苦丁茶和小飛揚草對多重耐藥性大腸桿菌外排泵acrA基因表達的影響▲

劉坤友 周 艷 陳桂生 劉鳳玲 李 明

(1 廣西柳江縣人民醫院檢驗科，柳江縣 545100，E-mail：Ljrylky@163.com；2 廣西壯族自治區疾病預防控制中心，南寧市 530028)

苦丁茶和小飛揚草對多重耐藥性大腸桿菌外排泵acrA基因表達的影響▲

劉坤友1周 艷2陳桂生1劉鳳玲1李 明1

(1 廣西柳江縣人民醫院檢驗科，柳江縣 545100，E-mail：Ljrylky@163.com；2 廣西壯族自治區疾病預防控制中心，南寧市 530028)

目的 探討苦丁茶、小飛揚草水提物對多重耐藥性大腸桿菌外排泵acrA基因表達的影響。方法 用紙片擴散法篩選多重耐藥性大腸桿菌，試管二倍稀釋法檢測苦丁茶、小飛揚草水提物和阿莫西林對多重耐藥菌株的最低抑菌濃度(MIC)，用1/2 MIC濃度的苦丁茶、小飛揚草水提物干預多重耐藥菌株，72 h后檢測阿莫西林的MIC；選取苦丁茶和小飛揚草干預前后的耐藥菌株進行熒光實時定量PCR檢測外排泵基因acrA mRNA的表達。結果 篩選出3株多重耐藥性大腸桿菌，苦丁茶或小飛揚草干預后阿莫西林對多重耐藥株的MIC明顯低于干預前(P<0.05)；苦丁茶或小飛揚草干預后acrA mRNA的表達量均較干預前明顯降低(P<0.05)。結論 苦丁茶和小飛揚草對多重耐藥性大腸桿菌有明顯抑制作用，其機制可能是與通過降低多重耐藥性大腸桿菌外排泵acrA基因mRNA的表達量有關。

大腸桿菌；多重耐藥；苦丁茶；小飛揚草；外排泵；acrA基因

大腸桿菌廣泛分布于自然界，其大部分血清型是腸道正常菌群，但一些特殊血清型的大腸桿菌對人和動物有致病性，常引起嬰兒和幼畜(禽)嚴重腹瀉和敗血癥。近年來，由于抗生素的不合理使用，大腸桿菌對抗生素耐藥的問題越來越突出，多重耐藥率越來越高，這降低治療效果，增加治療成本，已成為全球的公共衛生問題之一。致病性大腸桿菌感染在社區及醫院中多為散發病例，治療較為困難，如有交叉感染可造成暴發流行，對嬰幼兒、免疫缺陷者和老年人造成嚴重威脅[1]。因此，大腸桿菌的多重耐藥機制已成為一個研究熱點。細菌外排泵在多重耐藥中起重要作用。本研究旨在探討苦丁茶、小飛揚草對多重耐藥大腸桿菌株外排泵基因的作用，從而為逆轉耐藥、降低多重耐藥率提供參考。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源及實驗材料 2014年1月至2015年5月廣西柳江縣人民醫院、柳州市疾病預防控制中心門診部初診、未使用抗生素治療的腹瀉、腹痛患者385例，收集其糞便，按常規分離、培養大腸植菌，經生物梅里埃公司-梅里埃中國VITEK AMS 60系統鑒定為大腸埃希菌。本實驗所用的氧氟沙星、紅霉素、四環素、青霉素、阿莫西林的標準藥敏紙片均由杭州天和微生物試劑有限公司提供。苦丁茶和小飛揚草、阿莫西林分散片(規格0.25 g/片，批號20130171)購自石藥集團中諾藥業有限公司。以大腸埃希菌標準菌株ATCC25922作質量控制菌株，由廣東省微生物種質資源庫提供。Trizol試劑盒購自上海Invitrogen公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和DNase I購自Fermentas公司；2×SYBR Green qPCR Mix購自北京莊盟有限公司。PCR上游引物為5′-GTTCGTCCTCAAGTTAGCG-3′，下游引物為5′-GTCACCAGCCACTTATCG-3′；內參上游引物為5′-ATCAACGACCTGTTAGACG-3′，下游引物為5′-ACAGACCAGTTGCTTCAG-3′，由上海生物工程技術服務公司合成。

1.2 多重耐藥株的篩選 (1)稱取Mueller-Hinton(M-H)瓊脂38 g、蒸餾水1 L，高壓滅菌后按25 ml/平皿(直徑約9 mm)進行分裝。(2)菌種孵育16～24 h后，分別接種于生理鹽水試管中，校正濃度至0.5麥氏標準(相當于1.0×108CFU/ml)。(3)用無菌棉簽蘸取菌液，在試管內壁旋轉擠去多余菌液，然后在M-H瓊脂表面均勻涂布3次接種，每次旋轉平板60°，最后沿平板內緣涂抹1圈。(4)將M-H瓊脂平板在室溫下干燥3～5 min，再用無菌鑷子將藥物紙片緊貼于瓊脂表面，置于35℃恒溫箱內孵育16～18 h，觀察并記錄抑菌圈的直徑。(5)藥敏試驗用紙片擴散法，按照美國臨床實驗室標準委員會制訂的操作步驟[2]，重復操作3次，取3次的平均值為該藥敏紙片的抑菌直徑，青霉素、紅霉素藥敏紙片抑菌直徑<13 mm為耐藥，氧氟沙星、四環素藥敏紙片抑菌直徑≥12 mm為耐藥，阿莫西林紙片抑菌直徑<10 mm為耐藥，3種或3種以上抗生素耐藥的菌株，確定為多重耐藥株。

1.3 苦丁茶、小飛揚草水提物制備 采用煮沸法提取藥液[3-4]，稱取干燥的苦丁茶50 g，加水過藥面浸泡30 min，武火煮沸后用文火煎煮，文火煎煮時間第1次為1.5 h，第2次為40 min，第3次為30 min，分別濾取煮液，將3次藥液合并后濃縮至100 ml(相當于0.5 g/ml生藥)；再取濃縮液40 ml，文火將其濃縮為5 ml濃縮液(相當于4.0 g/ml生藥)，滅菌備用。小飛揚草水提物制備方法同苦丁茶。

1.4 最低抑菌濃度檢測 采用二倍稀釋法[2]測定苦丁茶、小飛揚草水提物和阿莫西林對大腸桿菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。用肉湯培養基和苦丁茶、小飛揚草水提液混合配置濃度分別為2.0 g/ml、1.0 g/ml、0.5 g/ml、0.25 g/ml，肉湯培養基和阿莫西林混合配置濃度分別為16 μg/ml、32 μg/ml、64 μg/ml、128 μg/ml，從篩選出來的多重耐藥菌中選取3株，校正濃度至 0.5麥氏標準(相當于1.0×108CFU/ml)，取多重耐藥菌株菌液1 μl(相當于1.0×105CFU/ml)和含藥液的培養基混合培養24 h，用棉簽取培養液涂布于M-H瓊脂平板，觀察菌落生長情況，根據是否有生長判斷MIC。

1.5 苦丁茶和小飛揚草水提物作用前、后對多重耐藥株的藥敏試驗 上述檢測阿莫西林對多重耐藥的MIC即苦丁茶和小飛揚草水提物作用前阿莫西林對多重耐藥菌株的MIC；將篩選的3株多重耐藥菌株分別經1/2 MIC濃度的苦丁茶和小飛揚草水提物干預72 h，方法同“1.4”。取誘導培養后的耐藥菌株檢測阿莫西林的MIC即苦丁茶和小飛揚草水提物作用后阿莫西林對多重耐藥菌株和標準菌株的MIC。同時設立陰性對照組，該組是用培養液誘導標準菌株ATCC25922，測定阿莫西林對多重耐藥菌株和標準菌株的MIC。

1.6 熒光實時定量PCR檢測

1.6.1 RNA抽提：按照RNA按照試劑盒說明書進行提取苦丁茶和小飛揚草水提取物干預前、后耐藥菌株總RNA。

1.6.2 反轉錄：20.0 ml反應體系，在0.2 ml PCR管中加入5 ml總RNA、1 ml引物(0.2 mg/ml)、5 ml雙蒸水，70℃溫浴5 min，冰浴10 s，10 000 r/min離心1 min，加入4.0 ml緩沖液、2.0 ml三磷酸脫氧核苷(10 mmol/L)、1.0 ml RNA酶抑制劑(20 U/ml)、2.0 ml反轉錄酶(10 U/ml)，37℃溫浴5 min，42℃溫浴60 min，70℃溫浴10 min，終止反應，將上述溶液-20℃保存。

1.6.3 熒光定量PCR檢測：cDNA樣品稀釋到1/6，反應體系20 ml，把10 ml SYBRGreen qPCR Master Mix、1 ml上游引物(10 μM)、1 ml下游引物(10 μM)、7 ml ddH2O、1 ml cDNA混合配制反應混合液；熱循環反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性10 s，60℃退火40 s，共40個循環。

1.6.4 計算目的基因的相對表達量：采用2-△△CT法[5]對熒光實時定量PCR的數據進行相對定量分析，計算公式為：△CT=CT目的基因-CT內參基因；△△CT=△CT目的基因-對照組目的基因△CT平均值；采用2-△△CT表示目的基因的相對表達量。

1.7 統計學分析 采用SPASS 11.0軟件進行統計學分析，計量資料以(x±s)表示，兩組均數比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 多重耐藥篩選結果 篩選出3株多重耐藥，均表現為對青霉素、紅霉素、四環素和阿莫西林耐藥，分別命名為多重耐藥菌株1、2、3。

2.2 苦丁茶對、小飛揚草水提物對多重耐藥的MIC 苦丁茶、小飛揚草水提物對多重耐藥菌株1、2的MIC均高于誘導標準菌株ATCC25922的MIC，對多重耐藥菌株3的MIC和標準菌株一致。見表1。

表1 苦丁茶和小飛揚草水提物對多重耐藥菌株的MIC(g/ml)

2.3 苦丁茶、小飛揚草水提物干預前后阿莫西林對多重耐藥菌株的MIC 苦丁茶、小飛揚草水提物干預前，以及陰性對照組阿莫西林對多重耐藥菌株的MIC均為64 μg/ml；苦丁茶、小飛揚草水提物干預后，對阿莫西林多重耐藥株的MIC明顯低于干預前(苦丁茶t=8.582，P<0.001；小飛揚草t=9.376，P<0.001)，見表2。

表2 苦丁茶和小飛揚草水提物干預前后阿莫西林對多重耐藥株的MIC(μg/ml)

2.4 苦丁茶和小飛揚草水提物干預前后多重耐藥菌株acrA mRNA的表達 苦丁茶和小飛揚草干預后acrA mRNA的表達量均較干預前明顯降低(苦丁茶t=3.545，P=0.024；水飛揚草t=3.102，P=0.038)，見表3。

表3 苦丁茶和小飛揚草水提物干預前后多重耐藥菌株acrA基因mRNA的表達(2-△△CT)

3 討 論

由于抗生素不合理使用引起的細菌耐藥，已成為21世紀威脅人類生命健康的最重要元兇之一。實驗證實，清熱解毒類中藥的抗菌作用較強，被稱為植物性抗生素，如黃連、黃芩、黃柏、板藍根、夏枯草、連翹、丹皮、虎杖、貫眾等[4]。我國的中草藥資源豐富，細菌、病毒等病原體不容易對其產生耐藥性，具有良好的臨床應用前景。有學者認為從天然藥物中尋找高效低毒的抗菌成分，研發新的抗菌藥物，這可能是解決細菌多重耐藥的新途徑[6]。

苦丁茶性味苦甘，具有清熱涼血、驅散風熱、消除煩渴、滋養肝腎之功效，臨床上可用于治療痢疾、腹瀉、熱病煩渴、牙痛目赤等病癥。藥物化學分析表明，苦丁茶的抗菌成分主要為咖啡酸甲酯、香草醛、沒食子酸、咖啡酸、β-谷甾醇、對羥基苯甲醛、阿魏酸等[7]。有實驗證明，苦丁茶對甲鏈球菌、肺炎球菌、乙型鏈球菌、白喉桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠色假單胞菌、大腸桿菌、卡他球菌等有抑制作用，灌服苦丁茶水提物能明顯提高大腸桿菌、痢疾桿菌、肺炎桿菌及乙鏈球菌感染小鼠的存活率[8]。

小飛揚草味辛、酸，性涼，有小毒。有清熱解毒、利濕止癢、通乳之功效，臨床常用于肺癰、乳癰、疔瘡腫毒、痢疾、泄瀉、熱淋等病證。實驗證明，小飛揚草對大腸桿菌、枯草桿菌、抗幽門螺桿菌等有較強的抑制作用[9-10]。

本課題組在前期研究中發現苦丁茶和小飛揚草對多重耐藥大腸桿菌有明顯的抑制作用[11]。目前尚無關于苦丁茶和小飛揚草通過調控外排泵基因抑制或殺滅大腸桿菌的報告。細菌外排泵是病原微生物將體內的有毒物質運到細胞外環境的一種跨膜蛋白質，抗生素很容易誘導細菌外排泵超表達，使細菌在不利環境中生存繁殖[12]。具有超表達外排泵的菌株還可導致其他抗菌藥物作用靶點的變異，使細菌發生多重耐藥，可見細菌外排泵超表達是形成細菌多重耐藥的重要機制之一。大腸桿菌藥物外排泵較多達37種[13]，其中AcrAB-TolC外排泵是在大腸埃希菌中占絕對優勢的外排泵，在大腸桿菌中廣泛存在，其能將抗菌藥物、有機溶劑、染料等排出細菌體外[14]。有實驗表明，外排泵被抑制后，細菌可重新恢復對抗菌藥物的敏感性，這為研制抗耐藥菌藥物提供了新的思路。排泵抑制劑的作用機制可能有3條途徑,一是干擾外排泵組裝，二是阻斷外排泵能量來源，三是阻礙底物通過外排通道[15]。本文結果顯示，苦丁茶或小飛揚草干預后阿莫西林對多重耐藥株的MIC明顯低于干預前(P<0.05)；苦丁茶和小飛揚草干預后acrA mRNA的表達量均較干預前明顯降低(P<0.05)，說明苦丁茶和小飛揚草對多重耐藥性大腸桿菌具有較好的抑菌作用，其機制可能是下調外排泵acrA mRNA表達，促使菌體內藥物外排量減少、儲存量增加，從而提高大腸桿菌對藥物的敏感性。這與Xu等[13-14]的報告結果相符。不同菌株acrA mRNA的表達量不盡相同，這可能與菌株的差異有關，也可能還與外排泵的其他調控基因有關。本實驗沒有檢測大腸桿菌的全部外排泵基因，今后將進一步增加外排泵基因的研究，為解決大腸桿菌多重耐藥性問題提供更加充實的參考。

[1] 李 耘,呂 媛,薛 峰,等.衛生部全國細菌耐藥監測網(Mohnarin)2011-2012年革蘭陰性菌耐藥監測報告[J].中國臨床藥理學雜志,2014,30(3):260-277.

[2] 馬 越,李景云,金少鴻.美國臨床實驗室標準委員會推薦藥敏試驗操作方法和判斷標準(2005年修訂版)[J].中華醫學雜志,2005,85(17):1 182-1 184.

[3] 徐叔云,卞如濂,陳 修.藥理學實驗方法[M].北京:人民衛生出版,2002:911.

[4] 黃衍強,黃宏思,張 蓮,等.6種中草藥抗耐藥性大腸桿菌的抑菌效果[J].右江民族醫學院學報,2009,31(3):368-369.

[5] 宋國華,高繼萍,王春芳,等.相對定量2-△△CT法分析Caspase-3和Caspase-9在氟誘導大鼠腎臟中的表達[J].毒理學雜志,2014,28(4):274-278.

[6] 張 民.細菌耐藥背景下的中藥抗菌作用探析[J].西部中醫藥,2013,26(6):122-124.

[7] 左文健,陳惠琴,李曉東,等.苦丁茶葉的化學成分研究[J].中草藥,2011,42(1):18-20.

[8] 蔡 鵑,黃敏桃,黃云峰,等.廣西苦丁茶不同活性部位抑菌活性研究[J].中成藥,2014,36(1):198-201.

[9] 張 煜,王彥峰,王江濤.五十種廣西常用壯藥抗幽門螺桿菌感染的篩選研究[J].江西中醫學院學報,2009,21(5):66-68.

[10]黃衍強,黃干榮,李曉華,等.中藥提取物對耐藥幽門螺桿菌生物膜形成的影響[J].醫藥導報,2013,32(11):1 407-1 409.

[11]劉坤友.7種壯藥抗耐藥性大腸桿菌的抑菌效果[J].廣西醫學,2012,34(11):1 556,1 563.

[12]Schlisselberg DB,Kler E,Kisluk G,et al.Biofilm formation ability of Salmonella enterica serovar Typhimurium acrAB mutants[J].Int J Antimicrob Agents,2015,46(4):456-459.

[13]Xu B,Li C,Zheng Y,et al.Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E.coli ATCC25922[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(7):7 945-7 952.

[14]朱莉麗.大腸埃希菌多重耐藥外排泵AcrAB-Tolc主動外排機制的研究[D].天津:天津醫科大學,2013.

[15]劉憶霜,肖春玲.細菌多重耐藥外排泵抑制劑研究進展[J].中國抗生素雜志,2007,32(4):211-216,244.

Effect of broadleaf holly leaf and thymifolious euphorbia herb on efflux pumps acrA gene expression of multidrug-resistantEscherichiacoli

LIUKun-you1,ZHOUYan2,CHENGui-sheng1,LIUFeng-ling1,LIMing1

(1Departmentof,thePeople′sHospitalofLiujiangCounty,Liujiang545100,China; 2Departmentof,GuangxiCenterforDiseasePreventionandControl,Nanning530028,China)

Objective To explore the effect of broadleaf holly leaf and thymifolious euphorbia herb extracts on efflux pumps acrA gene expression of multidrug-resistantEscherichiacoli.Methods The multidrug-resistantEscherichiacoliwas screened using disk diffusion test.The minimal inhibitory concentrations(MIC) of broadleaf holly leaf extracts,thymifolious euphorbia herb extracts and amoxicillin for multidrug-resistant bacterial strains were detected by tube double dilution method.The multidrug-resistant bacterial strains were treated by the extracts of broadleaf holly leaf or thymifolious euphorbia herb with the concentration of 1/2 MIC,and then the MIC of amoxicillin was detected 72 hours later.The expression of efflux pumps gene acrA mRNA was detected in multidrug-resistant bacterial strains before and after being treated with broadleaf holly leaf or thymifolious euphorbia herb using quantitative real-time PCR.Results Three strains of multidrug-resistantEscherichiacoliwere screened.MIC of amoxicillin for multidrug-resistant bacterial strains was significantly lower after intervention with broadleaf holly leaf or thymifolious euphorbia herb compared to that before intervention(P<0.05).The expression of acrA mRNA after intervention with broadleaf holly leaf or thymifolious euphorbia herb was significantly lower than that before intervention(P<0.05).Conclusion Broadleaf holly leaf and thymifolious euphorbia herb can obviously inhibit multidrug-resistantEscherichiacoli.And the mechanism may be related to the inhibition on the expression of efflux pumps acrA gene in multidrug-resistantEscherichiacoli.

Escherichiacoli,Multidrug-resistance,Broadleaf holly leaf,Thymifolious euphorbia herb,Efflux pumps,acrA gene

廣西醫藥衛生科研課題(Z2010047)

劉坤友(1973～)，男，本科，副主任技師，研究方向：醫學檢驗。

周艷(1969～)，研究生，副主任技師，研究方向：微生物檢驗與質量控制、公共衛生管理與人力資源管理，E-mail：149024033@qq.com。

R 284

A

0253-4304(2016)02-0207-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.17

2015-10-18

2016-01-20)