細(xì)菌VBNC態(tài)檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

趙黎黎，包秋華，趙國芬

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

細(xì)菌VBNC態(tài)檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

趙黎黎1，包秋華2*，趙國芬1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

細(xì)菌在一些不良?jí)毫l件下會(huì)進(jìn)入“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”(viable but non-culturable，VBNC)，其仍具有活力但不能采用常規(guī)的平板培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，VBNC態(tài)細(xì)菌一旦培養(yǎng)條件適宜仍能繼續(xù)生長繁殖，有些致病菌依舊具有毒力。如果檢測(cè)方法不當(dāng)，會(huì)造成假陽性或假陰性的結(jié)果，需要采取適合的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。文章概述了幾種檢測(cè)VBNC態(tài)細(xì)菌的方法，如活菌直接計(jì)數(shù)法、核酸染料檢測(cè)法、呼吸檢測(cè)法、分子生物學(xué)法、免疫學(xué)法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)法等，并對(duì)檢測(cè)方法的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行了評(píng)述。

細(xì)菌;活的非可培養(yǎng)態(tài)VBNC;檢測(cè)方法

徐懷恕等［1］在研究霍亂弧菌(Vibrio Cholerae)和大腸埃希菌(Escherichia coli)的存活規(guī)律時(shí)首次發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的一種特殊存活形式——活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(viable but nonculturable state，VBNC)。VBNC態(tài)不是細(xì)菌在瀕臨死亡時(shí)的狀態(tài)，而是為了適應(yīng)環(huán)境變化而表現(xiàn)出來的生存策略［2］。細(xì)菌VBNC態(tài)指細(xì)菌在不良的環(huán)境條件下，用常規(guī)的培養(yǎng)方法無法使菌落生長繁殖，但細(xì)菌仍具有生物活性，VBNC態(tài)細(xì)菌一旦處于適宜培養(yǎng)條件，仍能繼續(xù)生長繁殖，有些致病菌依舊具有毒力。如果檢測(cè)方法不當(dāng)，會(huì)造成假陽性或假陰性的結(jié)果。目前已有34個(gè)屬的68種細(xì)菌被報(bào)道能進(jìn)入VBNC態(tài)［3］，這對(duì)微生物學(xué)、水質(zhì)量檢測(cè)、流行病學(xué)研究及食品安全方面都具有重要意義。因此，尋找適合有效的檢測(cè)VBNC態(tài)細(xì)菌的方法勢(shì)在必行。本文著重介紹了一些VBNC態(tài)細(xì)菌的檢測(cè)方法，如活菌直接計(jì)數(shù)法、核酸染料檢測(cè)法、呼吸檢測(cè)法、分子生物學(xué)法、免疫學(xué)法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)等方法和應(yīng)用現(xiàn)狀，為今后VBNC態(tài)細(xì)菌的檢測(cè)提供參考。

1 活菌直接計(jì)數(shù)法(direct viable counting，DVC)

活菌直接計(jì)數(shù)法首次被Kogure等［4］使用，該方法是在細(xì)菌培養(yǎng)物中加入營養(yǎng)物質(zhì)和萘啶酮酸(DNA合成抑制劑，使細(xì)菌只生長不分裂［5］)，混合培養(yǎng)6～24 h后用福爾馬林固定，吖啶橙染色，用熒光顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)變化，從而測(cè)定VBNC態(tài)的細(xì)菌數(shù)。后來，人們用環(huán)丙沙星(DNA合成抑制劑)等物質(zhì)來代替萘啶酮酸，并將酵母膏換成10%的大豆蛋白胨起到良好效果。姚斐等［6］運(yùn)用不同濃度的環(huán)丙沙星分別對(duì)北京棒狀桿菌、枯草芽胞桿菌、霍亂弧菌和大腸埃希菌O157H7進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)用萘啶銅酸DVC計(jì)數(shù)和環(huán)丙沙星DVC計(jì)數(shù)結(jié)果相似，均高于平板菌落計(jì)數(shù)。Besnard等［7］采用環(huán)丙沙星來代替萘啶酮酸，有效區(qū)分了李氏桿菌的死活菌，并且檢測(cè)出VBNC態(tài)下的李氏桿菌。Mishra等［8］也利用環(huán)丙沙星代替萘啶酮酸，用改進(jìn)的免疫熒光法結(jié)合直接計(jì)數(shù)法(fluorescent antibody-direct viable count，DFA-DVC)檢測(cè)了霍亂弧菌的VBNC態(tài)。

2 核酸染料檢測(cè)法

目前核酸染料檢測(cè)法包括吖啶橙直接計(jì)數(shù)法(acridine orange direct count，AODC)、4，6-二脒基-二苯基吲哚染色法(4，6-diamino-2 phenylindole，DAPI)和5-氰基-2，3-二甲苯氯化四氮唑(5-cyano-2，3-ditolyltetrazoliumchloride，CTC)等?；罴?xì)菌經(jīng)過染色后呈現(xiàn)橙黃色熒光，當(dāng)細(xì)菌處于穩(wěn)定期、饑餓狀態(tài)或VBNC態(tài)時(shí)呈現(xiàn)綠色熒光。Baffone等［9］對(duì)溶藻弧菌、副溶血性弧菌的VBNC態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)了總菌數(shù)和活菌數(shù)。Cappelier等［10］利用DVC法和CTC-DAPI雙染色的方法相結(jié)合，檢測(cè)了VBNC態(tài)的4種單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。Baffone等［11］也利用CTC-DAPI法檢測(cè)了VBNC態(tài)的空腸彎曲菌。

研究中通常使用吖啶橙染色、活菌直接計(jì)數(shù)和平板計(jì)數(shù)三者結(jié)合來確定細(xì)菌是否進(jìn)入VBNC態(tài)。用吖啶橙染色法可得出總菌數(shù)或活菌數(shù)［12］，用活菌直接計(jì)數(shù)法可檢出具有代謝活性的活菌數(shù)，用平板計(jì)數(shù)法可得出可培養(yǎng)的活菌數(shù)。因而，當(dāng)平板計(jì)數(shù)為零時(shí)，可以加大接種量，繼續(xù)培養(yǎng)連續(xù)測(cè)定3 d，若可培養(yǎng)數(shù)仍為零則說明細(xì)菌進(jìn)入VBNC態(tài)。

一種方便快速的死/活細(xì)菌檢測(cè)試劑盒(LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits)被廣泛應(yīng)用于VBNC態(tài)的檢測(cè)，是基于細(xì)胞完整性來檢測(cè)死活菌的數(shù)量。包括2種核酸染料，SYTO-9和PI(propidium iodide，碘化丙啶)。SYTO-9能穿透完整的細(xì)胞膜滲入胞內(nèi)，染色核酸使之呈現(xiàn)綠色熒光;PI只能滲到細(xì)胞膜破損的菌體內(nèi)，染色核酸呈現(xiàn)紅色熒光。因此可以區(qū)分死活菌。Adams等［13］利用平板計(jì)數(shù)和死活菌試劑盒檢測(cè)了水樣中幽門螺桿菌的可培養(yǎng)性和形態(tài)，發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌失去了可培養(yǎng)性，但依舊具有活力，因此斷定其進(jìn)入VBNC態(tài)。Li等［14］利用選擇平板計(jì)數(shù)聯(lián)合死活菌檢測(cè)試劑盒檢測(cè)在寒冷和二氧化碳的誘導(dǎo)下，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌能否進(jìn)入VBNC態(tài)。PI還常用于細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死的檢測(cè)［15］。

3 呼吸檢測(cè)

呼吸檢測(cè)就是在培養(yǎng)物中加入電子受體CTC和對(duì)碘硝基四唑紫(p-iodonitrotetrazolium violet，INT)等物質(zhì)，這些物質(zhì)在細(xì)菌新陳代謝過程中參與反應(yīng)。由于氧化態(tài)的CTC和INT等物質(zhì)為無色，而經(jīng)過氧化還原反應(yīng)被還原為紫色和紅色的物質(zhì)，因而便于檢測(cè)。只要細(xì)菌有活躍的電子傳遞鏈即可發(fā)生此反應(yīng)。且隨著VBNC態(tài)細(xì)菌的產(chǎn)生，細(xì)菌會(huì)發(fā)生變化，INT沉淀不易被觀察出來，會(huì)造成檢測(cè)錯(cuò)誤。Oliver等［16］用DVC法和電子傳遞能力監(jiān)測(cè)創(chuàng)傷弧菌的可培養(yǎng)性和活力，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌進(jìn)入VBNC態(tài)，從而得到明顯的觀察效果。Rahman等［17］利用INT-DVC法成功檢測(cè)出了1型痢疾志賀氏菌的VBNC態(tài)。

4 分子生物學(xué)方法

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR)、疊氮溴化丙錠聯(lián)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(PMA-qPCR法)、核酸探針、熒光原位雜交技術(shù)、基因芯片等生物學(xué)技術(shù)被用于VBNC態(tài)的檢測(cè)。

當(dāng)細(xì)菌處于VBNC態(tài)時(shí)仍有一些基因被表達(dá)，而mRNA與細(xì)菌的活性直接相關(guān)，一些研究者應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RTPCR)技術(shù)對(duì)VBNC態(tài)細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)。李影等［18］通過mRNA差異顯示技術(shù)得到了僅在VBNC態(tài)時(shí)高量表達(dá)的沙門氏菌的特異性基因，依據(jù)這2個(gè)基因設(shè)計(jì)引物，再運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了沙門氏菌的VBNC態(tài)。Lahtinen等［19］運(yùn)用RT-PCR技術(shù)聯(lián)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)雙歧桿菌的VBNC態(tài)。Eiler等［20］將弧菌特異的16S rRNA引物運(yùn)用到qPCR中，再用變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)對(duì)弧菌的VBNC態(tài)進(jìn)行計(jì)數(shù)。Machado等［21］也用相同的方法檢測(cè)了霍亂弧菌的VBNC態(tài)，這對(duì)水中霍亂弧菌的檢測(cè)提供了新思路。近年來疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)被用于細(xì)菌死活細(xì)胞的PCR選擇性擴(kuò)增中。PMA染料是一種DNA分子核酸染料，其滲入受損細(xì)胞膜與DNA結(jié)合，而無法結(jié)合完整細(xì)胞膜內(nèi)的DNA。一般使用PMA處理提取樣品的基因，使樣品中死細(xì)胞的DNA分子與PMA發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，使其DNA分子的PCR擴(kuò)增被抑制從而達(dá)到區(qū)分死、活菌檢測(cè)的目的。在活性乳酸菌的研究中，Cayuela等［22］用DVC法和PMA-qPCR法對(duì)4℃保存的發(fā)酵乳制品中的嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌進(jìn)行活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩者檢測(cè)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，這為乳酸菌VBNC態(tài)的研究奠定了基礎(chǔ)。在Villarreal等的研究中，發(fā)現(xiàn)平板計(jì)數(shù)法區(qū)分相似細(xì)菌時(shí)的特異性差，而PMA-qPCR法卻有很強(qiáng)的特異性［23］。因而從平板計(jì)數(shù)法和PMA-qPCR法的計(jì)數(shù)結(jié)果得知，傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)結(jié)果偏高［24］，而對(duì)VBNC態(tài)細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果卻偏低。但對(duì)于PMA-qPCR法檢測(cè)細(xì)菌的結(jié)果準(zhǔn)確性都很高，且用時(shí)也短。Dinu等［25］對(duì)生菜和菠菜表面的大腸埃希菌在低溫下進(jìn)行VBNC態(tài)誘導(dǎo)，用PMA-qPCR技術(shù)和免疫學(xué)方法結(jié)合來確定細(xì)菌的VBNC態(tài)數(shù)量。Karina等［26］采用PMA-qPCR技術(shù)檢測(cè)出VBNC態(tài)的糞腸球菌，因而用此方法來評(píng)估表層水的質(zhì)量。

核酸探針指帶有標(biāo)記的已知序列的核酸片段可與其互補(bǔ)的核酸序列雜交，從而檢出樣品中特定基因順序。Coutard等［27］采用核酸探針和RTPCR相結(jié)合的方法對(duì)進(jìn)入VBNC態(tài)的副溶血性弧菌Vp5菌株進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)4種群特異基因和2種毒力基因。熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH技術(shù))的原理是利用核酸分子單鏈間存在可以互補(bǔ)的堿基序列，將外源核酸與待測(cè)DNA或RNA進(jìn)行互補(bǔ)而形成雜交分子，檢測(cè)后使待測(cè)DNA或RNA顯現(xiàn)出來。Juhna等［28］使熒光原位雜交技術(shù)和DVC、DAPI法相結(jié)合成功地檢測(cè)了大腸埃希菌的VBNC態(tài)。Moreno等［29］利用FISH技術(shù)和DVC法結(jié)合來檢測(cè)普通水中的VBNC態(tài)幽門螺桿菌。近年來，隨著基因芯片技術(shù)飛速發(fā)展，基因芯片也被用于VBNC態(tài)細(xì)胞快速檢測(cè)中。Liu等［30］用一種改良的基因芯片法與RT-PCR技術(shù)相結(jié)合，并利用探針技術(shù)檢測(cè)到經(jīng)RT-PCR后排布在芯片上處于VBNC態(tài)的大腸埃希菌基因，從而發(fā)現(xiàn)這種方法靈敏度高，假陽性概率小。Vora等［31］用PCR聯(lián)合基因芯片技術(shù)快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)了VBNC態(tài)的弧菌。

5 免疫學(xué)方法

免疫學(xué)方法是基于抗原抗體特異性進(jìn)行檢測(cè)的。具有完整細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的細(xì)菌才可進(jìn)行免疫反應(yīng)。徐懷恕等［32］用電鏡觀察VBNC態(tài)V.cholerae細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)進(jìn)入VBNC態(tài)的細(xì)菌保持和正常細(xì)菌一樣的表面抗原。因此這是利用免疫技術(shù)對(duì)VBNC態(tài)細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)的依據(jù)。熒光抗體染色法和間接酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)被廣泛使用。熒光抗體染色法可檢出總菌數(shù)和活菌數(shù)，ELISA法可檢出VBNC態(tài)的菌數(shù)以及總菌數(shù)。姚斐等［33］利用間接酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)檢測(cè)出了VBNC態(tài)的大腸埃希菌O157H7。姚斐等［34］還利用活菌間接免疫熒光抗體技術(shù)(direct viable counting-indirect fluorescent antibody technique，DVC-IFAT)來檢測(cè)VBNC態(tài)的副溶血弧菌，得到良好的效果。僅使用間接免疫熒光抗體技術(shù)檢測(cè)時(shí)，VBNC態(tài)的死活菌都能被檢出，而使用DVC-IFAT法時(shí)，檢測(cè)出沒有變化的是死菌。因而DVC-IFAT法更優(yōu)于間接免疫熒光抗體技術(shù)。Liu等［35］建立了一種免疫瓷珠捕獲PCR技術(shù)(immunomagnetic capture-fluorescent PCR，IMC-FPCR)，快速敏銳地檢測(cè)出了空腸彎曲菌的VBNC態(tài)。

6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)法(flow cytometry，F(xiàn)CM)

流式細(xì)胞儀是一種采用激光束激發(fā)單行流動(dòng)的細(xì)胞，對(duì)它攜帶的熒光進(jìn)行探測(cè)，從而完成細(xì)胞分析和分選的技術(shù)。運(yùn)用流式細(xì)胞儀可識(shí)別進(jìn)入VBNC態(tài)細(xì)胞的形態(tài)變化，當(dāng)其與熒光染料結(jié)合使用可檢出死活菌數(shù)量、兩者的比例關(guān)系及死活菌總數(shù)。Khan等［36］先用熒光染料SYTO 9、SYTO 13、SYTO 17、SYTO 40和PI分別對(duì)大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、丁香假單胞菌、沙門氏菌進(jìn)行染色，再用流式細(xì)胞儀對(duì)活的和VBNC態(tài)的細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。Berney等［37］將FCM和死活菌檢測(cè)試劑盒聯(lián)用，檢測(cè)了福氏志賀菌等細(xì)菌。Wang等［38］利用流式細(xì)胞儀和熒光染色相結(jié)合的方法來檢測(cè)氯水消毒的效果并查看了大腸埃希菌和軍團(tuán)菌VBNC態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。劉靜宇等［39］利用流式細(xì)胞儀對(duì)陳化海水中4℃培養(yǎng)的副溶血性弧菌計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)在第69天時(shí)細(xì)菌都不生長，但細(xì)菌總數(shù)不變，說明其進(jìn)入VBNC態(tài)。同時(shí)他們利用實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR對(duì)VBNC態(tài)副溶血性弧菌的管家基因pvuA、鑒定基因toxR和毒力基因tdh2進(jìn)行檢測(cè)和毒力研究，發(fā)現(xiàn)此方法特異性強(qiáng)、靈敏、檢測(cè)速度快，客觀地評(píng)價(jià)了VBNC態(tài)細(xì)菌的潛在危害。鄧陽等［40］在耐酸乳桿菌VBNC態(tài)誘導(dǎo)復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)AODC法計(jì)數(shù)的總菌數(shù)保持穩(wěn)定，死活菌染色試劑盒和流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)結(jié)果相似，活菌數(shù)降低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，表明其逐漸進(jìn)入VBNC態(tài)。綜上研究VBNC態(tài)細(xì)菌中采用的檢測(cè)方法匯總見表1。

表1 研究VBNC態(tài)細(xì)菌中采用的檢測(cè)方法匯總Table 1The Test methods of the VBNC state of Bacteria

續(xù)表1

7 展望

通過對(duì)VBNC態(tài)細(xì)菌檢測(cè)方法的概述，發(fā)現(xiàn)研究者往往用一種方法無法完全確定細(xì)菌是否處于VBNC態(tài)，因而常常聯(lián)合使用多種方法來確定細(xì)菌的狀態(tài)，因?yàn)椴煌?xì)菌的VBNC態(tài)也不盡相同，用一個(gè)統(tǒng)一的方法來檢測(cè)VBNC態(tài)細(xì)菌幾乎是不可行的。在眾多檢測(cè)方法中，死活菌檢測(cè)試劑盒和分子生物學(xué)法檢測(cè)VBNC態(tài)細(xì)菌已成為主要趨勢(shì)，人們應(yīng)加大這方面的研究力度。死活菌試劑盒操作簡(jiǎn)便，死活細(xì)菌可簡(jiǎn)單地通過顏色來區(qū)分，且染料不會(huì)影響細(xì)菌的形態(tài)變化。對(duì)于分子生物學(xué)檢測(cè)方法而言，應(yīng)該加大力度找出VBNC基因，而不僅僅比較細(xì)菌VBNC態(tài)和正常狀態(tài)時(shí)基因的差異，只有這樣，分子生物學(xué)法才能真正應(yīng)用到VBNC態(tài)細(xì)菌的檢測(cè)中。

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Advances in Test Techniques of Viable But Non-Culturable State of Bacteria

ZHAO Li-li1，BAO Qiu-hua2，ZHAO Guo-fen1
(1.Coll.of Life Sci.，2.Key Lab.of Dairy Biotech.＆Engin.Minist.of Educ.Inner Mongolia Agric.Uni.，Huhhot 010018)

Under harmful stress conditions，many species of bacteria will enter into starvation mode of a viable but non-culturable(VBNC)state.When the bacteria went into VBNC state，they cannot grow using conventional culture media，although they continue to retain their viability and express their virulence.Hence，for checking the level of microbial contamination，it is very important to use appropriate techniques for the detection of VBNC bacteria and establishing their viability.Various detection methods of VBNC bacteria were summarized in this article.For instance，direct viable counting，nucleic acid dyes detection method，respiration detection method，molecular biological method，immunological method，flow cytometry method，and appraised these methods and their application status through comments.

bacteria;viable but non-culturable(VBNC);test and determination methods

Q935

A

1005－7021(2016)04－0096－06

10.3969/j.issn.1005－7021.2016.04.017

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31301516);內(nèi)蒙古博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(BJ2013D-18)

趙黎黎女，碩士研究生。主要從事微生物方面的研究。E-mail:1819095448@qq.com

*通訊作者。女，博士，助理研究員。研究方向?yàn)槿槠肺⑸铩-mail:nmgbqh@126.com

2015-09-02;

2015-12-01