干細胞與再生醫學發展前瞻

劉晶，曹尚濤，蔡景蕾，裴端卿

干細胞與再生醫學發展前瞻

劉晶，曹尚濤，蔡景蕾，裴端卿

1 再生醫學的產生與需求

古往今來，無數神話故事和小說，都幻想著人類可以長生不老，益壽延年，但當人的某些器官和組織經受損傷，無法及時修復時，人的生命就岌岌可危。全世界每年約有上億人遭受不同形式的組織器官創傷，因此，對各種用于移植的組織器官需求巨大。但可供移植器官的來源有限且困難，同時受機體免疫排斥、移植費用等因素制約，使得器官移植的臨床應用非常受限。因此利用可大量擴增并且有分化潛能的干細胞或者祖/前體細胞，通過工程化手段，結合新型生物材料，得到可以適應人體自身生化和生理條件的可代替組織的技術手段有著廣闊的發展空間。

此外，隨著醫療水平的提高，人類的期望壽命不斷延長，世界開始逐步步入老年化時代。而伴隨而來的則是大量與組織器官衰老退化有關的退行性疾病的爆發，如老年癡呆癥等。這些疾病嚴重影響了病人的生命質量，對社會造成了嚴重的負擔。目前，藥物治療和手術治療對于退行性疾病并沒有好的效果，再生醫學則有可能在根本上攻克退行性疾病。

再生醫學是一門研究組織器官受損后修復和再生的學科。盡管再生醫學擁有美好的發展前景，但目前依然處在起步階段，再生醫學能夠得到廣泛應用很大程度上將取決于干細胞研究的進展。從當今發展趨勢看，再生醫學已是現代臨床醫學的一種嶄新的治療模式，對醫學治療理論、治療和康復方針的發展有重大的影響。干細胞研究促進了再生醫學的發展，這是繼藥物治療、手術治療之后的又一場醫療革命。

再生醫學在國際上已成為當今生物學和醫學關注的焦點和研究熱點。在國內，再生醫學的重要性已引起相關決策部門和科技人員的高度重視，并已建立多個研究中心，取得了一批高水平的科研成果，如建立干細胞誘導分化技術，重建組織器官修復與再生基本技術，研制出組織人工皮、肌腱、韌帶以及用大動物模型構建組織工程化組織。

2 干細胞的定義和來源

作為再生醫學基礎的干細胞是什么？根據干細胞所處的發育階段，可將干細胞分為胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES細胞）和成體干細胞（somatic stem cell）。最早被定義的干細胞是造血干細胞（HSC），是一類分離于骨髓的可自我更新與復制，并具備產生造血系統不同譜系血細胞能力的細胞。由此引申出干細胞的基本定義，即可以自我更新、并具備多向分化潛能的細胞。科學家陸續發現在其他多種成體器官中也存在干細胞，如神經干細胞、脂肪干細胞、表皮干細胞、間充質干細胞等。這些干細胞統稱為成體干細胞，利用這些成體干細胞可以治愈多種人類疾病。1981年，小鼠的胚胎干細胞被成功分離，該技術的建立奠定了現代干細胞和再生醫學研究的基石。胚胎干細胞一方面可自我更新，另一方面被證實可以分化為機體內任何一種組織和器官，這種特性使胚胎干細胞成為再生醫學的理想細胞來源。1998年人胚胎干細胞的成功分離，克服了干細胞領域的重大障礙，使再生醫學邁入一個新的應用階段。

胚胎干細胞理論上可以為人們受損或缺陷的組織器官提供源源不斷的移植來源，但由于個體的差異，胚胎干細胞分化后的成體細胞存在免疫排斥問題為異體移植帶來了巨大的障礙，因此多年來科學家一直在尋找簡便的方法能夠建立任何個體的胚胎干細胞，2006年鼠誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）的出現，完美地解決了這一問題。通過iPSC的誘導方案，已經分化的體細胞可以在導入4個重編程因子之后，重新

重編程回類似胚胎干細胞的多能性狀態，從而獲得個體特異的iPSC。隨后，人iPSC技術的建立成功，預示著個體化細胞移植治療能夠成功。隨后，針對人 iPSC 的供體細胞、誘導方法、培養條件等多方面進行了不斷優化，現在已經可以建立一套無損傷、無整合、無飼養層、高效的人iPSC的產生方法。另外，很多實驗室基于 iPSC的概念，在體外可以實現不同類型體細胞之間的直接重編程，即轉分化，進一步為功能細胞的產生方法增添了新的選擇。這些技術正在極大地推動干細胞和再生醫學領域的快速進展。

3 干細胞與再生醫學前沿發展

3.1 運用體內來源的干細胞進行再生治療

干細胞最直接的來源是人體本身具有并可被提取的干細胞，如造血干細胞、間充質干細胞等，運用這些體內來源的干細胞進行再生治療是再生醫學領域長期以來的主要研究內容。

造血干細胞是支持造血細胞發育生成的一類成體干細胞。借助于轉基因、基因敲除等小鼠模型，造血干細胞研究得到極大的推進。無論是造血干細胞的鑒定、功能調控、分化調控，還是造血干細胞的微環境對于其功能的影響等基礎研究方面，都取得了大量的進展。最近，借助于先進的單細胞技術，科學家還成功解析了胚胎發育早期從造血干細胞前體向造血干細胞轉變過程的表達譜變化。在臨床方面，由于造血干細胞是最早被應用于臨床治療的干細胞類型，大量的移植案例發展及完善了配型、干細胞歸巢等關鍵理論，也使得造血干細胞移植成為目前最為成熟的再生醫學治療手段，廣泛應用在惡性血液病（白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等）的治療中。應用最廣泛的造血干細胞來源是采用G-CSF動員造血干細胞后，外周血富集的CD34+造血干細胞。此外臍帶血造血干細胞隨著臍血庫的建立和逐步完善也進入了一些臨床治療中。由于骨髓庫和臍血庫提供人類白細胞抗原（HLA）完全配型的造血干細胞的概率仍然不能滿足臨床需求，近年來半相合移植的案例逐步增多并取得不錯的療效，移植后的生存率近乎可以與全相合移植媲美。半相合只需要供受者一條HLA染色體相同，血緣親子間 100%符合要求，因此幾乎每一名患者都可以找到供者，大大提高了患者找到造血干細胞供者的可能性。不過，與全相合異基因來源的造血干細胞移植一樣，半相合移植目前主要應用于惡性血液病的治療。

3.2 運用體外培養的干細胞系或iPSC來源的干細胞進行再生治療

雖然造血干細胞在再生醫學應用上取得了矚目的成就，然而其他體內來源的干細胞因為獲得困難、數量稀少等原因，嚴重制約了再生醫學的進一步發展。解決這一種子細胞來源困難的思路主要是通過體外培養技術建立干細胞系，或運用具有個體發育潛能的胚胎干細胞進行定向分化，從而獲取大量可移植的功能細胞或干細胞。如采用統一的細胞系進行治療，會有免疫排斥可能性，因此獲得病人特異干細胞也是該領域的一個長期目標。2006年，日本科學家山中伸彌（Shinya Yamanaka）發現利用病毒載體將 4個轉錄因子（Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc）的組合轉入分化的體細胞中，可以使其重編程而得到類似胚胎干細胞的一種細胞類型，稱為iPSC，iPSC使得大量獲得個體特異的高分化潛能干細胞成為可能，隨后世界各地不同科學家陸續發現其他方法同樣也可以制造這種細胞，這個劃時代的發現也獲得了2012年的諾貝爾生理學或醫學獎。目前運用ES和iPSC進行定向分化并用于再生治療產生了許多進展，以下介紹進展較大的視網膜上皮細胞及處于研究發展階段的牙組織細胞。

1）在老年黃斑變性再生治療中的應用。

老年黃斑變性是一種和年齡增長有關的多因素復合作用的眼底病。年齡相關性黃斑變性（AMD）是世界老年人群致盲的主要原因，分為非新生血管性（干性）及新生血管性（濕性）AMD兩類。疾病的主要病理改變為視網膜色素上皮（RPE）細胞的功能障礙及丟失。

目前的治療方法包括：抗氧化藥物及微量元素治療、抗衰老及活血化瘀中藥治療、鐳射封閉黃斑中心凹200 μm 以外的新生血管及玻璃體視網膜顯微手術治療等。

近年來隨著再生醫學的發展，RPE細胞替代療法成為了AMD疾病治療的新思路。干細胞（胚胎干細胞、多能干細胞等）誘導分化的RPE和成熟RPE（胎兒、自體等）替換了病程中壞死、缺失的RPE細胞，可挽救視力的進一步喪失。研究中，用于替代細胞的主要有人類胚胎干細胞分化的 RPE（human embryonic stem cell derived RPE，hESC-RPE）和胎兒 RPE（fetal RPE，fRPE）兩類，在多種模型中均被證實有著與RPE非常相似的細胞學和功能學特征。但是，療效的背后仍隱藏著許多亟待解決的問題與挑戰。雖然，視網膜下腔位于RPE層與視網膜外界膜之間，一直被認為維持著免疫豁免的狀態，但免疫豁免并不是缺乏免疫反應，而是一種免疫抑制的狀態。當視網膜下腔受到微生物、自身免疫、衰老等因素的影響，“免疫豁免”的環境會觸發一系列強烈的免疫反應。因此，其中亟待解決的問題與挑戰之一是與移植相關的免疫排斥。患者自體視網膜邊緣健康的RPE細胞可謂是最理想的細胞來源，不僅取材方便，還可以避免免疫排斥，但手術過程復雜，取材數量局限。iPSC在其相關技術的不斷成熟下，可被誘導分化出 iPSC-RPE，成為一類新興的理論上無免疫排斥的替代細胞來源。通過獼猴模型，分離出的獼猴PBMCs，與自體iPSC-RPE共培養，未發現T細胞活化的現象；進一步將自體 iPSC-RPE層移植入獼猴的視網膜下腔,在未使用免疫抑制劑情況下，移植后未發生免疫排斥。雖然研究表明，iPSC分化過程中可能出現的翻譯后修飾現象會導致iPSC-RPE微弱的抗原性，但這種免疫反應在臨床上可以忽略不計。

令人振奮的是在2013年7月，日本監管機構批淮了理化研究所發育生物學中心高橋雅代（Masayo Takahashi）可以開展 iPSC的臨床預研究。第一位受試患者是一名70歲的婦女。高橋雅代研究小組取得了這名患者的皮膚細胞，然后將它們重編程為iPSC，再將這些非特化的細胞誘導變為了視網膜組織。高橋雅代提供證據證實，這些細胞在遺傳上穩定且安全，具備了移植到眼中的先決條件。4 d后試驗操作完成，報告稱患者沒有出現嚴重的副作用，此為世界首例利用iPSC培育的細胞進行移植的手術，此后的第2例手術由于患者的iPSC發生基因突變而中斷。據日媒報道，日本理化研究所等4個機構于2016年6月6日在神戶市發布消息稱，將重啟把由他人細胞制作的人工誘導多能干細胞培育的視網膜細胞移植到“滲出型老年性黃斑變性”患者身上的臨床研究。據悉，研究人員將利用京都大學“iPS細胞庫”儲備的據稱移植時排異反應較小的特殊人群細胞制成的iPSC。無論是利用自體獲得的iPS衍生細胞還是用這種異體iPS衍生的細胞，iPSC在臨床再生領域的探索實現了應用可能性飛躍的第一步。

2）在牙再生治療中的探索。

牙齒健康是一個人健康的重要標志之一。牙齒的缺失直接影響咀嚼、消化、營養吸收等生理功能，同時還影響語言功能、面部形象，進而可能導致心理障礙。研究人員發現牙齒的健康和全身其他的疾病有著密切聯系，咀嚼功能的受損甚至喪失，可以引起或加重心臟病、胃病、糖尿病、心血管疾病和關節疾病及并發癥，嚴重危害全身健康。目前的牙齒缺失均采用人工材料贗復體修復，存在著生理功能恢復有限、使用壽命短、損傷正常組織、價格昂貴等缺點，缺乏真正生理意義的修復。隨著人們生活水平的提高及以干細胞技術為基礎的組織工程和再生醫學研究相關領域的發展，在形態和結構上類似于天然牙的再生牙齒成為了改變牙齒相對傳統的修復方式的最新理念和口腔再生醫學中最為活躍的研究領域。從發育學角度，上皮-間充質之間的相互作用是決定牙齒及機體很多器官發生發育的關鍵環節。因此，牙再生研究除了可以在將來解決牙齒缺失修復、治療過程中的缺陷問題，還可作為機體組織器官發生發育的代表性實驗模型，為其他組織器官的再生研究提供重要的科學依據。

由此可見，牙齒再生對組織工程與再生醫學等相關領域也具有重要的科學意義。

除了牙發生發育過程中上皮-間充質細胞相互作用的調控機制和微環境的影響外，牙齒再生的細胞來源也是瓶頸問題之一。一直以來，牙源的成體干細胞是牙齒再生研究細胞來源的首選。2000年，施松濤首次發現牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs），并發現牙髓干細胞可以誘導出牙本質和牙髓復合物。2003年，研究人員從脫落的乳牙殘留的牙髓中得到乳牙牙髓干細胞（stem cells from exfoliated deciduousteeth，SHED），發現SHED比DPSCs具有更多的分化潛能，將SHED植入裸鼠體內后可以產生牙本質結構。隨后，牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）被報道，并通過 DPSCs/SHED的相同方法來驗證，發現其具有分化成牙骨質樣細胞、脂肪細胞和成纖維細胞的能力，亦能形成牙骨質和牙周膜復合體樣結構。這些實驗初步展示了DPSCs重建牙齒的能力及其應用前景，這也說明牙齒再生在理論上是可能的。隨后，國外研究人員對牙源成體干細胞的研究集中于向其他組織分化。牙源成體干細胞牙向分化及應用研究的成果主要來自于中國的2個團隊。2006年，金巖團隊制備了牙胚條件培養基，并利用該培養基成功誘導DPSCs分化成牙本質/牙髓復合體，同時該團隊模擬微環境條件，成功地誘導 PDLSCs向牙骨質/牙周膜的復合體再生。而王松靈研究團隊則率先通過豬牙周炎模型發現 PDLSCs移植到炎癥部位可改善牙周炎癥狀，并提出PDLSCs可用于治療牙周炎的新思路。2年后，該團隊利用 PDLSCs形成的細胞膜樣結構在豬的牙周炎模型上取得了顯著療效。由此可見，牙源性成體干細胞在牙齒發育和再生過程中的重要性。然而，上述的成體干細胞均起源于間充質細胞，而牙發生發育過程中另一類細胞——牙源性上皮細胞，由于成釉器在釉質形成后逐步消失，已經無法在成體中獲得。所以，如何解決牙源性上皮細胞來源問題是目前牙齒再生的較大難題之一。關于取代牙源性上皮細胞來源的研究，具有代表性的進展是 2011年研究人員發現取自男童包皮的人表皮干細胞可通過和小鼠胚胎階段具有成牙潛能的牙源間充質組織重組，在 FGF8外源蛋白的進一步作用下分化形成成釉細胞。2013年，英國研究人員則成功地利用小鼠胚胎階段具有成牙潛能的牙源間充質組織誘導人的牙齦細胞分化形成牙齒的釉質。然而，這些成體的牙源性和非牙源性的干細胞有限的分化潛能導致其只能實現部分牙體組織的再生。

相比之下，來源于囊胚內細胞團的 ES具有全能性，能夠分化為體內所有類型的組織細胞。將胚胎干細胞團注射到小鼠體內，可以發現具有正常構架的很多組織都得以重現，包括牙齒、頭發、腸道等組織器官。理論上 ES細胞可以分化為任何特異組織細胞，但 ES細胞較少被用于再生牙齒的研究，相關報道非常有限。2009年iPSC開始得到口腔醫學領域的廣泛關注。美、日、澳、韓等國先后將成體牙源細胞成功誘導成iPSC。由于牙胚間充質細胞起源于神經嵴細胞，日本科研人員于 2012年報道小鼠神經嵴細胞衍生的 iPSC可以分化為神經嵴樣細胞，并可以進一步被誘導成表達部分牙源間充質標記分子的細胞群，由此開啟了iPSC在牙齒再生研究方面的應用。隨后，Arakaki等建立了一種大鼠牙源性上皮細胞系，并通過與鼠源iPSC共培養，將iPSC誘導為類成釉細胞。但是，這兩個團隊均未對他們研究中 iPSC衍生的細胞是否能夠參與成牙進行闡述。2013年，中國研究人員首次發現了人源 iPSC誘導而來的上皮細胞與小鼠E14.5的牙胚間充質重組后可以形成完整的牙齒樣結構。這一研究成果證實了iPSC可以參與人類再生牙齒的構建。然而，上述所有獲得牙齒樣結構的牙再生研究方法仍然需要依賴蕾狀期前的牙胚上皮或者蕾狀期后的牙胚間充質所具備的成牙潛能。因此，研究人員進一步的研究工作集中于如何實現完全利用 iPSC作為種子細胞的再生牙齒構建。

3.3 小分子化合物誘導細胞命運轉變

小分子化合物在醫學和藥物研

發過程中扮演著關鍵角色。進入21世紀，利用化學小分子探索細胞生命活動基本規律的化學生物學得到迅速發展，一系列具有劃時代意義的發現為生命科學帶來深刻的變革，推動著細胞生物學，尤其是干細胞與再生生物學的發展。本文重點探討小分子化合物在體細胞重編程、多能性細胞分化及轉分化、胚胎干細胞多能性 3個方面的熱點問題。

3.3.1 小分子化合物與體細胞重編程

誘導多能干細胞技術的發明為人類最終實現自體細胞或器官移植提供了可能，是再生醫學發展史上具有里程碑式的事件。然而基于特定因子介導的誘導多能干細胞技術存在誘導效率低、外源基因插入及成瘤性等安全性隱患，嚴重制約其臨床應用。因此，科學家不斷尋找更為安全和高效的重編程技術，相繼開發出附著體、microRNA和蛋白等多種非整合型體細胞重編程技術體系。

與基因策略相比，化學小分子誘導方案具有無基因組整合、操作簡單、劑量易控與可逆性等優點，因此受到更為廣泛的關注。研究表明，化學小分子可以通過調控表觀遺傳修飾、信號通路與代謝激酶等多種途徑來影響細胞命運轉變過程，進而實現重編程效率的提升并替代相關轉錄因子。通過采用化學小分子對關鍵的表觀遺傳修飾靶點進行調控，科學家發現，組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylases，HDACs），如VPA、丁酸鈉、TSA等能夠明顯提升小鼠和人成纖維細胞重編程為 iPSCs的效率，其中 VPA被報道能實現Oct4/Sox2兩因子將人成纖維細胞重編程為多能干細胞，進而實現對重編程因子Klf4和c-Myc的部分替代；DNA甲基化酶抑制劑，如5-Azacytidine和RG108也被發現可以促進 OKSM介導的體細胞重編程。此外，天然小分子化合物VC被證明可以通過多種機制顯著提升小鼠和人的體細胞的重編程效率，其中重要的表觀遺傳機制包括：可通過調控組蛋白去甲基化酶Jhdm1b的活性降低H3K36甲基化水平從而促進體細胞重編程；可通過調控 DNA胞嘧啶羥甲基化酶Tet1的活性調控基因組甲基化水平，從而劑量依賴性地影響體細胞重編程效率；可通過調控組蛋白去甲基化酶KDM3/KDM4的活性降低 H3K9的甲基化水平促進體細胞重編程等。通過采用化學小分子對信號通路進行調控也可以顯著影響體細胞重編程進程，間質上皮轉化（mesenchymal to epithelial transition，MET）是體細胞重編程早期的重要事件，科學家通過采用化學小分子抑制劑發現，TGF-beta信號通路抑制劑SB431542、Repsox和A8301等可顯著促進重編程早期的MET過程，進而促進體細胞重編程效率，其中SB431542 和Repsox甚至在功能上能夠替代重編程因子Sox2。

更加具有突破性的進展出現在2013年，北京大學鄧宏魁課題組采用多輪篩選與優化，最終僅使用 7個小分子化合物成功將小鼠成纖維細胞重編程為多能干細胞。該課題組還于 2015年進一步優化誘導方案，并提高了化合物誘導重編程效率，在多種不同細胞類型中實現了全化合物誘導小鼠多能性干細胞。上述實驗結果最終表明化學小分子也可以與轉錄因子一樣在細胞命運轉變過程中發揮關鍵作用，進而介導細胞命運轉化，也為干細胞與再生醫學提供了新的手段與思路。

3.3.2 小分子化合物與分化及轉分化

多能性細胞定向分化至特定譜系細胞與不同譜系細胞間的轉分化是體外獲取功能細胞的重要途徑。采用化學小分子手段實現功能性細胞的獲得被認為更加符合臨床應用要求，而逐漸成為領域研究熱點，也誕生了一批重要的研究成果。如在定向誘導分化方面，科學家通過高通量篩選，發現化學小分子IDE1和 IDE2可提高人的胚胎干細胞定向分化至定型內胚層細胞（DEs）的效率，甚至部分替代生長因子ACTIVINA作用。更加令人振奮的突破來自化合物誘導細胞轉分化領域。2015年，北京大學和上海生命科學研究院的2個獨立的課題組完全使用小分子化合物 cocktail分別將小鼠成纖維細胞和人成纖維細胞向神經元轉分化。2016年，軍事醫

學科學院裴雪濤課題組利用8個小分子化合物將胃上皮細胞誘導至內胚層祖細胞；同期，清華大學丁勝課題組利用9個小分子化合物將人成纖維細胞轉分化為具有體內功能的心肌細胞；中國科學院潘光錦課題組發現在尿細胞重編程過程不同時間點添加 TGF-beta信號通路抑制劑A8301可分別將尿細胞重編程為iPSCs或者轉分化為神經前體細胞等。上述一系列重要的研究成果表明，小分子化合物不僅可以完全替代譜系相關轉錄因子，也可以單獨將細胞命運轉變到特定狀態，從而為提供臨床級別的功能性細胞創造了條件。

3.3.3 小分子化合物與胚胎干細胞多能性

小分子化合物在多能性細胞的維持和培養過程中扮演重要角色。研究表明小鼠的多能干細胞狀態可分為 Na?ve態（ESCs）與 Primed態（EpiSCs）。其中小鼠ESCs可以在2i（GSK3beta抑制劑CHIR99021和 ERK抑制劑 PD0325901）/LIF培養環境中較好地維持 Na?ve狀態。但科學家發現，經典的人的胚胎干細胞在克隆形態及多能性維持的信號依賴等方面與經典的小鼠胚胎干細胞（ESCs）不同，但與小鼠EpiSCs非常接近。為此，科學家推測存在與小鼠Na?ve態對應的人的Na?ve狀態的胚胎干細胞，由此掀起了一輪聯合多種小分子化合物促進人ESCs由Primed狀態向Na?ve狀態轉變的研究熱潮。最終，國際上多個實驗室采用不同的方案成功獲得具備與小鼠Na?ve態干細胞類似的人的胚胎干細胞，其中包括RudolfJaenisch實驗室使用5個小分子化合物（SB590885，PD0325901，CHIR99021，Y27632，WH-4-023）誘導人 ESCs由 Primed狀態向Na?ve狀態轉變的方案。盡管小分子化合物在促進人ESCs由Primed狀態向Na?ve狀態轉變扮演重要角色，但這些獲得的人的Na?ve狀態的胚胎干細胞在細胞增殖、表觀遺傳特征上與經典的小鼠胚胎干細胞還存在較大差異。目前，科學家仍在繼續篩選新的小分子化合物優化并長期穩定培養人的Na?ve狀態的胚胎干細胞。

小分子化合物在體細胞重編程、定向分化或轉分化、干細胞不同多能性狀態的維持方面起著重要的作用，為細胞治療提供了理想的細胞來源，極大地推動著干細胞與再生醫學的發展。但是，由于種屬間遺傳背景與細胞類型特征差異，利用小分子化合物在小鼠或者其他物種所得到的實驗研究成果較難在人的體系中重現，如小鼠 CiPSCs誘導方案在人的體系中沒有明顯作用，因此尋找克服種屬間差異的小分子化合物尤為重要，同時通過細胞表觀遺傳學等研究闡明種屬間差異的分子機理將有助于改進與完善未來小分子化合物在細胞命運轉變的篩選策略，兩者相輔相成，共同推動醫學與生物學研究領域的發展。

3.4 體內誘導干細胞進行再生治療

人們曾經認為動物的終末分化細胞不具有回到上一個發育階段類型的能力，但近年來的研究發現在哺乳動物體內也有受損組織去分化形成多能干細胞的現象，這些現象挑戰了原有的觀念，也給再生醫學指出了一條新的道路，就是通過人工誘導原位細胞去分化和轉分化，修復受損的組織和器官，治療疾病。

早在2002年Keating等就發現斑馬魚在心臟被切除20%以后，可以在2個月內再生成完整的心臟，并在此過程中觀察到有原有心肌的脫落、分離、去分化、大量增殖和重新分化，并且沒有觀察到其他來源的干細胞參與了這個過程。之后在果蠅的生殖細胞、兩棲動物的肢體再生、哺乳動物的施旺細胞以及小鼠的小腸上皮 Dll1+細胞中也都發現了類似的現象，這就使原有的終末細胞不能再分化的觀念受到了挑戰，以至于有了 2006年 Shiny Yamanaka的誘導多能性干細胞的出現。

人們不禁會想，既然去分化可以自發的發生在動物體內，而在動物體外我們又可以用人工誘導的方法把各種終末分化的細胞重編程成為類似胚胎干細胞的細胞，那么我們能否在動物體內誘導出我們想要的細胞呢？答案是肯定的。

2008年，Melton等用腺病毒感染小鼠，將3個特定的轉錄因子轉入小鼠的胰腺分泌細胞中，使得胰

腺分泌細胞轉分化成了可以制造胰島素的胰島β細胞。2012年，日本的Inagawa等用搭載了另外3個與心肌發育有關的轉錄因子Gata4、Mef2c、Tbx5及綠色熒光蛋白的逆轉錄病毒感染在小鼠心肌梗死的區域的心肌樣細胞，被感染細胞在2～3周后明顯表現出心肌的功能，而小鼠曾經心肌梗死的心臟也部分恢復了功能。最早的關于腦神經是否也可以經由某些外源性轉錄因子的表達從一種細胞轉化成另一種細胞的研究是在小鼠胚胎和新生小鼠中進行的，De la Rossa等發現，有一種L5特異性的轉錄因子Fezf2，可以把分裂后皮層神經元轉變成L5B的神經元，這一腦區神經元主要負責傳出信號，包含了最大的椎體細胞，可以將軸突投射到其他不同的腦區。而De la Rossa等用Fezf2處理過的分裂后皮層神經元在形態和電生理性質上都類似于L5B的神經元。之后又有一些類似的研究，說明分裂后皮層神經元有著穿越種系壁壘的能力。此外，還有比如肺上皮、胃小彎以及運動神經細胞的種種研究，都說明體內終末分化的細胞在一定條件（人工干預）下，可以恢復干性，重新獲得分化能力，再分化成另一種細胞。

對體內形成多能干細胞的研究，可以激活動物體的自我再生程序，不用依靠外源性細胞的移植來治療疾病，或者通過尋找靶向重編程的藥物，用自我再生的方法治療疾病。而對體內形成多能性干細胞的機理的研究，則有可能闡明這種再生程序的機理，對了解胚胎分化發育的節點和走向也有著重要的意義。

目前，體內原位誘導干細胞還只停留在小動物的研究階段，而且誘導的效率和專一性都尚未盡如人意，因此體內原位誘導干細胞要成為一種治療手段，還需經過大動物的實驗，保證安全才能造福于人類。今后隨著高分辨的圖形成像技術和單細胞分析等技術的發展，研究體內誘導的手段和工具會越來越多，技術和手段也會越來越成熟、越來越安全，必將造福人類。

4 干細胞與再生醫學的挑戰、機遇及未來

隨著干細胞研究技術的更新發展，干細胞在細胞治療、組織器官修復、疾病模型、藥物篩選、精準醫療等領域都有廣闊的應用前景，這將成為人類醫學史上的一場革命。對于臨床上很多難以治愈的疾病，一些組織器官的損傷疾病，尤其再生修復能力較差的組織器官，可以嘗試通過干細胞分化成相應細胞或組織移植至受損部位，改善甚至治愈這些疾病。在過去的 10年間，國內外的干細胞治療臨床試驗數量都在逐年遞增，要完美合理利用干細胞治療，需要面對更多的挑戰，如干細胞治療和應用的標準、規范，安全性問題和風險評估等。隨著生活水平的提高，人們對健康的追求、對最優的個性化的醫療方案訴求也達到新的高度，這也是精準醫療的要求。利用誘導多能干細胞治療疾病將是最符合精準醫療理念的范例，這也是干細胞和再生醫學面臨的機遇。

4.1 安全性和研究規范

在憧憬干細胞治療疾病的巨大前景時，干細胞應用的安全性問題和研究規范問題也提上日程。比如干細胞是否能夠正常增殖和分布，是否會成瘤，是否會發生免疫排斥，是否具有遺傳穩定性等。因此對干細胞進行嚴格的安全性評價是干細胞走向臨床治療的前提。高橋雅代團隊從老年性黃斑病變的病人身上提取細胞轉變成臨床級別的視網膜色素上皮細胞（RPE），移植回患者眼部，令其重見光明，這是干細胞最好應用的結果，但第二例手術因供體細胞出現微小的基因突變而終止。由此可以看出干細胞的臨床應用應謹慎對待，對干細胞進行全面的安全性評估是很有必要的，包括核型、均質性、細菌/病毒/支原體檢測、生長活性、免疫學測試、分化潛能/成瘤性、培養基以及其他添加成分檢測等。

小鼠不能作為人類疾病的理想模型，因為存在壽命短、器官小和生理特性不同等缺陷，因此和人類生理狀況相似、器官相似的大動物模型是必須的，比如猴和豬等。只要對大動物的免疫相關基因進行修飾，使之適應人類免疫系統，它們將是病人器官移植的潛在供體。同時也可對大動物模型進行基因修

飾，作為疾病模型為科研工作者提供試驗平臺，研究新型的疾病治療方法。

當前國內外干細胞研究正在從基礎研究轉向臨床應用，國內外科研工作者面臨機遇，同時也面臨挑戰，因此應加快研究進度，同時也需推進干細胞進入臨床治療。因此為積極應對干細胞研究存在的問題、風險和挑戰，推動干細胞研究科學、健康、有序、快速地發展，中國政府部門相繼制定了干細胞研究應用管理制度《干細胞臨床試驗研究管理辦法（試行）》《干細胞臨床試驗研究基地管理辦法（試行）》《干細胞制劑質量控制和臨床前研究指導原則（試行）》征求意見稿。同時也成立了國家干細胞與再生醫學產業技術創新戰略聯盟、南方干細胞庫和北方干細胞庫等戰略合作聯盟。在國家大力支持和推動下，干細胞研究將更加合理規范，更有益于人民健康。

4.2 基于干細胞的個性化精準治療

再生醫學的最終目標是通過再生組織器官來達到治愈疾病的目標，再生出來的組織器官需要與個體長期共存，因此，盡管異體來源的細胞也可以用于再生治療，但自體來源的細胞仍是最佳的選擇。2011年美國醫學界提出“精準醫療”概念，2015年美國總統奧巴馬提出“精準醫療計劃”，支持該計劃研究。而中國也在 2015年大力推動“精準醫療”。精準醫療是以個性化醫療為基礎，強調了針對不同患者提出不同治療方案的特性。干細胞具有分化成多種細胞的潛能，其特性可以使干細胞是精準醫療的絕佳載體，通過大量擴增或組織器官再生達到治療疾病的目的。因此，如可以通過自體來源的干細胞實現個性化精準治療，無疑會極大地造福患者。

iPSC技術與相關的干細胞誘導技術使得獲得大量個體來源的干細胞成為可能，因此未來的再生醫學技術發展應該主要基于病人自身來源的干細胞。可以預見，這一個性化精準治療方法將有利于極大地降低再生組織器官在與人體長期并存過程中出現并發癥的可能性。而這一技術面臨的主要困難則在于如何在工程學上保持細胞獲取過程的穩定性，這也是本領域未來重要的研發方向之一。

4.3 對細胞命運的更深入理解與理性掌控

人類和動物機體是由多種類型的分化細胞組成，這些分化細胞形態多樣，且功能各不相同。由同一個干細胞分化得到多種類型的分化細胞，其基因組信息完全相同，最終命運各異，這是受到內外多種因素共同調控的結果。外部因素如發育過程中各種信號通路，內部因素如細胞受到外界刺激引起表觀遺傳學的改變，這些因素共同影響基因表達模式，進而導致了細胞命運發生改變。細胞命運是由多種信息、多種因素綜合作用的結果，而干細胞具有分化成多種類型細胞的能力，因此干細胞是研究細胞命運決定的工具，可用于研究外界因素和內部因素對于細胞命運的影響。反過來，人類需要對細胞命運決定過程有更為深入的了解，才能理性地掌控細胞命運。因此，通過已有的干細胞命運決定、個體發育模型深入研究影響細胞命運的信號轉導、表觀遺傳調控機制，將極大地推進再生醫學和干細胞領域的進展，是再生醫學與干細胞領域不斷發展的源動力。?

【作者單位：中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院；中國科學院再生生物學重點實驗室；廣東省干細胞與再生醫學重點實驗室；華南干細胞與再生醫學研究所】

（摘自《科技導報》2016年第20期）