產木聚糖酶的枯草桿菌篩選及稀土Er3+的誘變

胡建華，楊志杰，潘麗珍，劉娜林，胡 玥，薛利敏

（1.內蒙古工業大學 化工學院，內蒙古呼和浩特 010051；

2.內蒙古化工職業學院 化學工程系，內蒙古呼和浩特 010070）

產木聚糖酶的枯草桿菌篩選及稀土Er3+的誘變

胡建華1，楊志杰2，潘麗珍1，劉娜林1，胡 玥1，薛利敏1

（1.內蒙古工業大學 化工學院，內蒙古呼和浩特 010051；

2.內蒙古化工職業學院 化學工程系，內蒙古呼和浩特 010070）

篩選了新的產木聚糖酶的枯草芽孢桿菌，通過在對數期加入稀土Er3+進行誘變，發現稀土對枯草桿菌的生長沒有顯著影響，對酶也沒有直接影響，但是1×10-5mol/L的Er3+可以顯著提高木聚糖酶的酶活，酶活提高達102.2%，為木聚糖酶的誘變篩選提供新的方法。

木聚糖酶；枯草桿菌；稀土；誘變

木聚糖是植物半纖維素的主要成分，含量僅次于纖維素的可再生多糖資源[1]。木聚糖酶以內切方式水解木聚糖中的β-1，4糖苷鍵，這一作用既可降低木聚糖的粘性和抗營養性，又可產生具保健和調節胃腸功能的低聚木糖，因而有廣泛的應用前景。通過篩選新的高產菌株以及通過誘變等方法獲得高酶活菌株，對于降低生產成本，提高生產效率都有重要的意義[2]。稀土具有優良的生物學特性，適宜的稀土可以促進微生物的生長及產酶的提高，而高濃度的稀土則有抑制作用[3]。本文篩選新的產木聚糖酶的菌株，通過稀土誘變提高木聚糖酶的酶活，為深入研究稀土促進木聚糖酶的機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

取自呼和浩特郊區的土壤中。

1.1.2 培養基

篩選培養基為加入0.5%木聚糖的LB固體培養基。發酵培養基為0.5%木聚糖LB液體培養基。

1.1.3 木聚糖的提取

將玉米芯粉碎后用4%NaOH室溫浸泡過夜，抽濾取濾液，用HCl調至pH為4.5，加等體積乙醇，離心得沉淀，于45℃下烘干備用。

1.1.4 試劑

所用試劑皆為化學純或生物純。所用稀土ErCl3為自備，將稀土Er2O3與1∶1的鹽酸按摩爾比1∶6混合，攪拌使其溶解，所得溶液在沸水浴上加熱蒸發至干，置于干燥器中至恒重，即可制備出ErCl3·6H2O稀土氯化物。

1.2 方法

1.2.1 菌種篩選

在含有0.5%木聚糖的LB固體培養基能夠長出透明圈的菌落即為產木聚糖酶的菌株，經劃線分離，挑取單菌落保存鑒定。

1.2.2 菌種培養及稀土誘變

將配好的含0.5%木聚糖的液體LB培養基滅菌后接入產木聚糖酶的菌株，5%的接種量，裝液量為50mL（250mL三角瓶）在36℃、160r/min培養條件下搖床培養。培養8h后加入1×10-3mol/L、1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L的稀土ErCl3水溶液時，以不加稀土的菌液作為對照組，于36℃、160r/min培養，間隔一定時間取樣測OD600，72h后停止培養。將菌液以6 000r/min離心5min，取上清液即為粗酶液，測定木聚糖酶活性，每組三個平行樣。

1.2.3 Er3+對木聚糖酶的直接作用

在對照組的粗酶液中直接加入相同濃度的ErCl3水溶液，靜置2h，測定酶活。

1.3 木聚糖酶酶活的測定

以0.5%的木聚糖為底物溶液（pH為6.0），加入待測酶液在50℃反應30min后，加入DNS試劑沸水浴中保溫顯色5min后，540nm的波長下測其吸光度（OD=）值。酶活定義：1mL粗酶液在pH為6.0、50℃下每分鐘分解木聚糖產生1μg木糖為一個酶活單位。

2 結果與討論

2.1 產木聚糖酶的枯草桿菌的篩選

篩選有木聚糖透明圈的菌株經鑒定為枯草芽孢桿菌，命名為Bacillus subtilis QSH4。枯草桿菌是目前應用較多潛力較大的一族革蘭氏陽性細菌，可以分泌多種有用產物，在工業上長期被用于生產蛋白酶及淀粉酶等。

2.2 Er3+對生長的影響

加入稀土離子后對枯草桿菌的生長曲線見圖1。從圖1可以看出，在對數期早期加入不同濃度的稀土Er3+對生長僅有微弱促進作用。稀土離子對生物生長也具有“高抑低促”的現象，但是本實驗中選擇的濃度及稀土種類對枯草桿菌的生長基本沒有影響。

圖2 .1 稀土對枯草桿菌生長的影響

2.3 Er3+對木聚糖酶的直接作用

將不同濃度的稀土離子加入到木聚糖酶的溶液中見圖2，1×10-3mol/L的Er3+對于木聚糖酶有輕微的抑制作用，其余三個濃度的稀土離子也沒有明顯的促進作用。本次所用的稀土離子對于木聚糖酶作用不明顯。

圖2 Er3+對木聚糖酶的直接響

2.4 Er3+對枯草桿菌產酶的影響

加入四個濃度的Er3+后，對酶活的影響見圖3。從圖3可以看出，加入1×10-3mol/L的稀土離子后，對酶活有抑制作用，而1×10-4～1×10-6mol/L濃度的稀土離子對木聚糖酶活有促進作用，相比對照組酶活4.15U/mL，1×10-5mol/L的促進效果最好，酶活達到8.39U/mL提高達102.2%。

圖2 .3 Er3+對枯草桿菌產木聚糖酶的影響

3 結論

在生長早期加入1×10-4～1×10-6mol/L的稀土Er3+對枯草桿菌產木聚糖酶活有促進作用，酶活提高達102.2%。但是稀土離子對枯草桿菌生長及木聚糖酶沒有直接的影響，具體機理需進一步研究。

[1] 邱并生.耐堿性木聚糖酶[J].微生物學通報，2013，40（5）：904.

[2] 常英，張冬艷，胡建華，等.ErCl3作用下枯草桿菌所產α-淀粉酶的溫度、pH性質[J].蘭州理工大學學報，2009，350（6）：76-78.

[3] 盧慶華，江夢宇，高志紅，等.La3+對青霉菌產漆酶及其酶的影響[J].稀土，2016，37（4）：148-151.

Screening of Bacillus Subtilis Producing Xylanase and mutagenesis of Er3+

Hu Jian-hua，Yang Zhi-jie，Ρan Li-zhen，Liu Na-lin，Hu Yue，Xue Li-min

A new xylanase-producing Bacillus subtilis was screened and mutagenized by addition of Er3+in the log phase.It was found that rare earth did not significantly affect the growth of Bacillus subtilis and the enzyme had no direct influence，/L of Er3+can significantly improve the enzyme activity of xylanase，enzyme activity increased to 102.2%，for the mutagenesis of xylanase screening to provide a new method.

xylanase；bacillus subtilis；rare earth；mutagenesis

TQ925

A

1003–6490（2016）10–0103–02

2016–09–20

內蒙古工業大學科研基金資助項目（X200707）；內蒙古工業大學大學生創新實驗計劃（2015045）；內蒙古化工職業學院基金資助項目（HYZR1410）。

胡建華（1979—），男，內蒙古清水河縣人，講師，主要研究方向為生物化工。