Illumina Miseq平臺深度測定酸奶中微生物多樣性

智楠楠,宗 凱,楊捷琳,姚 劍,*,魏兆軍

(1.安徽出入境檢驗檢疫局技術中心,安徽合肥 230032;2.上海出入境檢驗檢疫局,上海 200135;3.合肥工業大學食品科學與工程學院,安徽合肥 230009)

Illumina Miseq平臺深度測定酸奶中微生物多樣性

智楠楠1,3,宗 凱1,楊捷琳2,姚 劍1,*,魏兆軍3,*

(1.安徽出入境檢驗檢疫局技術中心,安徽合肥 230032;2.上海出入境檢驗檢疫局,上海 200135;3.合肥工業大學食品科學與工程學院,安徽合肥 230009)

目的:建立Illumina Miseq深度測序篩查酸奶中微生物的方法,分析酸奶中微生物的多樣性。方法:以9種酸奶樣品為研究對象,提取酸奶中細菌基因組DNA,應用高通量測序技術測定細菌的 16s rDNA v1-v3 變異區序列,得到9種樣品中微生物群體分布和豐度、以及不同樣品間的菌種差異與進化關系。結果:酸奶中微生物主要為厚壁菌門(Firmicutes),占據99.6%之高,其中厚壁菌門主要以鏈球菌屬(Streptococcus、87.1%)、乳桿菌屬(Lactobacillus、10.3%)、乳球菌屬(Lactococcus、0.3%)組成,9種酸奶中有3種同時含有鏈球菌屬和乳桿菌屬,其余6種樣品中鏈球菌屬幾乎占據全部(>97%)。結論:Illumina Miseq 深度測序技術可快速精確深入掌握酸奶中微生物多樣性,結果對比顯示不同酸奶菌種同質化程度高,其中鏈球菌屬占絕對優勢,同時發現部分酸奶標簽標示不符。

Illumina Miseq,酸奶,微生物,多樣性

乳酸菌(lactic acid becteria)是一類能在可利用的碳水化合物發酵過程中產生大量乳酸的細菌的總稱[1]。乳酸菌添加到牛奶或羊奶中可發酵制得酸奶,具有改善腹瀉、改善人體腸道菌群平衡、提高營養物質生物利用度、增強機體免疫和抗癌的獨特功能[2-6]。但調查發現目前市場上銷售的眾多酸奶中,在乳酸菌的標示上問題較多[7],存在食品安全隱患,故對此類產品進行菌群鑒別尤為重要。

表1 樣品及產地

鑒別酸奶乳酸菌的傳統方法是梯度稀釋平板培養,觀察菌落形態、革蘭氏染色、KOH實驗、過氧化氫酶實驗,測定氣體的形成等理化方法[8],但由于微生物的多樣性和復雜性,且有些具有不可培養性或培養后難以鑒別,故傳統方法無法準確真實的捕捉微生物群落多樣性[9]。近年來隨著深度測序技術的發展,可從分子生物學角度出發來研究食品中的微生物群落組成,直接從樣品中提取全基因組用于Illumina Miseq 高通量深度測序,可以有效克服傳統方法中出現的問題[10-12]。

Illumina Miseq高通量深度測序技術在國外已廣泛應用于農業、林業、牧業、礦井、醫學、微生物等諸多領域,其中在醫學微生物方面主要用于對一些基質復雜的樣本如人體腸道,皮膚表層等進行菌群多樣性分析,以協助判斷治療由于菌群失調引起的某些疾病,取得顯著成果[13-14]。隨著此技術的推廣,近年來國內出現利用此技術針對土壤、含菌空氣、植物果實、動物糞便等進行菌群鑒別[15-19],獲得不同環境下相應微生物的種群分布情況,測序結果精確可靠。本研究將Illumina Miseq高通量測序技術應用于含菌食品中的微生物鑒別,旨在通過分析細菌16S rDNA的可變區序列獲得9種酸奶中微生物組成,初步探討目前市售酸奶中微生物多樣性及分布情況,為消費者在選購酸奶方面提供理論依據及為生產廠家研制新型發酵酸奶提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

常見的9種酸奶 采購市場,見表1;溶菌酶 上海勵瑞生物科技有限公司;蛋白酶k 上海勵瑞生物科技有限公司;TE緩沖液 北京索萊寶科技有限公司;緩沖液GA 天根生化科技(北京)有限公司。

PTC-200PCR儀 美國BIO-RAD公司;Stratos冷凍高速離心機、ULT-1786-6V超低溫冰箱 美國賽默飛世爾科技公司;Illumina Miseq測序儀 美國Illumina公司;細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型) 天根生化科技(北京)有限公司;Simplicity超純水儀 德國Merck Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品基因組DNA提取 取20 mL酸奶4000 r/min離心5 min,取全部上清12000 r/min離心10 min使菌體完全沉淀,向沉淀中加入200 μL緩沖液GA,振蕩至菌體徹底懸浮,加入溶菌酶37 ℃處理40 min,之后按提取試劑盒步驟操作進行基因組DNA提取。

1.2.2 PCR擴增 針對細菌16s rDNA v1-v3區,選用特異性引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和534R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)進行擴增。 PCR條件是分別保持50 ℃ 2 min、95 ℃ 3 min,然后執行95 ℃ 20 S、58 ℃ 30 S、72 ℃ 2 min共30個循環,最后 4 ℃條件下保存。

1.2.3 Illuminna Miseq測序 將上述九種樣品的PCR產物送去上海昂樸生物科技有限公司進行高通量測序。

2 結果分析

2.1 測序信息

本實驗共測序樣品9個,每個樣本獲得的原始測序reads數目(raw-Reads)和去除嵌合體后每個樣本獲得的測序reads(clean-Reads)數目見表2。

表2 樣本reads分布統計

2.2 稀釋曲線

采用對測序序列進行隨機抽樣的方法,以抽到的序列數與它們所能代表OTU的數目構建曲線,即稀釋性曲線。當曲線趨于平坦時,說明測序數據量合理,此時再測更多的數據量對發現新OTU的邊際貢獻很小;反之則表明繼續測序還可能產生較多新的OTU。因此,通過作稀釋性曲線,可以得出樣品的測序深度情況。由圖1可知多數樣本在序列數在接近40000時,observed_species/OTU已經接近飽和,說明再增加測序量對于發現新species/OTU的邊際貢獻很小。

圖1 樣品稀釋性曲線Fig.1 rarefaction curve analysis of nine samples注:橫坐標為用于取樣的序列數目,縱坐標為觀測到的speceis/OTU。

2.3 alpha多樣性指數統計

可通過多項指數來評價樣品中微生物分布的alpha多樣性。其中衡量菌群豐度(Community rich-ness)的指數有:菌種豐富度指數(chao1)和觀測到的物種數(observed_species),其中chao1用來估計群落中的OTU數目。衡量菌群多樣性(Community diversity)的指數有香農指數(shannon)和辛普森指數(simpson),其中香農指數用于衡量群落的異質性,辛普森指數代表隨機取樣的兩個體屬于不同種的概率,其值越大,代表樣品物種分布越均勻。由表3以四個衡量指數詳細列出了不同樣品中微生物的豐富度和多樣性分布情況,由香濃指數和辛普森指數可以看出 9號樣品物種豐富度最高且物種分布最均勻。

表3 alpha多樣性指數統計

表4 目層面上各樣品含菌百分比(%)

表5 屬層面上各樣品含菌百分比(%)

2.4 酸奶中微生物分布比較

所測序列片段通過物種注釋共可分為7門13綱21目62科104屬。在不同分類水平上相對豐度低于0.1%的合并為other。從門的分類水平來看主要為厚壁菌門(Firmicutes、99.6%),從綱的分類水平來看主要為芽孢桿菌綱(Bacill、99.3%)。從目的分類水平來看主要包括乳桿菌目(Lactobacillales、98.7%)、芽孢桿菌目(Bacillales、0.6%)、梭菌目(Clostridiales、0.2%)(表4)。由以上三個分類水平和alpha多樣性指數統計綜合分析可以看出市場上絕大多數酸奶中所含微生物基本都屬于厚壁門芽孢桿菌綱乳桿菌目,不同樣品間雖然物種均勻度相差較大,但相似度很高。

從屬的分類水平來看主要包括鏈球菌屬(Streptococcus、87.1%)、乳桿菌屬(Lactobacillus、10.3%)、乳酸乳球菌屬(Lactococcus、0.3%)、厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus、0.3%)(表5)。

另由表6可以看出,鏈球菌屬(Streptococcus)在每個樣品中都占絕對菌群優勢,乳桿菌屬(Lactobacillus)除在7號、8號、9號樣品中分別占15.8%、33.0%、38.8%外,在其余六種樣品中含量極低。對于同一生產廠家的兩種不同產品3號和6號,所含菌種分布情況極為相似。另外與標示菌種對比可以看出,部分產品標有雙歧桿菌但未檢出,部分產品檢出未標示的菌種,由此看出酸奶產品在標簽問題上存在不規范現象。

表6 九種樣品中標示菌種與檢測結果比較

2.5 物種分類學系統組成樹和豐度分布曲線分析

本實驗在前述分類學分析中,已經得到了每個OTU的豐度和對應的分類學信息,然后將測序得到的物種豐度信息回歸至數據庫的分類學系統關系樹中,可以從整個分類系統上全面了解九種樣品中所有微生物的進化關系和豐度差異,如圖2所示分支為最為優勢的為硬壁菌門(Firmicutes)分支中的鏈球菌屬(Streptococcus),圖中色柱的高低代表該樣品在該處豐度的高低。同時由豐度分布曲線(圖3)可以看出樣品9物種的組成最豐富且均勻程度最高。

圖2 各樣品物種分類學系統組成樹Fig.2 The taxonomic system Composition tree of each sample

圖3 豐度分布曲線Fig.3 Rank-Abundance curve

3 討論

Illumina Miseq測序技術針對細菌16S rDNA可變區進行擴增測序并對原始數據進行質量控制,生成操作分類單元OTU,然后對微生物進行分類學分析以掌握其多樣性及分布情況,使人們對復雜環境中微生物的認識由物種水平上升到基因層面,這一技術的出現解決了大多數微生物的不可培養性和基因組的多樣性問題,受到很多研究者青睞[20]。

同類研究中,焦晶凱等[19]測定干酪中最為優勢的菌群為硬壁菌門(Firmicutes),這與本研究結果一致,楊捷琳等[7]調查發現益生菌制品中存在標簽不符的問題,R Temmerman等[21]發現調查時發現40%的乳制品標簽出現錯誤,更值得注意的是國外一些調查研究表明,即使是從制造商處直接獲得的商業菌株,部分也會出現實際含菌種類與標識不符的問題[22]。可見多數調查都顯示益生菌食品在標簽上存在問題,因為國內相關產品眾多,新產品又層出不窮,甚至益生菌在醫藥和動物飼料行業也已廣泛應用,故為保證食品藥品的安全性,未來全面對益生菌產品中所含微生物展開全面深度調查尤為重要。

4 結論

本實驗利用Illumina Miseq平臺對九個酸奶樣品進行基因組測序,共得到微生物有效序列582573條,通過物種注釋得到7門13綱21目62科104屬,揭示了常見市售酸奶中微生物的群落結構、豐度差異和進化關系。針對不同酸奶所含菌種相似度非常高而標簽顯示菌種各有不同的問題,也可能是添加的其它菌種在酸奶發酵、儲藏過程中由于環境相對苛刻不易存活,針對這一問題未來應在生產時多注重溫度控制或添加一些利于乳酸菌生長的物質,以保證乳酸菌的活性及多樣化。與此同時,新型發酵菌劑的研究也至關重要。

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Microbial diversity of yogurt depth detected by Illumina Miseq platform

ZHI Nan-nan1,3,ZONG Kai1,YANG Jie-lin2,YAO Jian1,*,WEI Zhao-jun3,*

(1.Technology center of Anhui Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Hefei 230032,China; 2.Shanghai Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shanghai 200135,China; 3.School of food science and Engineering,HeFei University of Technology,Hefei 230009,China)

Establishing a method based on Illumina Miseq deep sequencing to analyze the microbial diversity of yogurt. Took 9 kinds of yogurt samples as the research objects and extracted the whole genome of bacteria of yogurt. The V1-V3 variation region of 16S rDNA were detected by High throughput sequencing technology to obtain the distribution and abundance of microbial community in 9 samples as well as the species difference and evolution relationship of bacteria among these samples. The results showed that the main microbes of the yogurt were Firmicutes(99.6%)which mainly composed by Streptococcus(87.1%),Lactobacillus(10.3%),and Lactococcus(0.3%).There were 3 kinds of yogurt containing Streptococcus and Lactobacillus with a high number,Streptococcus(97%)accounted for almost all in the other six samples.Using Illumina Miseq deep sequencing technology can master the microbial diversity of yogurt quickly and accurately. The results showed that the bacteria of yogurt were highly similar and streptococcus took a dominant position. At the same time,it was found that some yogurt labels didn’t match the analysis results well.

Illumina Miseq;yogurt;microorganism;diversity

2016-05-09

智楠楠(1993-)，女，碩士，研究方向：食品微生物，E-mail：zhinannan74@163.com。

*通訊作者:姚劍(1971-)，女，博士，研究方向：食品微生物，E-mail：msyao@126.com。 魏兆軍(1970-)，男，教授，博士生導師，研究方向：食品加工技術，E-mail：weizhaojun@163.com。

長三角地區功能性微生態制劑關鍵檢測技術及溯源體系的開發應用(1503062007);長三角地區微生態制劑關鍵檢測技術及溯源體系的開發應用(14495810200)。

TS252.4

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000