椎體中注入骨水泥對骨質疏松兔軟骨終板退變的影響

趙司順，劉曉偉，王勝，張增山，田云虎

(濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東濰坊261031)

椎體中注入骨水泥對骨質疏松兔軟骨終板退變的影響

趙司順，劉曉偉，王勝，張增山，田云虎

(濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東濰坊261031)

目的 探討椎體中注入骨水泥對骨質疏松兔軟骨終板退變的影響。方法選取35只健康雌兔，采用去勢法制備骨質疏松模型。從中選取32只生長狀況良好的骨質疏松兔，隨機分為觀察組和對照組，每組16只。觀察組于L7椎體注入骨水泥約0.5 mL，對照組僅行后路椎體穿刺，不注入骨水泥，余處理同觀察組。兩組分別于術后4、8周各隨機抽取8只骨質疏松兔，處死后取出L6/7椎間盤，并對L7軟骨終板進行分離。光鏡下觀察軟骨終板組織學特點并進行Mankin評分，免疫組化SP法檢測Ⅱ型膠原表達，間苯三酚分光光度法檢測糖胺多糖(GAG)表達。結果兩組軟骨終板表層均有小裂隙出現(xiàn)，軟骨血管呈纖維化；中、深層均有少量簇聚的軟骨細胞和單個肥大的軟骨細胞，部分出現(xiàn)潮線斷裂或雙重潮線，HE染色有失染現(xiàn)象。兩組術后4、8周軟骨終板組織Mankin評分、Ⅱ型膠原、GAG表達比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。結論椎體內注入骨水泥不會引起骨質疏松兔鄰近椎間盤軟骨終板的退變。

骨質疏松；椎體成形術；骨水泥；軟骨終板；糖胺多糖；Ⅱ型膠原；兔

隨著人口老齡化的加重，骨質疏松及其導致的椎體壓縮性骨折發(fā)病率逐漸升高。椎體成形術及后凸成形術是治療骨質疏松性椎體壓縮性骨折的主要方法，可加固椎體、緩解疼痛，有利于患者早期下地活動，從而提高其生活質量[1]。但椎體成形術及后凸成形術中均需注入骨水泥，其對椎間盤組織的影響及是否會引起軟骨終板退變尚不明確。為此我們于2012年6月～2013年12月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：雌性家兔35只，5月齡，體質量(2.0±0.2)kg，由濰坊醫(yī)學院動物中心提供。試劑及儀器：A10290R兔抗兔Ⅱ型膠原多克隆抗體購于上海滬峰化工有限公司；PV-9000通用型二步法免疫組化染色試劑盒(包括試劑Ⅰ聚合物輔助劑、試劑Ⅱ辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG多聚體)、3% H2O2均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。Olympus BX51型光學顯微鏡購于日本奧林巴斯有限公司，F(xiàn)luorChem5500圖像分析儀購于美國自然基因科技有限公司，XH-89型旋渦振蕩器購于浙江樂清儀器廠。

1.2 造模與分組處理 采用去勢法[2]制備骨質疏松兔模型，即將兔麻醉后行雙側卵巢摘除術，術后按照與術前相同的飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)3個月。測定椎體的骨密度，低于正常值的25%為造模成功。選取32只生長狀況良好的骨質疏松兔，隨機分為觀察組和對照組，每組16只。兩組均沿耳緣靜脈注射40%烏拉坦2 mL/kg進行麻醉，麻醉滿意后將其俯臥位固定在手術架上，經(jīng)背部旁正中切口，顯露L7椎體前半部分(兩側髂嵴最高點連線平對L6/7椎間隙)，觀察組注入骨水泥約0.5 mL，難以注入的椎體用小刮匙挖出少量骨質后再注入，但不能損傷終板，逐層縫合切口。對照組僅行后路椎體穿刺，不注入骨水泥，余處理同觀察組。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 軟骨終板組織學特點 兩組分別于術后4、8周各隨機抽取8只骨質疏松兔，以空氣栓塞法處死后取出L6/7椎間盤，并對L7軟骨終板進行分離。將軟骨終板進行脫鈣、固定、常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚度切片。HE染色后光鏡下觀察組織學變化，并參照Mankin評分標準[3]對軟骨終板進行組織學評分，0分為正常軟骨、2～7分為輕度軟骨退變、8～12分為中度軟骨退變、13～14分為重度軟骨退變。

1.3.2 軟骨終板組織Ⅱ型膠原表達 采用免疫組化SP法。取兩組軟骨終板組織，石蠟切片脫蠟至水，二甲苯脫蠟，3% H2O2去離子水孵育10 min滅活，常規(guī)抗原修復，滴加一抗、二抗，DAB顯色，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。參照Loreto等[4]的方法判定結果，細胞質內見棕黃色顆粒的細胞為陽性細胞，無棕黃色顆粒的細胞為陰性細胞。于400倍光鏡下，每張切片隨機選擇10個不重疊的視野，采用JD801圖像分析系統(tǒng)分析每個視野中Ⅱ型膠原的灰度值，取平均值。

1.3.3 軟骨終板組織糖胺多糖(GAG)表達 采用間苯三酚分光光度法。將軟骨終板組織制成勻漿，加入胰蛋白酶水解，離心后取上清液。加入HCl以水解GAG，游離氨基己糖；加入乙酰丙酮，使氨基己糖生成吡咯衍生物；待其冷卻后加入乙醇，最后加入對二甲胺基苯甲醇混勻后顯紅色，采用分光光度計檢測530 nm波長處的吸光度值(A值)。GAG表達=(樣本管A值/標準管A值)×0.1×(沉淀物稀釋倍數(shù)/樣本用量)。

2 結果

2.1 軟骨終板組織學特點 兩組軟骨終板表層均有小裂隙出現(xiàn)，軟骨血管呈纖維化；中、深層均有少量簇聚的軟骨細胞和單個肥大的軟骨細胞，部分出現(xiàn)潮線斷裂或雙重潮線，HE染色有失染現(xiàn)象。兩組術后4、8周Mankin評分比較見表1。

表1 兩組術后4、8周軟骨終板組織Mankin評分比較

注：與對照組同時間點比較，P均>0.05。

2.2 軟骨終板組織Ⅱ型膠原表達 見表2。

表2 兩組術后4、8周軟骨終板組織Ⅱ型膠原表達比較

注：與對照組同時間點比較，P均>0.05。

2.3 軟骨終板組織GAG表達 見表3。

表3 兩組術后4、8周軟骨終板組織GAG表達比較

注：與對照組同時間點比較，P均>0.05。

3 討論

椎體成形術和椎體后凸成形術均具有良好的止痛及椎體加固作用，可迅速緩解骨質疏松性壓縮性骨折患者的疼痛，有助于患者早期下地活動。患者術后近期并發(fā)癥以骨水泥滲漏最為嚴重[5]，滲漏的骨水泥進入椎管或椎間孔，可造成脊髓或神經(jīng)根的壓迫；進入血管可引起栓塞，其中以肺栓塞最為嚴重。術后遠期并發(fā)癥包括椎體再骨折、鄰近椎間盤退變等[6～8]。術后并發(fā)癥的發(fā)生是由于手術本身導致的，還是術后椎體力學因素發(fā)生改變或骨水泥的毒副作用所致目前仍存在爭議。手術后鄰近椎體發(fā)生椎間盤退變的原因可能有[9～12]：①椎體注入骨水泥后硬度增加，鄰近椎體、椎間盤承受負荷增加。②骨質疏松性椎體壓縮性骨折可能會破壞軟骨終板的血運，從而影響椎間盤的主要營養(yǎng)供給途徑。③骨水泥的毒副作用以及聚合過程中的放熱效應可能會損傷軟骨終板。④骨水泥滲漏可改變椎間盤的性能。⑤骨折后椎體的楔形改變導致脊柱重力曲線前移，使椎間盤的應力改變。以上因素綜合作用，最終可引起椎間盤退變。

椎間盤由軟骨終板、纖維環(huán)及髓核組成，椎間盤內細胞和細胞外基質營養(yǎng)物質的缺乏是引發(fā)椎間盤退變的重要因素。蛋白多糖和膠原作為軟骨終板的主要成分，其表達變化可作為衡量軟骨終板退變的指標,通過測定GAG可間接反映蛋白多糖含量。研究表明，發(fā)生退變的軟骨終板組織蛋白多糖和Ⅱ型膠原表達均降低，蛋白多糖含量降低必然伴隨水分減少，最終導致軟骨終板鈣化[13]。鈣化的軟骨終板喪失了對椎間盤的營養(yǎng)功能和緩沖作用，最終引起椎間盤退變。本研究結果顯示，兩組術后4、8周軟骨終板組織Ⅱ型膠原、GAG表達和Mankin評分比較差異均無統(tǒng)計學意義，軟骨終板組織學特點差異也不大，以上均說明椎體中注入骨水泥不會引起骨質疏松兔椎間盤軟骨終板的退變。分析原因，可能與本研究中注入骨水泥的量比較小，且在注入時避免骨水泥直接接觸軟骨終板有關。

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山東省科技發(fā)展計劃項目(2012YD18107)。

田云虎(E-mail： tianyunhugk@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.009

R687.3

A

1002-266X(2016)48-0031-03

2015-12-29)