哈薩克羊BMP15基因多態性研究

陳春華，劉宜勇，丁克奇，劉建明，楊光維*，吐來力江，團 勇，道爾基

（1.新疆伊犁州畜牧科學研究所，新疆 伊寧 835000；2.新疆尼勒克縣畜牧獸醫工作站，新疆 尼勒克 835700）

哈薩克羊BMP15基因多態性研究

陳春華1，劉宜勇1，丁克奇2，劉建明1，楊光維1*，吐來力江1，團 勇1，道爾基1

（1.新疆伊犁州畜牧科學研究所，新疆 伊寧 835000；2.新疆尼勒克縣畜牧獸醫工作站，新疆 尼勒克 835700）

為了探索綿羊多胎性的分子機理以及為綿羊繁殖力的標記輔助選擇和育種提供理論依據，采用PCR-RFLP及PCR-DS方法，對哈薩克羊群體BMP15基因FecXG和FecXB及第2外顯子進行多態性檢測。結果表明：BMP15基因FecXG和FecXB位點均未出現多態性，在第2外顯子存在2種基因型，AA型和AB型；測序結果表明：AB型個體在該基因第775位點發生G→C的突變，出現G/C的雜合。優勢基因型為AA型，優勢等位基因為A基因，多態信息含量小于0.25，屬于低度多態；χ2適合性檢驗表明：處于Hardy-weinberg平衡狀態；顯著性檢驗分析表明：該突變位點在不同產羔數母羊群體中的分布有一定的差異。該突變位點可以作為控制綿羊多胎產羔的潛在分子標記位點。

哈薩克羊；BMP15基因；PCR-RFLP；PCR-DS；多態性

綿羊的繁殖性能是一個重要的經濟性狀，在群體內表現連續變異，是由一系列主基因或數量性狀基因座（Quantitative Trait Locus，QTL）決定的[1]，且遺傳力只有0.1左右，很難用常規的技術來提高。目前，國內外提高綿羊繁殖性能最常見的方法是利用基因工程等技術進行分子育種，從根本上改變其繁殖性能。而找到與繁殖性能相關的分子標記位點是實現這個目標的基礎。

綿羊的骨骼形態發生蛋白15基因（Bone Morphogenetic Protein 15 BMP15）是TGFβ超家族最大亞家族BMP家族中的一員，也稱為生長分化因子9B（growth differentiation factor 9B GDF9B），位于綿羊X染色體上，是一種在卵巢表達的卵母細胞衍生因子。BMP15可以通過和卵泡抑素的結合調節自身的生物活性，對早期卵泡的生長和分化起到重要調節作用。

目前在綿羊中發現了BMP15基因6個與繁殖力相關的突變。即FecXI、FecXB、FecXL、FecXH、FecXG和FecXR。其中任何一個突變雜合的所有母羊都表現有較高的排卵數，突變純合個體由于卵巢沒有初級卵泡而導致完全不育。Galloway等[2]（2000）發現了Inverdale綿羊BMP15基因的FecXI突變和Hanna綿羊BMP15基因的FecXH突變；Hanrahan等[3]（2004）在Belclare綿羊和Cambridge綿羊BMP15基因編碼區發現了FecXG突變，在Belclare綿羊BMP15基因編碼區發現了FecXB突變；Bodin等[4]（2007）發現了Lacaune綿羊BMP15基因的FecXL突變；Monteagudo等[5]（2008）和Martinez-Royo等[6]（2008）幾乎同時發現了BMP15基因與繁殖力相關的第6個突變，即西班牙Rasa Aragonesa綿羊BMP15基因第二外顯子第525～541位缺失17個核苷酸，根據BMP15基因突變的命名規則，該突變命名為FecXR。國內學者對小尾寒羊和湖羊展開了BMP15基因的研究，發現高繁殖力的小尾寒羊發生了BMP15基因的FecXG突變，推測小尾寒羊的多胎性可能與該突變有關系。本實驗以哈薩克羊為實驗材料，采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性（Polymerase Chain Reaction-Restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）及直接測序法（PCR-DS）方法對BMP15基因進行多態性檢測與分析，查找哈薩克羊在該基因酶切位點中的多態性，并對具有多態性的DNA片段進行測序分析，以期在該基因中找到與哈薩克羊產羔性狀相關的遺傳標記位點，為開展標記輔助選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗羊是在尼勒克縣、特克斯縣、昭蘇縣提供的2 000多只羊群體中選擇抽取719只，其中411只產雙羔羊，308只產單羔羊。頸靜脈采血，ACD抗凝，供提取綿羊基因組DNA。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 參照《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》[7]以及常規酚-氯仿抽提法提取血液基因組DNA。

1.2.2 引物設計和PCR擴增 參照GeneBank中綿羊BMP15基因（登錄號：NM_001114767）利用Olig 6.0和Primer 5.0設計引物如下表。

表1 檢測哈薩克羊多胎候選基因的引物

PCR擴增體系為25 μL，包括：10×PCR緩沖液2.5 μL；10 pmol/L引物0.5 μL；dNTPs2.0 μL；2.5 U/μL TaqDNA聚合酶0.25 μL；100 ng/μL的DNA模板1.0 μL，其余用水補齊至25 μL。

1.2.3 PCR擴增條件為 94℃預變性3 min；94℃變性30 s；62～55℃退火30 s；72℃延伸30 s；35個循環，72℃延伸10 min；4℃保存，產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 PFLP分析 5 μLPCR 擴增產物；1.5 μL 10× Buffer；0.5 μL限制性內切酶；3 μL水。

反應條件：37℃水浴；4 h左右；3%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，并在凝膠成像儀上成像觀察結果，并保存圖像。

1.2.5 產物回收與測序 根據RFLP分析結果，挑選出不同帶型的PCR產物各2個，用2%的瓊脂糖凝膠進行檢測，利用PCR產物回收試劑盒回收，并將回收后的產物送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.3 統計與分析

利用Chromas2、MEGA 5.05軟件進行測序結果分析；使用Popgene Version 32生物軟件計算等位基因頻率、基因型頻率、群體雜合度（He）、有效等位基因數（Ne），并檢驗是否處于Hardy-weinberg平衡；采用PIC軟件計算多態信息含量（PIC）值；利用SAS 8.0軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

2.1.1 BMP15基因FecXG位點PCR擴增結果 用FecXG位點的引物對哈薩克羊基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物片段與目的片段大小一致（141 bp）（圖1），結果表明：特異性良好，可直接用于RFLP分析。

圖1 FecXG基因的PCR產物

2.1.2 BMP15基因FecXB位點PCR擴增結果 用FecXB引物對哈薩克羊基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物片段與目的片段大小一致（153 bp）（圖2），結果表明：特異性良好，可直接用于RFLP分析。

圖2 FecXB基因的PCR產物

2.2 PCR-RFLP結果

2.2.1 BMP15基因FecXG位點PCR-RFLP結果 用Hinf I內切酶對BMP15基因FecXG位點所擴的PCR產物進行酶切，用3%瓊脂糖電泳對酶消化產物進行檢測，得到111 bp條帶，顯示PCR產物沒有被酶切開（圖3）。

圖3 FecXG基因的PCR產物酶切結果

2.2.2 BMP15基因FecXB位點PCR-RFLP結果 用Dde I內切酶對BMP15基因FecXB位點所擴的PCR產物進行酶切，用3%瓊脂糖電泳對酶消化產物進行檢測，結果只有122 bp的酶切條帶，說明該位點在哈薩克羊中不存在多態性（圖4）。

圖4 FecXB基因的PCR產物酶切結果

2.3 測序結果

對第二外顯子的PCR產物進行直接測序。測序結果發現：野生型AA型和突變型AB型相比，在AB型個體中，BMP15基因第775位點有一個G和A的雜合（圖5）。

圖5 綿羊BMP15基因AA型和AB型測序結果比較

2.4 BMP15基因第2外顯子的群體遺傳學分析

通過對不同產羔數的719只哈薩克羊樣本直接測序檢測結果進行分析發現（表1），優勢基因型均為AA型，優勢等位基因為A基因。群體雜合度（He）、有效等位基因數（Ne）和多態信息含量（PIC）是評價群體內遺傳多樣性的指標。哈薩克羊屬于低度多態（PIC<0.25）（表2）。χ2適合性檢驗表明處于Hardyweinberg平衡狀態（P>0.05）。

表2 755bp處基因型頻率和基因型頻率

對哈薩克羊群體BMP15基因第755位點的純合度、雜合度、有效等位基因數以及多態信息含量進行統計分析，表3計算結果表明，在哈薩克羊群體中PIC屬于低度多態。

表3 BMP15基因多態位點多態性參數分析

2.5 不同基因型在哈薩克羊群體中分布的差異顯著性檢驗

群體AA，AB兩種基因型與產羔數顯著性檢驗結果，表明攜帶基因型AA與AB群體之間產羔數差異顯著（P<0.05）。產羔數平均值表現為：AB>AA（表4）。

3 討論

3.1 基因的遺傳特性

在對719個哈薩克羊樣本進行檢測分析時，BMP15基因發現AA、AB基因，優勢基因型為AA型，優勢等位基因為A基因，沒有發現BB基因型的個體，這可能是被檢測的品種中BB基因型突變頻率太低或者BB基因為致死基因從而使得個體不能存活[8]。遺傳多態分析表明，多態信息含量小于0.25，屬于低度多態；χ2適合性檢驗表明：處于Hardy-weinberg平衡狀態，說明該地區自然選擇或者人工選擇對該基因分布的影響較小，在遺傳漂變、遷徙和人工選育等因素下保持動態平衡。

表4 BMP15不同基因型產羔數的最小二乘平均值及標準誤

3.2 基因多態性與生產性狀的關系

近年來，國內外關于綿羊BMP15基因多態性的研究報道比較多，且主要集中在對高繁殖力綿羊品種小尾寒羊、湖羊等品種的研究，而對于低繁殖力的哈薩克羊突變位點多態性的研究報道比較少。本實驗利用PCR-RFLP、PCR-DS方法，對哈薩克羊群體BMP15基因進行了多態性檢測。結果發現：哈薩克羊群體中BMP15基因FecXG和FecXB位點均未出現多態性，這與Galloway等[2]發現了Inverdale綿羊BMP15基因的FecXG突變和Hanna綿羊BMP15基因的FecXB突變結果有差異，可能是由于不同綿羊品種的產羔數差異導致的這個差異的原因。測序結果表明：AB型個體在該基因第二外顯子第755位點發生G→A的突變，出現G/A的雜合。本研究中發現的突變為同義突變，沒有引起相應氨基酸序列的變化，但由于堿基序列發生了變化，因此會影響基因的翻譯速度，從而影響該基因的表達質量，甚至會導致蛋白質的空間結構的變化，從而影響其功能的發揮[9]。因此推斷，BMP15基因第755位點的突變可以作為控制哈薩克羊多胎產羔的潛在遺傳標記位點，需要進一步進行深入的研究。

4 結論

4.1 BMP15基因FecXG、和FecXB位點的多態性

通過PCR-RFLP檢測BMP15基因的FecXG、和FecXB位點，結果發現這兩個位點在哈薩克羊群體中不存在多態性，表明BMP15基因的FecXG、和FecXB位點的多態性與哈薩克羊產羔數沒有相關性。

4.2 BMP15基因第二外顯子第775突變位點的多態性

運用PCR-DS方法對719個哈薩克羊樣本的BMP15基因第2外顯子進行多態性檢測，在第755位點均有G和A的雜合出現，沒有發現突變純合體。在BMP15基因的相關分析中，不同基因型AA和AB群體的產羔數之間差異顯著。

參考文獻

[1]田秀娥，孫紅霞，王永軍.3個綿羊群體BMPR-IB基因的遺傳多態性及其對產羔數的影響[J].西北農林科技大學學報：自然科學版，2009,11（37）：31-36.

[2]Galloway S M，McNatty K P，Cambridge L M，et al.Mutations in anoocyte-derived growth factor gene（MBP15）are associated with both increased rate and sterility in Cambridge and Belclare sheep[J].Biology of Reproduction，2004，70（4）：900-909.

[3]Hanrahan J P，Gregan S M，Mulsant P，et al.Muantions in the genes for oocyte-derived groeth factors GDF9 and BMPR15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belcalaer sheep ，Biol Reprod.2004，70：900-909.

[4]Bodin L，Di Pasquale E，Fabre S，et al.A novel mutation in the BMPR15 gene causing defective protion secretion is Lacaune sheep[J].En-docrinology，2007，148（1）：393-400.

[5]Monteagudo L V，Ponz R，Tejedor M T.A 17 bp deletion in the bone morphogenetic protein 15（BMPR15）gene is associated to increased prolif cacy in the Rasa Aragonesa sheep breed[J].Animal Reproduction Science，2009，110：139-146.

[6]Martinez-Royo A，Jurado J J，Smulders J P.A deletion in the bone morphogenetic protein 15 gene cause sterility and increased prolicacy in Rasa Aragonesa sheep[J].Animal Genetics，2008，39（3）：294-297.

[7]趙有璋.羊生產學[M].北京：中國農業出版社，2000.

[8]Davis G H.fecunity genes in sheep[J].Animal Reproduction Science，2004：82-83.

[9]Kimchi-Sarfaty C，Oh J M，Kim I W，et al.A“Silent”polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specif city[J].Animal Science，2007，315（5811）：525-528.

（編輯：張淑鳳）

S813.3

B

1006-799X(2016)24-0103-04

哈薩克羊多胎（多羔）基因檢測項目（YZ201502018）。

陳春華（1987-），女，新疆昭蘇縣人，畜牧師，主要研究方向為動物遺傳育種與繁殖。

楊光維（1981-），男，湖北咸豐人，高級畜牧師，主要研究方向為動物遺傳育種與繁殖。