常壓室溫等離子體技術誘變選育鲅魚抗氧化肽發酵菌株

艾冰花, 艾麗花, 李秉鈞, 馮俊榮, 韓龔文, 于本淑

(1. 煙臺大學 海洋學院, 山東 煙臺 264005; 2. 煙臺大學 生命科學學院, 山東 煙臺 264005; 3. 龍口市水產技術推廣站, 山東 龍口 265700; 4. 山東省水生生物資源養護管理中心, 山東 煙臺 264003)

常壓室溫等離子體技術誘變選育鲅魚抗氧化肽發酵菌株

艾冰花1, 艾麗花2, 李秉鈞1, 馮俊榮1, 韓龔文3, 于本淑4

(1. 煙臺大學 海洋學院, 山東 煙臺 264005; 2. 煙臺大學 生命科學學院, 山東 煙臺 264005; 3. 龍口市水產技術推廣站, 山東 龍口 265700; 4. 山東省水生生物資源養護管理中心, 山東 煙臺 264003)

鲅魚(Spanish mackerel)加工后的廢棄物富含蛋白質, 為了提高蛋白質的利用率并減少環境污染,可以采用微生物發酵的方法酶解這部分蛋白質制取抗氧化活性肽。本實驗室已經篩選出一株芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Hy-2, 以其發酵水產加工廢棄物得到了具有較高抗氧化性的產物。為了進一步提高產物的抗氧化性, 作者以該株產蛋白酶芽孢桿菌Hy-2為出發菌, 采用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變的方法篩選出1株突變菌Hy-23, 以鲅魚加工后的廢棄物為原料, 接種該突變菌株進行發酵, 得到了具有一定抗氧化活性的發酵產物, 酶解物總抗氧化活性提高了12.4%。經遺傳穩定性測定, 該芽孢桿菌突變株在傳代8次之后其遺傳穩定性仍然良好。

常壓室溫等離子體; 蛋白酶; 抗氧化活性; 遺傳穩定性

天然抗氧化劑抗氧化效率高、對機體無毒副作用, 已成為研究的熱點[1]。由于海洋生物源蛋白的種類和數量遠遠大于陸地生物源蛋白, 其蘊藏的活性肽片段也多種多樣[2]。因此, 使用海洋水產動物加工廢棄物制備抗氧化肽可以提高蛋白質的利用率, 也增加了原料的產值。常壓室溫等離子體(Atmospheric and Room Temperature Plasma, ARTP)是近幾年發展起來的一種等離子體源, 其主要成分是活性離子,與生物大分子和細胞作用效果明顯, ARTP誘變技術操作方便, 產生突變的多樣性大, 對處理材料損傷較輕, 安全性高, 已經成功實現了30種以上微生物的突變, 成為高效的微生物基因組突變新方法[3-7]。作者采用ARTP誘變的方法篩選出了一株能有效降解鲅魚(Spanish mackerel)蛋白, 且酶解物具有一定抗氧化活性的菌株Hy-23, 接種該菌的發酵產物總抗氧化活性提高了12.4%。研究結果為以后發酵制取抗氧化肽提供了一定微生物學基礎[8]。

1 材料與方法

1.1 原料與供試菌株

鲅魚粉: 鲅魚加工后的邊角料, 不包含頭, 鰭和內臟, 經絞碎, 干燥, 有機溶劑脫脂后烘干并過80目篩網, 蛋白質含量75.07%, 脂肪含量15.90%。

蛋白酶產生菌Hy-2。該菌在室溫下于鲅魚加工廢棄物中篩選, 具有一定水解鲅魚蛋白的蛋白酶活力。

1.2 主要儀器與設備

常壓室溫等離子體誘變系統(ARTP), ARTP-IIS型(北京思清源生物科技有限公司); 臺式高速離心機, H1650-W型(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司);數顯光照振蕩培養箱, 250HG型(金壇市精達儀器制造廠)。可見分光光度計, V-1100D型(上海美譜達儀器有限公司); 立式壓力蒸汽滅菌器, LDZM-40KCS型(上海申安醫療器械廠)等。

1.3 培養基與試劑

參考艾冰花等[9]的配方稍作修改。

酪素固體培養基: 蛋白胨1.0%、葡萄糖0.1%、氯化鈉0.5%、氯化鈣0.01 %、L-酪氨酸0.01%、瓊脂2.2%、干酪素0.5%, pH 6.6。

試劑: 牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、NaCl、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、Na2CO3、三氯乙酸、干酪素、L-酪氨酸、福林酚等; 總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌株Hy-2生長曲線的測定

參考艾冰花等[9]的試驗方法和結果。

1.4.2 ARTP誘變育種步驟

使用無菌生理鹽水制備的菌懸液作為ARTP系統的處理對象。優先采用對數期細胞, 為保證處理的均一性, 菌濃度不宜太高, 一般為106～108個/mL。本實驗中菌懸液濃度為1.25×107個/mL。

參考范新蕾等[10]的參數設置, 在超凈臺內, 將載玻片置于酒精燈外焰灼燒30 s, 待冷卻后放到已滅菌的培養皿中, 取10 μL菌液均勻涂布在載片表面。將裝有樣品載片的培養皿移至ARTP誘變育種儀操作室, 用無菌鑷子將載片放到對應凹槽。調節手動旋轉樣品載臺旋鈕, 使載片與等離子體發生器射流出口間距約為2 mm; 設定功率為120 W、氣量為10 L/min,處理時間設定完畢后開始處理樣品。全部樣品處理完畢, 用無菌鑷子將載片分別放至裝有1mL無菌溶液的EP管中。將EP管置于振蕩器上振蕩1 min, 把附著在載片上的微生物洗脫到無菌溶液中, 形成新的菌懸液。最后, 對處理過的菌懸液進行適當稀釋, 取100 μL稀釋液涂布培養皿, 培養計數。計算致死率。

1.4.3 蛋白酶活力初選

按照最佳照射時間處理菌懸液后, 將菌懸液涂布到酪素固體培養基上, 28℃生長24 h后, 挑選菌落較大的或者透明水解圈直徑與菌落直徑比值(HE值)大的菌落, 作為總抗氧化性復篩的菌株。

1.4.4 抗氧化活性復篩

將蛋白酶活力初選得到的菌以2%的接種量接種于總抗氧化活性復篩培養基中, 28℃搖瓶發酵, 根據經驗, 取發酵48 h的發酵液, 沸水浴滅酶10 min后, 10 000 r/min, 離心10 min, 取上清液測定發酵液總抗氧化活性。

總抗氧化活性的測定使用總抗氧化能力測定試劑盒。機體中有許多抗氧化物質, 能使Fe3+還原成Fe2+, 后者可與菲啉類物質形成穩固的絡和物, 通過比色可測出其抗氧化能力的高低。按照說明書的步驟進行加樣, 取樣量為0.2 mL。計算公式為

式中, MT-AOC為總抗氧化能力(U); A為測定OD值; A0為對照OD值; V1為反應液總量(mL); V2為取樣量(mL); N為樣本測試前稀釋倍數; V3為發酵液體積(mL)。

1.4.5 遺傳穩定性測定

將正突變株接種于蛋白酶初選培養基上, 連續傳代8次[11], 用每一次傳代的菌株進行發酵試驗, 均測定酶解物總抗氧化活性。

根據遺傳穩定性測定的結果, 確定遺傳穩定性較好的突變株, 使用該突變株進行發酵試驗, 使用SPSS數據處理軟件對發酵液總抗氧化活性進行單因素方差分析, 進一步驗證數據的可靠性。

2 結果與分析

2.1 菌株Hy-7生長曲線

如圖1所示, 菌株Hy-2的對數生長期為12 h～20 h,因此選擇生長14 h的菌即對數中前期的細胞做ARTP誘變[12]。

圖1 菌株Hy-2生長曲線Fig. 1 Growth curve of bacteria Hy-2

2.2 ARTP誘變時間的選擇

由圖2可以看出, 隨著照射時間的增加, ARTP誘變的致死率增加。根據現代育種理論, 致死率達到90%～95%范圍時, 產生正突變的幾率較高[13]。因此選擇ARTP誘變的時間為120 s, 此時的致死率為91%。稀釋倍為105時, 菌落數大小合適, 菌落水解圈清晰可見, 因此ARTP誘變的條件為等離子體照射120s, 稀釋倍數為105。

圖2 菌株Hy-2在不同時間ARTP照射下的致死率Fig. 2 Lethal rate of bacteria Hy-2 at different times under ARTP

2.3 蛋白酶活力初選

根據菌落大小以及HE值篩選出9個突變株, 其HE值如表1所示。其中菌株Hy-22, Hy-25, Hy-26, Hy-27, Hy-29的HE值較出發菌Hy-2大, 菌株Hy-21, Hy-23, Hy-24, Hy-28的HE值雖然較出發菌小, 但其菌落直徑明顯比較大[14]。由于這9株突變菌雖具有一定的產酶能力, 但在以鲅魚加工廢棄物蛋白為底物時, 它們分解出來的肽的抗氧化性各不相同, 要選擇能夠水解鲅魚蛋白, 且水解物具有較高抗氧化活性的菌株則需要進一步做水解物總抗氧化活性復篩。因此選擇這9株突變菌株接種于菌種傳代保藏培養基中做下一步篩選。

表1 9個突變株蛋白酶活力初選結果Tab.1 HE of nine mutants in the preliminary selection

2.4 總抗氧化活性復篩

分別接種9株蛋白酶活力初選得到的菌株于種子液培養基中, 30℃搖瓶培養26 h作為復篩的種子液, 以2%的接種量將9個突變株種子液接種于總抗氧化活性復篩培養基中。搖瓶發酵48 h后, 取各自的發酵液離心(10 000 r/min, 10 min)澄清后測定總抗氧化活性。結果如表2所示, 只有7個突變株的總抗氧化活性比出發菌高, 選擇總抗氧化性增加率大于10%的菌株可以確定為正突變, 分別為Hy-1, Hy-2, Hy-3號菌株。

下一步需要對這3株突變株進行遺傳穩定性測定, 以確保其在傳代的過程中其產酶是穩定的。

表2 9個突變株總抗氧化活性復篩結果Tab. 2 Total antioxidant activity of nine mutants in the second screening

2.5 遺傳穩定性測定

3株突變株的遺傳穩定性測定結果如圖3所示:在連續傳代8次中, 菌株Hy-21發酵的水解物總抗氧化性增加率始終不高, 與篩選時的增加率10.4%相差較大, 且在第七次傳代中出現了負值。菌株Hy-22發酵的水解物總抗氧化性增加率在八次傳代中與復篩時的增加率相比, 數值的波動較大。菌株Hy-23發酵的水解物總抗氧化性增加率在八次傳代中與復篩時的增加率相比數值差別不大, 且數值的穩定性較好, 增加率為11.6%～13.6%(排除了異常值8.7%), 增加率波動在6.4%～9.6%, 波動不超過10%。

突變株Hy-23的單因素方差分析結果如表3所示: P=0.095(＞0.05), 說明8次傳代過程中, 發酵液的總抗氧化活性變化不顯著。說明Hy-23號突變菌的遺傳穩定性較好, 可以作為最終的ARTP誘變育種的突變株。

圖3 3個突變株遺傳穩定性結果Fig. 3 Genetic stability results for three mutant strains

對比艾冰花等[9]的結果, 正突變菌往往是菌落直徑較出發菌大的, 相比HE值對正突變的貢獻率,菌落直徑可能起到更大的作用。說明經過突變后, 正突變菌生長可能更為迅速, 產酶更加活躍, 這一點還有待進一步研究。

表3 突變株Hy-23單因素方差分析結果Tab. 3 Results of the single-effect analysis of variance of mutant Hy-23

3 討論

雖然ARTP誘變技術是一種新型的誘變技術,然而利用該技術已經取得了不少成果。柏中中等[15]利用ARTP誘變技術篩選獲得了一株D-乳酸高發酵菌株, 其D-乳酸發酵產率比出發菌提高了36.3%。通過ARTP技術對拜氏梭菌(Clostriadium beijerinckii)進行誘變, 其誘變株丁醇產量提高10%, 丙酮/丁醇/乙醇產量提高24%以上[16]。薛剛等[17]利用ARTP誘變技術選育出一株高產蛋白酶菌株, 蛋白酶活力是出發菌的1.56倍。

與艾冰花等[9]利用紫外誘變選育抗氧化肽發酵菌株的結果相對比, 前者利用兩次紫外誘變得到發酵產物總抗氧化活性提高了10.2%, 后者只利用一次ARTP誘變即獲得總抗氧化性提高12.4%的發酵產物。由此可以推測, ARTP誘變技術作為一種新型的誘變技術可以在一定程度上克服長期使用紫外誘變產生的抗性缺陷。沈小靜等[4]利用常壓室溫等離子體射流誘變(ARTP)和紫外照射對紅霉素產生菌進行復合誘變, 得到4株產量明顯提高的突變菌株, 4株菌的平均發酵效價較出發菌株提高25.2%。由此可以推測, 本研究今后可以采用紫外誘變結合ARTP誘變選育抗氧化活性肽的發酵菌株, 可期待獲得性能更優良的菌株。

本研究前期探索了發酵產物的不同多肽濃度對DPPH自由基的清除率, 對鄰苯三酚自氧化的抑制率以及對亞油酸自氧化的抑制率, 結果發現多肽濃度與三者之間均存在較好的線性關系, 因此可以說明發酵產物為抗氧化活性肽。

4 結論

通過等離子體誘變, 得到了可以水解鲅魚加工廢棄蛋白的芽孢桿菌突變株, 利用該突變菌發酵得到的發酵液總抗氧化活性提高了12.4%, 具有較高的工業化應用潛力, 對鲅魚加工廢棄蛋白資源的充分利用和天然抗氧化劑的開發也具有一定的意義。由于傳統誘變的方法的反復使用, 使得其作用于微生物時具備了一定的抗性。等離子體誘變技術作為一種新興有效的誘變方法可以在一定程度上彌補傳統方法的缺陷。研究結果也表明利用ARTP誘變技術能夠取得較滿意的結果。本研究后續還需要對突變株Hy-23進行分子水平的研究, 分析其發酵性能提高的內在原因。

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Received: Nov. 9, 2015

A mutant strain of Spanish mackerel antioxidant peptide fermentation obtained by atmospheric and room temperature plasma

AI Bing-hua1, AI Li-hua2, LI Bing-jun1, FENG Jun-rong1, HAN Gong-wen3, YU Ben-shu4
(1. School of Ocean, Yantai University, Yantai 264005, China; 2. School of Life Science, Yantai University, Yantai 264005, China; 3. Longkou Aquaculture Technology Extending Stations, Longkou 265700, China; 4. Shandong Hydrobios Resources Conservation and Management Center, Yantai 264003, China)

Atmospheric and room temperature plasmas(ARTP); protease; antioxidant activity; hereditary stability

The processed waste of Spanish mackerel is rich in proteins. Antioxidant active peptide preparation via microorganism fermentation can efficiently utilize these proteins and reduce the environmental pollution caused by S. mackerel processed waste. One strain of Bacillus Hy-2 was obtained using the processed waste of aquatic products as the substrate; this resulted in the production of protein hydrolysates with high antioxidant activity. The antioxidant activity of protein hydrolysates was further improved via mutation of the original strain of protease producing Bacillus Hy-2 using atmospheric and room temperature plasmas. A strain of Bacillus Hy-23 with a strong hereditary stability was screened from these mutants; this strain continued to allow a stable enzyme production even after eight generations. Using waste proteins obtained from S. mackerel production as the substrate and an inoculating mutant strain Hy-23, the fermentation process allowed the production of protein hydrolysates with a 12.4% increase in antioxidant activity.

Q933

A

1000-3096(2016)11-0028-06

10.11759//hykx 20151109002

(本文編輯: 譚雪靜)

2015-11-09;

2016-02-26

山東省科技發展計劃項目(2012GHY11515)

[Foundation: Science and Technology Development Projects of Shandong Province, No.2012GHY11515]

艾冰花(1990-), 女, 河南澠池人, 碩士, 主要從事水生生物學和微生物學研究, 電話: 13356903651, E-mail: 963007166@ qq.com; 李秉鈞, 通信作者, 教授, E-mail: li6234307@163.com