牦牛和雄性不育犏牛睪丸ERK1、ERK2、P38基因mRNA水平的比較

雷杰雯， 黃林， 金素鈺， 鄭玉才

(西南民族大學生命科學與技術學院，成都610041)

牦牛和雄性不育犏牛睪丸ERK1、ERK2、P38基因mRNA水平的比較

雷杰雯， 黃林， 金素鈺， 鄭玉才*

(西南民族大學生命科學與技術學院，成都610041)

MAPK信號通路對哺乳動物的精子發生與凋亡有重要的調節作用，被認為是精子發生的重要決定因素之一。本研究通過比較MAPK信號通路中ERK1、ERK2、P38基因在牦牛及其雜交后代犏牛睪丸組織中的相對表達量，探索犏牛雄性不育的分子機制。實驗從成年雄性牦牛(n=10)和犏牛(n=7)的睪丸組織中提取總RNA，采用實時熒光定量PCR技術檢測牦牛和犏牛睪丸組織中ERK1、ERK2、P38基因mRNA水平。結果表明：牦牛睪丸中ERK1、ERK2基因的表達量極顯著高于犏牛(P<0.01)，P38基因在牦牛和犏牛睪丸中均有表達，但差異無統計學意義。提示ERK1、ERK2基因作為MAPK信號通路的重要成員，可能與犏牛睪丸精子發生障礙有一定關聯。

牦牛；犏牛；MAPK信號通路；ERK1；ERK2；P38；

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPKs)是在動物細胞內廣泛存在的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，重要的家族成員有：細胞外信號調節蛋白激酶(ERK1/2)、c-JNK末端激酶/應激活化蛋白激酶(JNK/SAPK)、P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 MAPK)和ERK5/大絲裂素活化蛋白激酶(BMK1)。ERK1/2和P38在MAPK中是2條相對獨立的信號轉導通路，前者可被細胞因子、生長因子、神經遞質和激素等激活，通過磷酸化胞漿蛋白、核轉錄因子、細胞骨架蛋白及酶類等促進細胞的增殖、生長和分化(Galabova-Kovacsetal.，2006；Roskoski，2012)；而P38 MAPK能被一些環境應激、炎癥信號和生長因子激活，促進細胞凋亡、炎癥反應、生長抑制等(Lysiaketal.，2000；Gangwanietal.，2015)。大量文獻報道，MAPK信號通路對哺乳動物生精細胞及精子的發生與凋亡、精子在附睪中的成熟、卵細胞受精前的精子獲能和頂體反應等有重要的調節作用(Liuetal.，2014；Zhuetal.，2015)，被認為是精子發生的重要決定因素之一(Alomg & Naor，2010)。

牦牛Bosgrunniens與普通牛雜交的后代——犏牛具有明顯的雜種優勢，但雜種F1～F3代犏牛雄性不育，這嚴重阻礙了犏牛雜種優勢的橫向保留和縱向遺傳。因此，探明犏牛雄性不育的機理是牦牛雜交育種與改良需要解決的重要科學問題。本實驗室前期對牦牛和犏牛睪丸組織差異表達miRNA的KEGG分析表明，富集最多的是MAPK通路(Lietal.，待發表)，提示該信號通路可能與犏牛雄性不育有關。有研究發現，ERK1、ERK2、P38 MAPK在不同階段的生精細胞中均有表達(Ranawat & Bansal，2009)。ERK1/2參與睪丸組織中細胞的增殖及精子發生過程中有絲分裂以及減數分裂的調控(Setteetal.，1999)，而P38 MAPK參與生精細胞的凋亡過程(Zhuetal.，2015)。F1代犏牛睪丸中的支持細胞、生殖細胞、間質細胞數量較少，且精原細胞凋亡數量較多(張旭靜，2001)。因此，本研究的假設是：雄性不育犏牛與牦牛睪丸中MAPK通路中的相關基因可能存在表達差異。本研究采用實時熒光定量PCR技術檢測牦牛和犏牛睪丸中ERK1、ERK2、P38基因mRNA的表達水平，以期從信號通路變化上探索犏牛雄性不育的分子機制。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于秋季在成都市青白江一屠宰場采集麥洼牦牛和犏牛(母麥洼牦牛與公黃牛的雜交后代)的睪丸樣品。實驗動物包括健康的成年雄性牦牛10頭和雄性犏牛7頭，在商業化屠宰時迅速采集新鮮睪丸，經過適當分割后置于干冰中冷凍，立即帶回實驗室并保存于-80 ℃冰箱中。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑包括：Trizol Reagent(美國Ambion公司)，QuantiFast SYBR Green PCR Kit(德國QIAGEN公司)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(美國Thermo Scientific公司)，Cycle-pure Kit(美國OMEGA公司)，Long Taq DNA Polymerase(美國GeneCopoeia公司)。

主要儀器包括：Biowave DNA紫外可見分光光度計(英國Biochrom公司)，CFX96 TouchTM熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，CR21G高速冷凍離心機(日本日立公司)。

1.3 睪丸總RNA的提取及反轉錄

采用Trizol試劑按試劑盒說明提取牦牛和犏牛睪丸組織的總RNA，紫外分光光度法測定濃度。根據反轉錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書的步驟，以4 μg總RNA為模板進行反轉錄，得到cDNA。

1.4 引物設計與PCR擴增

參照普通牛ERK1、ERK2、P38基因的預測序列(GenBank登錄號：NM_001110018、NM_175793、NM_001102174)，以及普通牛GAPDH、18s RNA基因的預測序列(GenBank登錄號：NM_001034034、NR_036642)，用Primer Premier 5.0分別設計目的基因和內參基因的定量PCR引物(表1)，并由上海生工生物工程有限公司合成。

將反轉錄得到的牦牛睪丸組織cDNA進行PCR擴增，本實驗采用25 μL的PCR反應體系：超純水9.5 μL，模板cDNA 1 μL，Long Taq DNA Polymerase 12.5 μL，上、下游引物各1 μL。PCR反應條件：預變性(95 ℃ 4 min)；變性(95 ℃ 30 s)，退火(ERK1：66 ℃ 15 s；ERK2：66 ℃ 30 s；P38：68 ℃ 20 s)，延伸(72 ℃ 30 s)，35個循環；再72 ℃ 5 min，最后4 ℃保存。擴增產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 本實驗引物信息Table 1 Primers used in this study

1.5 睪丸組織ERK1、ERK2、P38基因mRNA的定量PCR分析

分別對上述基因進行PCR擴增，根據PCR純化試劑盒說明書步驟將產物純化后進行10倍梯度稀釋，將稀釋梯度濃度為每毫升104～109拷貝數的產物作為模板，進行熒光定量PCR擴增，繪制標準曲線。

以反轉錄的牦牛和犏牛睪丸組織cDNA為模板，采用實時熒光定量PCR方法檢測ERK1、ERK2、P38基因在牦牛和犏牛睪丸中的相對表達量。實時熒光定量PCR反應體系同前。PCR反應條件：預變性(95 ℃ 5 min)；變性(95 ℃ 15 s)，退火(ERK1：66 ℃ 15 s；ERK2：66 ℃ 20 s；P38：68 ℃ 20 s)；延伸(72 ℃ 15 s)，40個循環；65 ℃～95 ℃制作熔解曲線。每個樣品做2個重復。

1.6 數據統計

將牦牛睪丸目的基因的表達量作為對照，用雙內參基因GAPDH和18s RNA的幾何平均數進行校準。2-△△Ct法計算ERK1、ERK2、P38基因在牦牛和

犏牛睪丸組織中的相對表達水平(Livak & Schmittgen，2001)。實驗數據用平均值±標準誤表示，定量結果用SPSS 19.0進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 牦牛睪丸ERK1、ERK2、P38基因的PCR擴增結果

根據普通牛ERK1、ERK2、P38基因預測序列設計的定量PCR引物，均從牦牛睪丸cDNA中擴增出特異性高的產物，條帶亮、無雜帶，且與預期片段長度相符(圖1)。

圖1 牦牛睪丸ERK1、ERK2、P38基因的PCR擴增結果

Fig. 1 Amplification ofERK1，ERK2 andP38 genes of yak testis

M. DL2000 Marker，A： 1～4.ERK1基因, B： 1～3.P38基因， 4.ERK2基因。

M. DL2000 Marker，A： 1～4.ERK1 gene, B： 1～3.P38 gene， 4.ERK2 gene.

2.2ERK1、ERK2、P38基因實時熒光定量PCR標準曲線的建立

以GAPDH和18s RNA為內參基因，對牦牛和犏牛睪丸中ERK1、ERK2、P38基因mRNA水平進行了實時熒光定量PCR檢測，ERK1、ERK2、P38基因擴增效率依次為98.6%、93.8%和98.2%，擴增效率均在CFX96 TouchTM熒光定量PCR儀要求的有效范圍內(92%～105%)。3個目的基因的標準曲線線性關系好(R2>0.99)，且熔解曲線峰單一，表明它們均被特異性擴增(圖2)。

2.3 牦牛和犏牛睪丸ERK1、ERK2、P38基因mRNA水平分析

實時熒光定量PCR結果顯示，ERK1、ERK2基因在牦牛睪丸中的表達量極顯著高于犏牛(P<0.01)，其中牦牛的ERK1基因表達是犏牛的6倍，牦牛的ERK2基因表達是犏牛的2.4倍，而P38基因表達差異無統計學意義(圖3)。

3 討論

本研究從牦牛睪丸總RNA中分別特異性擴增出ERK1、ERK2、P38基因。實時熒光定量PCR結果顯示，ERK1、ERK2基因在牦牛睪丸中的表達量極顯著高于犏牛，提示這2個基因可能與牦牛睪丸精子的發生有密切聯系。根據相關文獻報道，犏牛睪丸組織中與精子發生相關的以及與哺乳動物精母細胞減數分裂相關的SYCP3基因、Dmart7基因、DDX4基因mRNA水平均極顯著低于牦牛(屈旭光等，2008；金帥等，2013；周陽等，2013)。本實驗室前期研究也發現，參與精母細胞減數分裂的基因如Msch4基因，在犏牛睪丸組織中mRNA水平極顯著低于牦牛(曾琴等，2013)。但牦牛睪丸組織這些基因高表達于犏牛睪丸組織的原因尚不清楚。ERK1在小鼠精母細胞減數分裂中G2/M過渡期被特異激活，有助于促成熟因子機制的激活，是減數分裂中期染色體凝集必不可少的(Setteetal.，1999)。在精母細胞減數分裂中的染色體凝集，需要通過ERK1/2信號通路激活細胞周期調控蛋白激酶家族，促進細胞正常分裂的進行(Di Agostinoetal.，2002)。這表明ERK1、ERK2基因參與生殖細胞減數分裂的調控，對精子的發生具有十分關鍵的作用。因此，推測犏牛睪丸中ERK1、ERK2基因下調可能影響其正常的精子發生。

A

(a)標準曲線(b) 熔解曲線

B

(a)標準曲線(b) 熔解曲線

C

(a)標準曲線(b) 熔解曲線圖2 ERK1、ERK2、P38基因的熒光定量PCR標準曲線和熔解曲線Fig. 2 The standard curve and melting curve for fluorescence quantitative PCR of ERK1， ERK2 and P38 genes

A、B、C依次為ERK1、ERK2和P38基因熒光定量PCR的標準曲線(a)和熔解曲線(b); (a) y軸表示Cq值， x軸表示起始模板量， (b) y軸表示隨時間推移的相對熒光單位， x軸表示溫度。

A， B， C are the standard curve (a) and melting curve (b) for fluorescence quantitative PCR ofERK1，ERK2 andP38 genes， respectively; (a) y-axis： value of Cq， x-axis： log starting quantity， (b) y-axis： the rate of change of the relative fluorescence， x-axis： temperature.

Ge等(2014)報道，激活ERK1/2通路能促進小鼠睪丸支持細胞株的生長。Nan等(2014)研究發現，抑制ERK1/2的活化可顯著抑制大鼠睪丸支持細胞的增殖。由此可見ERK信號通路的激活是睪丸支持細胞及生殖細胞增殖所必需的。另外，

圖3ERK1、ERK2、P38基因在牦牛和犏牛睪丸中的相對表達量

Fig. 3 Relative expression ofERK1，ERK2 andP38 genes in

the testes of yaks and cattle-yaks

**P<0.01.

ERK1/2信號通路參與促性腺激素釋放激素誘導的促卵泡素和促黃體素生成，二者是調節精子發生的重要激素(Guretal.，2001)。促卵泡素可激活ERK1/2級聯反應，誘導小鼠睪丸支持細胞的膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)的表達，進而促進生精細胞增殖，抑制精原干細胞分化(Hasegawaetal.，2013)。睪丸間質細胞MEK/ERK信號通路缺失導致睪丸間質細胞發育不全和高促性腺激素性性腺功能減退癥(Yamashitaetal.，2011)。犏牛睪丸中ERK基因mRNA水平極顯著低于牦牛，可能會直接或通過影響與生殖有關的激素的合成，導致犏牛睪丸組織細胞異常，影響精子的發生。

有研究發現，大鼠睪丸內溫度的升高和睪丸激素水平的降低都可激活P38 MAPK，加速精子凋亡(Jiaetal.，2009)。輸精管結扎后的大鼠初級精母細胞發生凋亡，且其凋亡與P38的激活存在時間和空間上的關系，表明P38與生精細胞的凋亡密切相關(Zhuetal.，2015)。本研究中P38基因mRNA在牦牛和犏牛睪丸中均有表達，但表達量差異不顯著，這可能與P38 MAPK主要參與炎性刺激所引發的細胞凋亡及熱誘導精子損傷有關(Rahmanetal.，2014)。有報道表明，犏牛睪丸中細胞凋亡顯著高于牦牛(張旭靜，2001；Louetal.，2014)，但本研究結果提示，犏牛睪丸中生精細胞的凋亡可能并不依賴于P38 MAPK信號通路。

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Comparison of the mRNA Expression Level ofERK1，ERK2 andP38 Genes in the Testes of Yaks and Sterile Cattle-yaks

LEI Jiewen， HUANG Lin， JIN Suyu， ZHENG Yucai*

(College of Life Science and Technology， Southwest University for Nationalities， Chengdu 610041， China)

MAPK signaling pathway plays an important role in the regulation of spermatogenesis and sperm apoptosis in mammals， and it is considered to be one of the important determinants of spermatogenesis. To explore the molecular mechanism of male sterility of cattle-yaks， the expression levels ofERK1，ERK2 andP38 genes [the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway] in the testes of yaks and cattle-yaks were compared in this study. Total RNA was extracted from the testes of yaks (n=10) and cattle-yaks (n=7). The expression levels ofERK1，ERK2 andP38 genes in the testes of yaks and cattle-yaks were examined by real-time fluorescence quantitative PCR. The mRNA expression levels ofERK1 andERK2 genes in the testes of yaks were very significantly higher than those of cattle-yaks (P<0.01). Moreover， although the expression ofP38 gene was detected in both testes of yaks and cattle-yaks， no significant difference was found. The results of this study suggested thatERK1 andERK2 may be associated with the abnormal spermatogenesis in cattle-yak testes through MAPK signaling pathway.

yak; cattle-yak; MAPK signaling pathway;ERK1;ERK2;P38

2016-05-02 接受日期：2016-06-15

國家自然科學基金項目(31240053); 西南民族大學研究生創新項目(CX2015SZ083)

雷杰雯(1992—)， 女， 碩士研究生， 研究方向為動物功能基因組學， E-mail：jiewenlei@yeah.net

*通信作者Corresponding author， E-mail：yucaizheng65@hotmail.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160109

Q959.8; Q78

A

1000-7083(2016)05-0666-06