染性疾病的主要挑戰。NDM-1金屬酶較其他碳青霉烯酶水解活性強，編碼該酶的基因位于質粒等移動遺傳因子上，使得該類酶基因可在細菌間廣泛傳播，我們應該系統的監測blaNDM-1在革蘭陰性的臨床菌株之間的傳播和擴散。

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Resistance genes distribution and molecular typing characteristics of carbapenem-resistantKlebsiellapneumonia

YANG Meng，WANG-Peng，XU Xiao-qian，XIONG Chang-hui，LIU Xiao-qing,YUAN Hui，PAN Huan-hong

(DepartmentofCommunicableDiseaseControlandPrevention，JiangxiProvinceCenterforDiseaseControlandPrevention，Nanchang330029，China)

To reveal the distribution of resistance genes and molecular typing characteristics of carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，38 clinical carbapenem-resistantK.pneumoniawere collected and analyzed by broth dilution antibiotic susceptibility test，modified Hodge test，PCR and electrophoresis，pulsed-field gel electrophoresis typing (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST). Results showed that 7 (18.42%)，11 (28.95%)，and 13 (34.21%) strains showed resistance to imipenem，meropenem，ertapenem，respectively.Of which，7 strains showed resistance to all three antibiotics,eleven strains showed positive results of modified Hodge test,and among them five and four strains carried KPC-2 and NDM-1 genes respectively. These nine strains showed eight different PFGE patterns，and five MLST types.In coclusion，antibiotic resistance amongK.pneumoniaeis serious. KPC-2 and NDM-1 genes are the main cause ofK.pneumoniaeresistant to carbapenems. There was high genetic diversity exists in these strains, suggesting there might no direct relationship of these strains.

Klebsiellapneumoniae; carbapenemase; resistance gene; molecular typing Supported by grants from the Priority Project on Infectious Disease Control and Prevention (No.2013zx10004203-002-007) and the Science and Technology Plan of Jiangxi Province (No.20123154).

Yuan Hui, Email: jxcdcyuanhui@126.com

國家科技重大專項基金項目 (No.2013zx10004203-002-007)，江西省衛計委科技計劃(No.20123154)聯合資助

袁 輝，Email：jxcdcyuanhui@126.com

江西省疾病預防控制中心，南昌 330029

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.001

R378.99

A

1002-2694(2016)12-1039-05

2016-06-29；

2016-10-19