脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞改良體外純化培養(yǎng)及其分泌神經(jīng)再生相關(guān)因子的特點(diǎn)▲

陳 博 郭曉敏 師 蔚

(陜西省人民醫(yī)院暨西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院1 神經(jīng)外科，2 神經(jīng)內(nèi)二科，西安市 710068，E-mail：slash0704@sina.com；3西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，西安市 710004)

論著·基礎(chǔ)研究

脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞改良體外純化培養(yǎng)及其分泌神經(jīng)再生相關(guān)因子的特點(diǎn)▲

陳 博1郭曉敏2師 蔚3

(陜西省人民醫(yī)院暨西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院1 神經(jīng)外科，2 神經(jīng)內(nèi)二科，西安市 710068，E-mail：slash0704@sina.com；3西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，西安市 710004)

目的 探討脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞(CPECs)的體外純化培養(yǎng)方法及其分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)和膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的特點(diǎn)。方法 取SD新生大鼠側(cè)腦室脈絡(luò)叢，分離CPECs并進(jìn)行傳代培養(yǎng)及純化，采用免疫熒光化學(xué)法進(jìn)行CPECs鑒定。將CPECs分為原代培養(yǎng)組(A組)、傳1代培養(yǎng)組(B組)及傳2代培養(yǎng)組(C組)，并檢測各組BDNF、NGF、CNTF和GDNF mRNA及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 經(jīng)熒光顯微鏡鑒定，所獲細(xì)胞均為CPECs。BDNF、GDNF的mRNA及蛋白在A組、B組及C組均有表達(dá)，B組及C組的表達(dá)均較A組降低，C組的表達(dá)較B組低(P<0.05)；NGF、CNTF的mRNA及蛋白在A組、B組及C組也均有表達(dá)，B組及C組的表達(dá)較A組增加，C組的表達(dá)較B組低(P<0.05)。結(jié)論 改良體外純化培養(yǎng)CPECs方法可行。CPECs體外具有分泌BDNF、NGF、CNTF和GDNF的能力，而且具有一定周期規(guī)律性。

脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞；體外；培養(yǎng)；純化；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；神經(jīng)生長因子；睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子；膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

脈絡(luò)叢為神經(jīng)元的生長發(fā)育及軸突的再生提供重要的微環(huán)境[1-2]，脈絡(luò)叢細(xì)胞包含了廣泛的生物活性物質(zhì)受體，參與多種活性物質(zhì)的生成，并經(jīng)過特異通路將其傳送到固定的腦區(qū)，通過腦脊液循環(huán)影響特異性靶細(xì)胞[3-5]。因此，本研究通過改良培養(yǎng)方法，觀察在體外純化培養(yǎng)條件下脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞(choroid plexus epithelial cells，CPECs)分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial-derived neurotrophic factor，GDNF)和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)的特點(diǎn)，為CPECs移植在中樞神經(jīng)修復(fù)機(jī)制的研究及應(yīng)用方面，提供理論參考及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 無特定病原體級SD新生大鼠12只，日齡1 d，重量6～8 g，雌雄不限，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供，合格證號：SCXK(陜)2007-001。

1.2 試劑與儀器 DMEM低糖型基礎(chǔ)培養(yǎng)基(美國Thermo公司，批號：11965118)，DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Thermo公司，批號：11320082)，左旋順式羥脯氨酸(L-cis-4-hydroxy-proline，L-HP；美國Sigma公司，批號：H54409)，RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒(美國Thermo公司，批號：K1621)，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(日本Takara公司，批號：RR420A)，SuperSignal?West Pico試劑盒(美國Thermo公司，批號：34079)，兔抗轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(transthyretin，TTR)抗體(美國Creative Diagnostics公司，批號：DMAB3595)。試驗(yàn)儀器主要有細(xì)胞培養(yǎng)箱(Galaxy S)，立體顯微鏡(SZX16，日本Olympus公司)，倒置相差顯微鏡，熒光顯微鏡(BX51，日本Olympus公司)，Image-Pro Plus圖像分析管理系統(tǒng)，掃描電子顯微鏡(JSM-IT100，日本JEOL電子株式會社)，透射電子顯微鏡( H-7650，日本Hitachi株式會社)。

1.3 方法

1.3.1 CPECs的制備：10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔注射大鼠以麻醉，用75%乙醇棉球消毒頸部皮膚，剪斷頸總動脈放血，斷頭處死，收集12個大腦并放置在4℃磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS) 溶液中，顯微鏡下分離脈絡(luò)叢組織，放置在盛有DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基的燒杯中剪碎并分離。4℃、800 r/min離心5 min，移去上清液。DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，移出1份(0.1 ml)細(xì)胞懸液，于 0.1 ml 0.4%的臺盼藍(lán)混勻，1 min后于倒置顯微鏡下計數(shù)，活細(xì)胞呈圓形透明，死細(xì)胞染成藍(lán)色。3 min內(nèi)用計數(shù)板分別計數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。根據(jù)公式計算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力=活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%。活力>95%有價值。細(xì)胞計數(shù)后取2 ml細(xì)胞懸液接種于Petri培養(yǎng)皿(430165，美國Coring Costar公司)上。

1.3.2 培養(yǎng)條件及純化方法： 在飽和濕度、95%空氣、5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)細(xì)胞。置于培養(yǎng)箱后6 h，吸出培養(yǎng)液，移入預(yù)先用多聚賴氨酸包被的6孔板中，加入含L-HP而不含胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，再次置于培養(yǎng)箱中，48 h后更換培養(yǎng)液，添加有胎牛血清和L-HP的培養(yǎng)基。2 d后清除未貼壁細(xì)胞，更換新鮮的添加有胎牛血清和L-HP的培養(yǎng)基，并使用免疫熒光化學(xué)法進(jìn)行CPECs鑒定： 4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞爬片10 min并用0.01 mmol/L PBS沖洗3次，正常山羊封閉血清室溫孵育30 min，添加兔抗大鼠的TTR抗血清(1 ∶100)室溫孵育1 h，4℃過夜。PBS沖洗3次，加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1 ∶50)于室溫下避光孵育2 h。用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)5 mg/L襯染細(xì)胞核，室溫孵育5 min。避光干燥，甘油碳酸鹽緩沖液封片并在熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.3.3 傳代培養(yǎng)： 輕輕吹打貼壁的CPECs，使貼壁的細(xì)胞懸浮。以1 000 r/min離心5 min，棄上清，吹打使之成為單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為5×104/ml。在與1.3.2相同的培養(yǎng)箱條件下，使用含有胎牛血清及L-HP的DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3 d更換一次培養(yǎng)液。

1.3.4 實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法檢測BDNF、NGF、CNTF和GDNF mRNA的表達(dá)： 采用Trizol(美國Invitrogen，批號：15596-018)提取細(xì)胞總RNA，5 μg RNA用于反轉(zhuǎn)錄，使用RevertAidTM 第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA。實(shí)時定量PCR反應(yīng)使用熒光試劑SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ。反應(yīng)操作中使用三復(fù)孔，并選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參基因用于校準(zhǔn)目的基因的相對表達(dá)，使用原始數(shù)據(jù)的Ct值運(yùn)用ΔΔCt法進(jìn)行計算，得到每個樣本中目的基因mRNA的相對表達(dá)值。PCR所使用到的引物信息見表1。

1.3.5 Western blot法檢測BDNF、NGF、CNTF和GDNF蛋白的表達(dá)： 采用二喹啉甲酸法提取細(xì)胞蛋白。蛋白使用放射免疫分析法裂解緩沖液進(jìn)行裂解，濃度使用二喹啉甲酸法進(jìn)行定量。裂解液按照常規(guī)操作步驟在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中上樣并進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)印以及一抗、二抗的抗體孵育，并最終進(jìn)行曝光。GAPDH作為內(nèi)參對照。一抗使用兔抗BDNF、NGF、CNTF和GDNF和小鼠抗GAPDH抗體，用山羊抗兔或山羊抗小鼠的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗。發(fā)光信號強(qiáng)度使用SuperSignal?West Pico試劑盒進(jìn)行底物反應(yīng)，曝光得到條帶。上樣量為100 μg。

1.3.6 細(xì)胞分組：共分為3組：原代培養(yǎng)組(A組)、傳1代培養(yǎng)組(B組)、傳2代培養(yǎng)組(C組)。

表1 qRT-PCR所用的引物

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，并使用Levene檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定 倒置相差顯微鏡下觀察可見細(xì)胞生長迅速，7 d后細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿，形態(tài)為鵝卵石樣，體積大、透明度及折光性強(qiáng)，核仁清晰可見，細(xì)胞緊密銜接，融合成片，呈蜂窩狀，見圖1。應(yīng)用免疫熒光化學(xué)法，在熒光顯微鏡下進(jìn)行鑒定，可見TTR標(biāo)記陽性者呈綠色熒光，細(xì)胞核采用DAPI襯染后，呈藍(lán)色熒光，此與TTR陽性的細(xì)胞質(zhì)組合成完整的細(xì)胞，見圖2。

圖1 倒置相差顯微鏡下CPECs的形態(tài)(×40，標(biāo)尺10 μm)。

圖2 熒光顯微鏡下CPECs形態(tài)(免疫熒光化學(xué)法染色，×200，標(biāo)尺50 μm)。

2.2 3組BDNF、NGF、CNTF和GDNF mRNA的表達(dá) BDNF、GDNF在A組、B組及C組均有表達(dá)，A組呈高表達(dá)，B組及C組的表達(dá)均低于A組(P<0.05)，C組的表達(dá)較B組低(P<0.05)。NGF、CNTF在A組、B組及C組均有表達(dá)，B組及C組的表達(dá)均較A組明顯增加(P<0.05)，C組的表達(dá)較B組低(P<0.05)。見表2。

2.3 3組BDNF、NGF、CNTF和GDNF蛋白的表達(dá) 條帶照相后掃描光密度，除以內(nèi)參光密度得到相對表達(dá)值。A、B、C三組條帶原始光密度值分別為：GAPDH：22 798.75、23 182.74、24 021.17；BDNF：54 051.73、22 536.11、4 932.80；NGF：4 531.68、8 486.17、7 743.99；CNTF：9 748.32、32 401.55、28 487.50；GDNF：30 435.96、13 102.87、4 455.46。用GAPDH校正后，設(shè)定A組數(shù)據(jù)為1，得到A、B、C 3組相對表達(dá)值。BDNF、GDNF在A組、B組及C組均有表達(dá)，A組呈高表達(dá)，B組及C組的表達(dá)均較A組降低，C組的表達(dá)較B組低(P<0.05)；NGF、CNTF在A組、B組及C組均有表達(dá)，B組及C組的表達(dá)較A組增加，C組的表達(dá)較B組低(P<0.05)。見表3及圖3。

表2 3組BDNF、NGF、CNTF和GDNF mRNA的相對表達(dá)情況(x±s)

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

表3 3組BDNF、NGF、CNTF和GDNF 蛋白的相對表達(dá)情況(x±s)

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

圖3 Western blot法檢測BDNF、NGF、CNTF和GDNF蛋白的表達(dá)。

3 討 論

既往研究表明，大鼠的背根神經(jīng)元與脈絡(luò)叢細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)可使神經(jīng)元的生長能力明顯增加[6-7]。在大鼠腦梗死模型中進(jìn)行脈絡(luò)叢細(xì)胞移植，大鼠受損的神經(jīng)功能可得到不同程度的改善[8-10]。研究表明，脈絡(luò)叢中可能存在干細(xì)胞以及CPECs具有分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞的能力[11-15]，證明脈絡(luò)叢具備了神經(jīng)修復(fù)的條件。目前對CPECs及其生物學(xué)特點(diǎn)研究極少，故本研究在前期工作基礎(chǔ)上，對CPECs的培養(yǎng)方法及分泌特點(diǎn)進(jìn)行更深入的研究。

CPECs原代培養(yǎng)較為困難，尤其是在培養(yǎng)過程中易受各種因素的影響，以往的培養(yǎng)方法對CPECs損傷大，并且極易受其他細(xì)胞污染，尤其是成纖維細(xì)胞等的污染。在純化過程中CPECs易流失，且培養(yǎng)周期長。本實(shí)驗(yàn)采用新生1 d SD大鼠的側(cè)腦室脈絡(luò)叢為取材對象，在顯微鏡下，采用精細(xì)手術(shù)器械，準(zhǔn)確分離脈絡(luò)叢組織，浸于細(xì)胞培養(yǎng)基中，眼科剪充分剪碎，肉眼下培養(yǎng)基呈懸濁液。使用注射器針頭反復(fù)抽吸、吹打，使CPECs從脈絡(luò)叢組織中游離出來，保持細(xì)胞形態(tài)完整，又使污染細(xì)胞減少。低速離心分離，可去除其他細(xì)胞及組織碎片，提高了CPECs的數(shù)量和純度。通常在細(xì)胞懸液貼壁最初的2 h尤為關(guān)鍵，此時間段，是進(jìn)行CPECs培養(yǎng)純化的最佳時期。使用鏈霉蛋白酶進(jìn)行消化，在純化加入L-HP前使用DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基有利于細(xì)胞在懸浮-貼壁過程中的存活。純化培養(yǎng)CPECs的經(jīng)驗(yàn)如下：在取材前，放血法可減少血液對脈絡(luò)叢的污染；經(jīng)過2次換液，紅細(xì)胞消失；對于培養(yǎng)皿，應(yīng)采用多聚賴氨酸包被，利于CPECs貼壁及增殖，7 d即可鋪滿培養(yǎng)皿；原代培養(yǎng)時用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，每3 d換液一次；由于CPECs自身可以分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，培養(yǎng)液不添加表皮生長因子。本研究所用細(xì)胞培養(yǎng)液構(gòu)成簡單，配制方便，不需要反復(fù)更換，簡化操作流程，避免細(xì)胞污染。

蘇木精- 伊紅染色以及電子顯微鏡用于觀察CPECs形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，則免疫熒光化學(xué)法多用于細(xì)胞鑒定。由于TTR專一性地表達(dá)于CPECs，故可采用CPECs的TTR表達(dá)陽性作為鑒定CPECs的標(biāo)準(zhǔn)。用抗TTR抗體進(jìn)行免疫組織熒光染色，是鑒定CPECs最可靠的方法。本研究中，在熒光顯微鏡下可見TTR標(biāo)記陽性者胞漿呈綠色熒光，而細(xì)胞核采用DAPI襯染后，呈藍(lán)色熒光，提示所獲細(xì)胞均為CPECs。

BDNF、NGF、CNTF和GDNF均在神經(jīng)細(xì)胞的生存、增殖和分化中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，BDNF、GDNF的mRNA及蛋白在A組、B組及C組均有表達(dá)，B組及C組的表達(dá)均較A組降低，C組的表達(dá)較B組低(P<0.05)；NGF、CNTF的mRNA及蛋白在A組、B組及C組也均有表達(dá)，B組及C組的表達(dá)較A組增加，C組的表達(dá)較B組低(P<0.05)。提示BDNF和GDNF的mRNA及蛋白表達(dá)在原代CPECs中最高，隨傳代逐次降低；NGF和CNTF的mRNA及蛋白表達(dá)在傳代CPECs中較原代細(xì)胞高，在傳1代的CPECs中表達(dá)最高。這提示在體外培養(yǎng)條件下的CPECs所分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)生長因子的種類及含量有其規(guī)律與特點(diǎn)，不同時期CPECs分泌神經(jīng)再生相關(guān)因子的能力亦不同。由于在不同疾病的不同時期，腦內(nèi)微環(huán)境不盡相同，因此CPECs作為種子細(xì)胞應(yīng)保證其在腦內(nèi)或脊髓內(nèi)移植時，可與其他組織工程材料良好符合并固位，發(fā)揮其最大效能。選取不同培養(yǎng)時期的CPECs進(jìn)行足量、聯(lián)合、配比移植，優(yōu)于一個培養(yǎng)階段的CPECs的治療效果。隨著研究的不斷深入，CPECs可能在腦外傷、非動脈瘤、非動靜脈畸形性腦出血、功能性疾病及腫瘤輔助治療方面發(fā)揮重要作用。

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Modified purification and culture in vitro for choroid plexus epithelial cells and features of nerve regeneration-related factors secreted by choroid plexus epithelial cells

CHENBo1,GUOXiao-min2,SHIWei3

(1DepartmentofNeurosurgery,2TheSecondDepartmentofNeurology,ShaanxiProvincialPeople′sHospital,theThirdAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710065,China;3DepartmentofNeurosurgery,theSecondAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710004,China)

Objective To explore the approaches to purification and culture in vitro for choroid plexus epithelial cells(CPECs),and features of brain-derived neurotrophic factor(BDNF),nerve growth factor(NGF),ciliary neurotrophic factor(CNTF) and glial-derived neurotrophic factor(GDNF) secreted by CPECs.Methods The choroid plexus of lateral ventricle was obtained from SD neonate rats.Then CPECs were separated,received passage culture and purification,and were identified using immunofluorescence chemistry method.CPECs were divided into primary culture group(Group A),the first passage culture group(Group B) and the second passage culture group(Group C).And the mRNA and protein expressions of BDNF,NGF,CNTF and GDNF were measured in each group.Results The cells obtained were identified as CPECs under fluorescence microscope.The mRNAs and proteins of BDNF and GDNF were expressed in Group A,Group B and group C.The expression level in Group B or C was lower than that in Group A,and the expression level in Group C was lower than that in Group B(P<0.05).The mRNAs and proteins of NGF and CNTF were expressed in Group A,Group B and Group C.The expression level in Group B or C was higher than that in Group A,and the expression level in Group C was lower than that in Group B(P<0.05).Conclusion The modified purification and culture in vitro for CPECs is feasible.CPECs obtain the ability to secret BDNF,NGF,CNTF and GDNF,which has periodic regularity to a degree.

Choroid plexus epithelial cells,In vitro,Culture,Purification,Brain-derived neurotrophic factor,Nerve growth factor,Ciliary neurotrophic factor,Glial-derived neurotrophic factor

國家自然科學(xué)基金(81271341)

陳博(1979～)，男，博士，主治醫(yī)師、講師，研究方向：神經(jīng)干細(xì)胞及顱底腫瘤。

郭曉敏(1982～)，女，博士，主治醫(yī)師、講師，研究方向：神經(jīng)干細(xì)胞及癲癇，E-mail：26880988@qq.com。

R-332

A

0253-4304(2016)09-1192-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.09.02

2016-03-06

2016-05-20)