撫仙金線鲃促性腺激素亞基基因克隆及組織表達分析

楊國坤， 關佳佳， 孫彩云， 王曉愛， 潘曉賦， 楊君興*， 李文笙*

(1. 有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東省水生經濟動物良種繁育重點實驗室，中山大學深圳研究院，中山大學生命科學學院，廣州510275; 2. 遺傳資源與進化國家重點實驗室，中國科學院昆明動物研究所，昆明650223)

撫仙金線鲃促性腺激素亞基基因克隆及組織表達分析

楊國坤1， 關佳佳1， 孫彩云1， 王曉愛2， 潘曉賦2， 楊君興2*， 李文笙1*

(1. 有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東省水生經濟動物良種繁育重點實驗室，中山大學深圳研究院，中山大學生命科學學院，廣州510275; 2. 遺傳資源與進化國家重點實驗室，中國科學院昆明動物研究所，昆明650223)

撫仙金線鲃Sinocyclocheilustingi是云南撫仙湖特有種，雖然實現了人工繁殖，但在塘養環境下仍無法自然繁衍。魚類的生殖活動受下丘腦-垂體-性腺軸的調控，其中促性腺激素在該過程中起重要作用。本實驗利用實時熒光定量PCR和cDNA末端快速擴增技術從撫仙金線鲃垂體中克隆了GTHα、FSHβ和LHβ 3種基因的cDNA序列，其中GTHα的開放閱讀框(ORF)長度為357 bp，編碼118個氨基酸，有10個半胱氨酸殘基和2個N-糖基化位點；FSHβ cDNA全長為856 bp，ORF長度為393 bp，編碼130個氨基酸，有11個半胱氨酸殘基和1個N-糖基化位點；LHβ cDNA全長為930 bp，ORF長度為441 bp，編碼146個氨基酸，有12個半胱氨酸殘基和1個N-糖基化位點。實時熒光定量PCR結果顯示，GTHα和LHβ都只在雄魚和雌魚的垂體中表達。FSHβ在垂體中表達量最高，在雌魚和雄魚的脂肪、肌肉和雄魚的精巢和肝臟中有少量表達。本研究為撫仙金線鲃的人工繁育提供了重要的基礎數據。

撫仙金線鲃；促性腺激素；克隆；組織表達

脊椎動物的生殖活動受腦-垂體-性腺軸調控，在此過程中，2種重要的促性腺激素(GTH)發揮著關鍵作用，分別為卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)。這2種促性腺激素均為異源二聚體結構形式的糖蛋白，擁有同一種α亞基，并且通過非共價鍵分別與各自的FSHβ和LHβ結合，發揮著不同的生理功能(Gharibetal.，1990)。大多數動物的促性腺激素都包含1個GTHα亞基、1個FSHβ或LHβ亞基，但在中華鱘Acipensersinensis中卻有2種GTHα亞基，分別為GTHαⅠ和GTHαⅡ(Caoetal.，2009)。促性腺激素各個亞基基因序列已經在多種魚類中被確認，在魚類的各個生長階段和生殖循環過程中都有表達，并發揮著重要的生理功能(Anetal.，2010)。在卵巢中，FSH和LH在早期卵巢的分化中起關鍵作用(Anetal.，2010)，LH可以促進卵泡成熟、排卵以及類固醇激素的合成，而在精子的發生及早期生殖系統的發育中，FSH可能起主要作用(Ando & Urano，2005；Guzmanetal.，2009)。

撫仙金線鲃Sinocyclocheilustingi屬鯉形目Cypriniformes鯉科Cyprinidae金線鲃屬Sinocyclocheilus，俗名波羅魚，僅分布于云南省撫仙湖(楊君興，陳銀瑞，1995)。由于外來物種入侵和過度捕撈，撫仙金線鲃的種群數量急劇減少，現湖體種群數量稀少，僅有少量個體存活在沿湖的龍潭中(楊君興，陳銀瑞，1995；潘曉賦等，2009；王偉營等，2011)。目前對撫仙金線鲃的研究僅局限于人工繁殖和苗種培育技術(潘曉賦等，2009)、肌肉營養成分分析(趙亞鵬等，2013)，其生殖系統方面的研究鮮有涉及，撫仙金線鲃人工繁殖中存在生殖系統紊亂的現象(Mylonas & Zohar，2007；Cabritaetal.，2009)，不能實現塘養環境下的自然繁殖。本研究克隆撫仙金線鲃生殖關鍵基因GTHα、FSHβ以及LHβ的cDNA并分析它們在不同組織中的表達特性，為撫仙金線鲃繁殖生理的進一步研究提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用魚由中國科學院昆明動物研究所珍稀魚類保育研究基地提供，為人工繁殖的撫仙金線鲃，雌、雄魚各3尾，體長12～15 cm，健康且性成熟。實驗用魚在光照、黑暗各12 h，循環水中馴養1周。本研究取樣時間為7月，且雌魚未排卵。實驗時丁香酚麻醉后斷頭處死，迅速取出相應組織放入RNase free EP管中，并立即放于液氮，然后轉至-80 ℃保存備用。

表1 撫仙金線鲃GTHα、FSHβ和LHβ克隆和表達分析引物Table 1 Primers used for cloning and expression analyses of GTHα， FSHβ and LHβ in Sinocyclocheilus tingi

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和cDNA第一條鏈的合成 利用Trizol法(Life Technologies)提取撫仙金線鲃垂體總RNA，利用超微量紫外檢測儀(Nanodrop 2000C，Thermo Scientific)檢測總RNA的濃度后，用M-MLV逆轉錄酶(Life Technologies)進行第一條鏈的合成，用內參基因β-actin，并用PCR Kit(東盛生物)做PCR驗證第一條鏈合成質量，反應程序為94 ℃ 3 min;94 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，25個循環;72 ℃ 5 min;4 ℃保存。

1.2.2 GTHα、FSHβ和LHβ基因中間保守片段的克隆 根據GenBank中鯉科魚類斑馬魚Daniorerio、草魚Ctenopharyngodonidella和青魚Mylopharyngodonpiceus相關基因的保守區域設計兼并引物(表1)，以驗證過的垂體cDNA第一條鏈為模板，與各個基因設計好的兼并引物用Blend Taq-Plus(TOYOBO)擴增各個基因的中間保守片段，PCR反應程序為94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環;72 ℃ 10 min;4 ℃保存。PCR產物用E.Z.N.A膠回收試劑盒(OMEGA，Bio-Tek)回收后連接到PCR2.1載體(Invitrogen，Life Technologies)后克隆測序。

1.2.3 GTHα、FSHβ和LHβ基因3’RACE和5’RACE 用M-MLV逆轉錄酶進行第一條鏈合成，用于3’RACE的第一條鏈合成時用Oligo(dT)20做引物，而用于5’RACE第一條鏈合成時用AP做引物，并且用于5’RACE的模板第一條鏈合成后，產物用E.Z.N.A膠回收試劑盒回收，然后用加尾試劑盒(TaKaRa)加尾。根據測序得到的中間保守片段設計用于擴增3’和5’端的特異性引物并結合所需的接頭引物AUAP和AAP(表1)，用Blend Taq-Plus進行3’RACE和5’RACE的擴增。5’RACE時第一輪以AAP和5’-R1為引物，第二輪以AUAP和5’-R2為引物；3’RACE時第一輪以AUAP和3’-F1為引物，第二輪以AUAP和3’-F2為引物，PCR反應程序為94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環;72 ℃ 10 min;4 ℃保存。PCR產物經回收、連接，克隆測序。

根據地域特點與現有資源，打造品牌概念，為游客提供具有本地特色的獨創性商品服務，提高鄉村的吸引力和影響力，讓身處繁雜都市的游客從自發尋找心靈休憩之所，變成慕名前來游玩度假。此外，還應提升鄉村旅游的文化價值，保護旅游重點區的“鄉村性”，使其免于在城市化進程中丟失自身的民俗文化。

1.2.4 GTHα、FSHβ和LHβ基因的表達特性 每尾魚取14個組織，分別為垂體、下丘腦、腦(不含垂體和下丘腦)、脊髓、鰓、心臟、肝臟、胃、脂肪、肌肉、腎、頭腎、脾臟和性腺(雄性為精巢，雌性為卵巢)。使用Trizol法提取各組織的RNA，每個樣品取1 μg的總RNA用M-MLV逆轉錄酶進行cDNA的第一條鏈合成，用SYBR Green qPCR Mix(TOYOBO，Japan)以不同組織合成的第一條鏈cDNA稀釋10倍后為模板，并以相應基因的定量引物為引物(表1)，β-actin為內參基因，進行實時熒光定量PCR。PCR反應程序為95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s，56 ℃15 s，72 ℃ 30 s，40個循環。根據目的基因和內參基因的Ct值，使用比較Ct法計算目的基因的表達水平。

1.2.5 序列數據分析 把測序得到的序列進行拼接，先用NCBI上ORF finder找到獲得序列的開放閱讀框；然后用SignalP 4.1 Server分析3種不同蛋白的信號肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；使用SMART預測出3種蛋白的結構域(http://smart.embl-heidelberg.de/)；使用Clustal Omega對不同物種的GTHα、FSHβ和LHβ的氨基酸序列作同源性分析(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)；使用NetNGlyc 1.0 Server找出3種蛋白的N-糖基化位點(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)。

2 結果

2.1 GTHα、FSHβ和LHβ基因的克隆及序列比對

根據測序結果拼接后得到撫仙金線鲃GTHα、FSHβ和LHβ 3種基因的cDNA序列，GTHα(KU382238)基因開放閱讀框長度為357 bp，編碼118個氨基酸，其中第1～23位氨基酸為信號肽序列，第33～118位氨基酸為糖蛋白激素α結構域(GHA)；FSHβ(KU382237)基因全長為856 bp，開放閱讀框長度為393 bp，編碼130個氨基酸，第1～19位氨基酸為信號肽序列，第21～128位氨基酸為糖蛋白激素β結構域(GHB)，基因序列的815～820位點(AATAAA)為PolyA加尾信號；LHβ(KU382239)基因全長為930 bp，開放閱讀框長度為441 bp，編碼146個氨基酸，第1～27位氨基酸為信號肽序列，第31～137位氨基酸為糖蛋白激素β結構域(GHB)，基因序列的815～820位點(AATAAA)為PolyA加尾信號。GTHα蛋白中有10個半胱氨酸殘基和2個N-糖基化位點(-NIT-，-NHT-)，FSHβ有11個半胱氨酸殘基和1個N-糖基化位點(-NIS-)，而LHβ有12個半胱氨酸殘基和1個N-糖基化位點(-NET-)。氨基酸序列同源性比對發現，撫仙金線鲃的GTHα與其他魚類的保守性較高，都在80%以上。除了與斑馬魚的同源性在75%左右以外，撫仙金線鲃的FSHβ和LHβ與其他魚類的保守性同樣較高(表2)。

表2 撫仙金線鲃與不同物種GTHα、FSHβ和LHβ 氨基酸 序列同源性比對Table 2 Amino acid sequence alignment of Sinocyclocheilus tingiGTHα， FSHβ and LHβ with other species

2.2 GTHα、FSHβ和LHβ基因的組織表達

實時熒光定量PCR結果顯示，GTHα、FSHβ和LHβ主要在垂體中表達，而GTHα和LHβ在雄魚和雌魚中的其他組織中表達量都非常低(圖1，圖3)。FSHβ在雄魚和雌魚的垂體中表達量最高。FSHβ在雌魚脂肪和肌肉中也有少量的表達；FSHβ不僅在雄魚脂肪和肌肉中有表達，而且在精巢、肝臟等組織中也有少量的表達(圖2)。

圖1 GTHα在撫仙金線鲃組織中的表達特性(平均值±標準誤, n=3)Fig. 1 Tissue expression analysis of Sinocyclocheilus tingi GTHα by real-time PCR (Mean±SE, n=3)

P. 垂體， Hy. 下丘腦， B.腦， SC. 脊髓， HK. 頭腎， K. 腎， H. 心臟， L. 肝臟， SP. 脾臟， ST. 胃， F. 脂肪， Mu. 肌肉， Go. 性腺， Gi. 鰓; 下圖同。

P. pituitary， Hy. hypothalamus， B. brain， SC. spinal cord， HK. head kidney， K. kidney， H. heart， L. liver， SP. spleen， ST. stomach， F. fat， Mu. muscle， Go. gonad， Gi. gill; the same below.

圖2 FSHβ在撫仙金線鲃組織中的表達特性(平均值±標準誤, n=3)Fig. 2 Tissue expression analysis of Sinocyclocheilus tingiFSHβ by real-time PCR (Mean±SE, n=3)

圖3 LHβ在撫仙金線鲃組織中的表達特性(平均值±標準誤, n=3)Fig. 3 Tissue expression analysis of Sinocyclocheilus tingiLHβ by real-time PCR (Mean±SE, n=3)

3 分析與討論

魚類通過促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)調節GTHs的合成與分泌，從而調節下游的性類固醇激素的合成與分泌，參與到下丘腦-垂體-性腺軸的生殖活動，FSH和LH在性成熟、精子發生和卵子發生以及排卵過程中發揮重要的作用。本文克隆得到撫仙金線鲃的GTHα、FSHβ和LHβ基因，經過序列比對發現，撫仙金線鲃GTHα與其他物種的同源性較高，而FSHβ和LHβ與其他物種的同源性較低，但相對而言，LHβ比FSHβ與其他物種的同源性高一些，這與草魚的研究結果相似(Zhouetal.，2010)。撫仙金線鲃GTHα蛋白中有10個半胱氨酸殘基和2個N-糖基化位點，并且在第58～87位氨基酸中有2對相鄰的半胱氨酸和1個N-糖基化位點，這與真鯛Pagrosomusmajor的研究結果相似，推測可能跟受體的結合有關(Genetal.，2000)，在半滑舌鰨Cynoglossussemilaevis的研究中也發現類似的結構(Shietal.，2015)。在撫仙金線鲃的FSHβ和LHβ的蛋白中分別有11個和12個半胱氨酸殘基，這與南方鲇Silurusmeridionalis(Wuetal.，2009)和中華鱘(Caoetal.，2009)相似。

本文克隆了撫仙金線鲃生殖調控中關鍵的3種基因GTHα、FSHβ和LHβ的序列，并對其進行了氨基酸序列分析，同時探索了3種基因在撫仙金線鲃不同組織中的表達特性，這為進一步研究GTHα、FSHβ和LHβ在撫仙金線鲃生殖調控的作用提供了基礎數據。

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Gonadotropin Subunits cDNA Cloning and Tissue Expression inSinocyclocheilustingi

YANGGuokun1，GUANJiajia1，SUNCaiyun1，WANGXiaoai2，PANXiaofu2，YANGJunxing2*，LIWensheng1*

(1.State Key Laboratory of Biocontrol， Institute of Aquatic Economic Animals and Guangdong Province Key Laboratory for Aquatic Economic Animals， Research Institute of Sun Yat-Sen University in Shenzhen， School of Life Sciences，Sun Yat-Sen University， Guangzhou 510275， China; 2. State Key Laboratory of Genetic Resources and Evolution，Kunming Institute of Zoology， Chinese Academy of Sciences， Kunming 650223， China)

Sinocyclocheilustingiis an endemic species of the Fuxian Lake in Yunnan province. Although the artificial breeding has been successfully developed， the natural reproduction ofS.tingiis still failed in pond culture. It is well known that fish reproduction is regulated by the hypothalamus-pituitary-gonadal axis， and the gonadotropins (GTHs) play important role in this process. In this study， the sequences of GTHα， FSHβ and LHβ were obtained from the pituitary ofS.tingiusing real-time quantitative PCR (qPCR) and rapid amplification of cDNA ends technology. The results showed that the open reading frame of GTHα was 357 bp， encoding 118 amino acids， containing 10 cysteine knot motifs and 2 N-linked glycosylation sites. The full length of FSHβ cDNA was 856 bp， with 393 bp open reading frame in length encoding the proteins of 130 amino acids， containing 11 cysteine knot motifs and a N-linked glycosylation site. The full length of LHβ cDNA was 930 bp， with 441 bp open reading frame in length encoding proteins of 146 amino acids， containing 12 cysteine knot motifs and a N-linked glycosylation site. The result of qPCR indicated that GTHα and LHβ were only expressed in the pituitary of both male and female fish. The highest expression level of FSHβ was observed in the pituitary， and the even lower levels were detected in the fat tissue， muscle of male and female fish, and testis and liver of male fish. These findings provided basic data for further research in the reproduction ofS.tingi.

Sinocyclocheilustingi; gonadotropin; clone; tissue distribution

2015-09-08 接受日期：2016-05-11

中山大學高校基本科研業務費項目； 深圳市戰略性新興產業發展專項資金項目(NYSW20140401010064)； 云南省應用基礎研究面上項目(2012FB183)； 中國科學院昆明動物研究所“一三五”重大專項(Y206B51181)； 云南省生物多樣性保護專項資金項目

楊國坤(1988—)， 男， 博士研究生， 研究方向：魚類內分泌功能基因, E-mail:ygk5210207@126.com

*通信作者Corresponding author， E-mail:yangjx@mail.kiz.ac.cn; lsslws@mail.sysu.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20150271

Q959.4; Q78

A

1000-7083(2016)05-0686-05