植物寄生線蟲乙酰膽堿酯酶結構與功能研究進展

吳青松,　彭德良,　黃文坤

(中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京　100193)

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植物寄生線蟲乙酰膽堿酯酶結構與功能研究進展

吳青松,彭德良,黃文坤*

(中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京100193)

乙酰膽堿酯酶通過水解神經遞質乙酰膽堿使得神經信號能夠在生物體內進行正常的傳遞,從而有效調節正常的肌肉活動,在生物體神經傳導的過程中發揮著重要作用。植物寄生線蟲乙酰膽堿酯酶具有由多種基因編碼的不同分子型,在線蟲化感、運動、取食、抗藥性等多個方面承擔著不同的功能。本文簡要綜述了植物寄生線蟲乙酰膽堿酯酶分子型、基因結構、基因功能、組織表達及其在線蟲抗藥性中的作用等方面的研究進展。

植物寄生線蟲;乙酰膽堿酯酶;分子型;基因功能;抗藥性

植物寄生線蟲發生與分布廣泛,是侵染植物的主要病原之一,近年來在農業生產上所造成的損失越來越嚴重,全世界每年因植物寄生線蟲造成的農業損失就達到了157億美元[1]。植物內寄生線蟲侵入植物根系、建立取食位點等整個危害過程都是由神經元支配的肌肉運動[2],乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE, EC 3.1.1.7)在這一過程中發揮了重要作用。植物寄生線蟲AChE通過水解神經遞質乙酰膽堿(ACh)來終止神經沖動的傳遞,調節正常的肌肉活動。對于植物寄生線蟲的防治,目前多采用有機磷類和氨基甲酸酯類等非熏蒸性殺蟲劑,其殺線蟲機理便是作用于線蟲的AChE,通過與AChE活性位點的絲氨酸殘基形成共價鍵而使得AChE不能夠分解乙酰膽堿[34],線蟲長時間處于神經興奮狀態,最終造成線蟲肌肉麻痹、行動異常,難以取食寄生而死亡[5]。AChE的研究對于更好地防治植物寄生線蟲病有著重要的作用。

1　植物寄生線蟲AChE的分子型

動物中存在多種形態的AChE分子,僅含有ace單基因的物種中會通過mRNA 的可變性剪接或者是酶蛋白的不同修飾來產生不同分子型[68],以此來行使不同的功能。而線蟲的AChE是由多種ace基因編碼的,分別對應不同的酶分子型[9]。研究者首先在模式線蟲秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中鑒定到6種可分離的AChE分子形式,運用動力學分析和突變體等遺傳學研究方法推出編碼秀麗隱桿線蟲AChE的有4種基因Ce-ace-1、Ce-ace-2、Ce-ace-3和Ce-ace-4[5,10]。隨后對4種ace基因在染色體上的定位、表達量及各自的功能也進行了研究。根據AChE的生化特性劃分,包括對底物的親和性、對抑制劑的敏感性和熱穩定性等,秀麗隱桿線蟲4種ace基因分別編碼4種不同的AChE動力學類型(AChE-1即A型、AChE-2即B型、AChE-3即C型、AChE-4即D型)[10]。在植物寄生線蟲中,南方根結線蟲(Meloidogyneincognita)、花生根結線蟲(M.arenaria)、大豆孢囊線蟲(Heteroderaglycines)等AChE分子型是較早被確定的。南方根結線蟲和花生根結線蟲AChE分子類型相似,都含有5種酶分子,分為A、B、C 3種類型,且發現C型AChE對天然底物乙酰膽堿有很高的親和性,且對有機磷類和氨基甲酸酯類等AChE抑制劑不敏感[11],這與秀麗隱桿線蟲C型AChE對乙酰膽堿的親和性比A型和B型高近千倍的結論相一致[10]。大豆孢囊線蟲存在3種不同的AChE分子,歸屬于A型和C型,B型AChE的缺失或許與行為學有著密切的聯系。生物測定表明,與根結線蟲屬(Meloidogynespp.)相比,大豆孢囊線蟲對有機磷類和氨基甲酸酯類等AChE抑制劑更不敏感,可能是大豆孢囊線蟲中C型AChE占有更大比例的原因[12],這還有待于進一步的研究。AChE被抑制的線蟲會出現麻痹、行動異常等癥狀,但也有可能恢復其正常表型。有研究表明恢復后的線蟲盡管其表型正常,但仍有90%的AChE活性被抑制[13],這或許與不同類型AChE的相對敏感性及其被抑制后的失活與復活率有關系。植物寄生線蟲對有機磷類和氨基甲酸酯類殺線蟲劑的反應,與AChE不同分子類型的相對豐度和分布有關[12],所以對不同類型的AChE研究尤為重要。

2　植物寄生線蟲AChE蛋白及ace基因結構分析

AChE為絲氨酸水解酶族的糖蛋白,其分子結構包括球型和尾型兩種。球型又分為單體(G1, AChES)、二聚體(G2)和四聚體(G4);根據其溶解性,AChE還可分為兩親分子(疏水型)和非兩親分子(親水型),而這很大程度上取決于羧基端的性質。二聚體可因其羧基端插入了糖基磷脂酰肌醇(GPI)而共價結合于細胞表面,使之可溶解于離子型去垢劑中[4],成為疏水性的球型二聚體(AChEH)。四聚體(G4)具有一個高度保守的含有色氨酸的兩親性羧基端,既可以維持其四聚體形式,又可以與非催化結構蛋白相連。在脊椎動物中,四聚體AChE C-端含有色氨酸兩親四聚體化(WAT)區域,與膠原尾(ColQ)中的脯氨酸結合區(PRADs)相連,使其穩定錨定于細胞基底層,同時與富脯氨酸膜錨點(proline-rich membrane anchor, PRiMA)相連,用于AChE的細胞內修飾和錨定于神經質膜[14]。而對多數植物寄生線蟲AChE的分子結構分析表明,A型和B型沒有膠原尾(ColQ)結構,而是由親水或非親水的球形單體、二聚體和四聚體所構成的不同AChE分子型[6],但都有著相似的C-端氨基酸序列,表明其用類似于脊椎動物AChE的方式固定于膜上[15]。除了結合于膜上的AChE,許多寄生線蟲通過黏膜表面分泌AChE到外部環境中[16],目前已經從多種動物寄生線蟲如腸線蟲巴西日圓線蟲(Nippostrongylusbrasiliensis)和肺線蟲胎生網尾線蟲(Dictyocaulusviviparous)中鑒定到分泌性的AChE,這些親水性的酶由基因組所編碼,所以一些寄生線蟲或許有更多的ace基因[9],分泌性AChE與神經元突觸間的AChE有著明顯不同,通常是由專門的頭感器和腺體所合成與分泌的[17],其功能或許與改變寄主腸胃道的生理反應以促進寄生存活有關系[9]。有報道發現寄生于大西洋鯡(Clupeaharengus)的簡單異尖線蟲(Anisakissimplex)幼體軀體和分泌器官中分泌的AChE活性顯著高于寄主AChE活性,通過過量分泌AChE來達到適應不利環境的目的[18]。在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)的研究中,錨定于膜上的具有高催化活性的二聚體AChE主要在中樞神經系統(CNS)中表達,表明其參與突觸間的信號傳遞,而通過可變性剪接產生的可溶性的單體AChE更多的是在非神經組織中表達,但在CNS中的表達可被誘導,藥物脅迫作用下CNS中可產生可溶性的單體AChE,具有化學防御功能[19]。

研究認為,秀麗隱桿線蟲ace基因的Ce-ace-1與編碼人類以及電鰩的AChE基因具有42%的同源性[20],位于X染色體上,Ce-ace-2位于染色體Ⅰ上,Ce-ace-3和Ce-ace-4串聯存在于染色體Ⅱ上,相距很近,通常是一同被轉錄,但Ce-ace-4的mRNA含量遠比其他三者要低。秀麗隱桿線蟲AChE-1與AChE-2序列有35%的一致性,AChE-1是兩親性的四聚體,連接一個疏水性的非催化亞基,AChE-2和AChE-3都含有糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定位點,為結合GPI的兩親分子二聚體[9]。AChE-1和AChE-2占秀麗隱桿線蟲 AChE活性的95%,AChE-3貢獻了5%的AChE活性,AChE-4 與 AChE-3氨基酸序列有54%的一致性,AChE-4占AChE的活性少于0.1%,被認為是無功能的[10]。

早期對于AChE的研究都是運用生化和藥理性質來進行分子型的劃分和功能研究,1998年秀麗隱桿線蟲全基因組測序是生物學的一個里程碑,測序技術發展后,通過測序,完整的編碼AChE的基因被確定,從而使得運用反向遺傳學的方法來深入研究基因功能成為重要且有效的方法。在植物寄生線蟲中,對AChE基因的克隆和功能研究已廣泛開展,已陸續克隆到南方根結線蟲AChE基因Mi-ace-1和Mi-ace-2,爪哇根結線蟲(M.javanica)AChE基因Mj-ace,馬鈴薯白線蟲(Globoderapallida)與大豆孢囊線蟲B型AChE基因Gp-ace-2和Hg-ace-2,甘薯莖線蟲(Ditylenchusdestructor)的3個基因Dd-ace-1、Dd-ace-2和Dd-ace-3,以及松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)的Bx-ace-1、Bx-ace-2和Bx-ace-3[6,2127]。Mi-ace-1和Mj-ace基因核苷酸水平上相似性達到97%,都編碼656個氨基酸,蛋白相似性達到98.8%,含有維持AChE活性所必需的功能位點的保守區域[21]。Mi-ace-2 cDNA攜帶一個反式剪接SL1前導序列,預測蛋白序列和Mi-ace-1蛋白有32.3%的相似性,與Ce-ace-2蛋白有49.1%的相似性,存在催化三聯體、膽堿結合位點、催化峽谷芳香族氨基酸殘基等保守序列[22]。利用RT-PCR和RACE技術克隆的Dd-ace-1、Dd-ace-2和Dd-ace-3基因5′端均存在反式剪接引導序列SLI,分別編碼635、734和 611個氨基酸,都具有AChE特征,其中Dd-ACE-1與 Dd-ACE-3可能存在信號肽序列[6]。Bx-ace-2編碼蛋白序列與秀麗隱桿線蟲、南方根結線蟲、胎生網尾線蟲、大豆孢囊線蟲、馬鈴薯白線蟲、甘薯莖線蟲AChE-2型AChE蛋白序列均具有高度的相似性,Southern雜交試驗表明Bx-ace-2基因含有反式剪接引導序列SL1,在松材線蟲基因組中以單拷貝存在[25],信號肽預測顯示Bx-ACE-2含有信號肽,而Dd-ACE-2不存在信號肽,此現象對于兩者在線蟲體內的表達定位和功能差異是否有影響仍需進一步研究[23,25]。Kang等對松材線蟲的3個AChE基因進行研究,Bx-ACE-1 和 Bx-ACE-2是疏水性的,錨定于膜上,而Bx-ACE-3是在松材線蟲一些特殊組織中檢測到的,為沒有糖基磷脂酰肌醇錨定位點或者H型疏水性序列的可溶性蛋白,分泌在細胞膜間隙或者是血腔中[2627],而在秀麗隱桿線蟲以及南方根結線蟲、花生根結線蟲和大豆孢囊線蟲等植物寄生線蟲中鑒定到的AChE都為胞膜蛋白[10,12]。

3　植物寄生線蟲AChE的組織表達及功能研究

植物寄生線蟲AChE的組織表達及功能研究已廣泛開展,運用秀麗隱桿線蟲作為異源表達系統進行馬鈴薯白線蟲AChE功能鑒定時發現,Gp-ace-1和Gp-ace-2都參與線蟲運動,且功能有一定程度的重疊,Gp-ace-1主要在肌肉細胞中表達,而Gp-ace-2主要在頭神經節神經元細胞中表達,主要參與信號的感知和集成,此研究與秀麗隱桿線蟲以及根結線蟲屬的研究結果相一致[2122,35]。發育表達分析表明Gp-ace-2基因在J2期表達量最高,原因可能是此階段要通過化學感覺神經元和機械感覺神經元來感知環境信號;在寄生早期和年輕雌蟲中表達量最低,是因為在這個固定性生活階段,感覺和運動活動都減少了;在成熟的孕期雌蟲中表達量也比較高,與卵期的表達水平相當,可能是因為其體內的一些卵已經含有部分2齡幼蟲;成熟的雄蟲在找尋雌蟲受精的過程中需要運動,其表達量也比寄生階段要高。此外,Gp-ace-2基因可以恢復Ce-ace-1和Ce-ace-2雙突變體引起的運動不協調表型[29]。線蟲AChE單基因突變但余下基因的補償作用在一定程度上也說明了不同AChE功能上的相似或重疊性[9],而不同ace基因在神經和肌肉等的不同組織表達位置又表明其功能的特異性[28],所以各基因的具體功能還有待于進一步的研究。對南方根結線蟲的發育表達分析表明,Mi-ace-1和Mj-ace在卵、寄生前2齡幼蟲、雄蟲中都有表達,用硫代乙酰膽堿(ATCh)作為底物進行南方根結線蟲 AChE活性檢測,結果表明在寄生前2齡幼蟲和雄蟲的頭感器中活性強烈,但是在雌成蟲中卻未檢測到有活性[21]。

Ce-ace-3mRNA含量豐富,但AChE-3僅占AChE活性的5%,且對于底物乙酰膽堿有著很低的Km值,所以AChE-3可能具有比較低的催化效率[10],對于部分AChE抑制劑如毒扁豆堿等不敏感,被認為與抗性有關,可能具有非經典的突觸功能[9],Chang等對根結線蟲屬C型AChE的研究也得到一致的結論[11]。研究表明Ce-ace-3在咽部肌肉細胞、頭部神經元、肛門神經節和中腔中均有表達[9],若根結線蟲屬C型AChE主要在咽部肌肉表達,則已經建立了取食位點的固著性的成蟲仍然能夠取食,在殺線蟲劑藥物的存在下仍能存活[11, 30]。Kang等對松材線蟲AChE進行了研究,實時定量PCR的轉錄譜表明Bx-ace-3轉錄效率在繁殖和傳播階段最高,是Bx-ace-1的2～3倍,是Bx-ace-2 的9～18倍,免疫組織化學法揭示了Bx-ACE-1和 Bx-ACE-2分布在神經組織中,而Bx-ACE-3存在于細胞膜間隙或血腔等特殊組織中。Bx-ACEs體外表達的動力學分析認為Bx-ACE-1有很強的底物特異性,Bx-ACE-2有很高的催化效率,Bx-ACE-3對抑制劑不敏感,且推測Bx-ACE-1和Bx-ACE-2在突觸間傳遞過程中發揮著共同的但并非重疊的作用,而Bx-ACE-3具有抵御化學藥害的非神經元功能[26,31]。三者都存在時,Bx-ACE-3明顯降低了AChE抑制劑對Bx-ACE-1 和 Bx-ACE-2的抑制作用。通過RNA干擾使得Bx-ACE-3下調后,一些殺線蟲劑化合物對松材線蟲的毒性顯著提高。對意大利蜜蜂(Apismellifera)AChE 的研究得出了類似的結論,Am-ACE-2錨定于細胞質膜上,催化活性高,在突觸間發揮作用,而Am-ACE-1是以可溶性的形式存在,對抑制劑不敏感,起到隔絕外源性物質的作用[3,32]。Bx-ACE-3的功能類似于脊椎動物丁酰膽堿酯酶(butyrylcholinesterase, BuChE, EC 3.1.1.8),在脊椎動物中已經證明了BuChE作為生物清除劑這一功能,它能夠在神經藥劑到達作用位點前進行攔截,削弱其致死效應[3334]。所以Bx-ACE-3被認為是一種隔離蛋白,通過非特異性地結合有毒的外源性物質,來保護神經系統免受損害,而在突觸傳遞中發揮很小的作用。研究還得出Bx-ACE-3與內源的松樹樹脂萜烯相互作用,松材線蟲可能已經進化出了基于Bx-ACE-3的抵抗anti-AChE萜烯化合物的化學防御系統[27],類似的研究還包括植物精油中的植物化學物質對于松材線蟲和簡單異尖線蟲有防治效果是因為抑制了AChE活性[3536],植物中的天然毒物對于松材線蟲病的防治具有很好的效果[37]。Bx-ACE-3作為化學防御外源性物質的生物清除劑這一角色為AChE功能的多樣性提供了一個重要的見解[27]。

4　研究展望

有機磷類和氨基甲酸酯類等非熏蒸性殺蟲劑作用于AChE,這些藥劑的廣泛濫用會造成一些昆蟲、線蟲對其產生抗藥性。在馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)、棉蚜(Aphisgossypii)、小菜蛾(Plutellaxylostella)、二化螟(Chilosuppressalis)等多種昆蟲中發現了抗藥性[3839]。對寄生于羊、馬、牛等動物上的寄生線蟲的研究發現,羊的捻轉血矛線蟲(Haemonchuscontortus)等多種動物胃腸道寄生線蟲對藥劑產生了抗藥性[40]。丁中發現不同地理種群的甘薯莖線蟲對滅線磷的敏感性存在差異,抗性種群抗藥性水平是敏感種群的2～4倍,AChE對殺線蟲劑的反應與AChE各類型的分布和相對含量相關,不同AChE類型量的變化會引起抗性[6]。張博的研究表明有機磷和氨基甲酸酯類等非熏蒸性殺蟲劑只是起到麻痹線蟲的作用,蟲體還有復蘇的可能,這會誘使線蟲產生抗藥性[41]。植物寄生線蟲抗藥性產生的原因在廣度和深度上還需要進一步研究,這將對于延緩線蟲抗藥性的產生、制定合理的線蟲綜合防治策略、保障農業生產安全具有重要作用。

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(責任編輯：田喆)

Research progress on structure and function of acetylcholinesterase in plant parasitic nematodes

Wu Qingsong,Peng Deliang,Huang Wenkun

(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing100193, China)

The acetylcholinesterase hydrolyzes the concerned neurotransmitter acetylcholine to ensure the normal delivery of nerve signals in the organism and regulates the normal muscle activity, which plays an important role in the process of biological nerve conduction. Acetylcholinesterases of plant parasitic nematodes exist in diverse molecular forms,which are encoded by different genes. Those forms undertake different functions such as chemoreceptivity, movement, feeding, and resistance of nematicides. This review gives a brief introduction on the advance of molecular forms, structure, function, histochemical expression and nematicidal resistance of acetylcholinesterase in plant parasitic nematodes.

plant parasitic nematodes;acetylcholinesterase;molecular form;gene function;nematicidal resistance

20150428

20150720

國家自然科學基金 (31272022);公益性行業(農業)科研專項(201103018);國家科技支撐計劃(2012BAD19B06)

E-mail:wkhuang2002@163.com

S 432.45

A

10.3969/j.issn.05291542.2016.03.003