基于三元二次正交設計的文蛤水解肽制備工藝優(yōu)化及ACE抑制活性分析

于志鵬,吳 雨,樊 玥,趙文竹,*,丁 龍,曲艾鈺,劉靜波,勵建榮,*

(1.渤海大學食品科學與工程學院,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.吉林大學營養(yǎng)與功能食品研究室,吉林長春 130062)

基于三元二次正交設計的文蛤水解肽制備工藝優(yōu)化及ACE抑制活性分析

于志鵬1,吳 雨1,樊 玥1,趙文竹1,*,丁 龍2,曲艾鈺1,劉靜波2,勵建榮1,*

(1.渤海大學食品科學與工程學院,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.吉林大學營養(yǎng)與功能食品研究室,吉林長春 130062)

本文以文蛤蛋白為原料,選用復合蛋白酶進行酶解并以水解度作為測定指標,在單因素實驗基礎上進行三元二次正交設計,對獲得最優(yōu)工藝參數(shù)進行驗證,并對文蛤ACE抑制肽的活性及氨基酸組分進行分析。通過單因素實驗得出文蛤ACE抑制肽酶解最優(yōu)工藝參數(shù)為底物濃度10%,酶解pH8.7,加酶量4.5%和酶解溫度51 ℃,酶解時間3 h,此酶解工藝條件下對應的水解度為33%,酶解液離心所得上清液經(jīng)HPLC測定其ACE抑制率為35%。

文蛤,活性肽,酶解,結構表征

文蛤屬軟體動物門、雙殼綱、真瓣鰓目、簾蛤科、文蛤屬[1]。文蛤主要分布在我國山東、遼寧、江蘇和廣西地區(qū),每年的采捕量最高達到25萬噸[2]。文蛤中蛋白質含量豐富,氨基酸種類齊全,是酶法制備生物活性肽的良好原料。種類繁多的海洋蛋白氨基酸序列中,存在著許多具有生物活性的氨基酸序列,用特定的蛋白酶水解,可釋放出具有活性的肽段。

以海洋貝類、魚類以及海產(chǎn)品加工下腳料等海洋蛋白為原料制備血管緊張素轉化酶(ACE)抑制肽的研究越來越受到關注。目前已成功從青蛤[3]、鮭魚皮[4]、草魚[5]、魚廢棄物[6]中制備ACE抑制肽,活性肽的分子量主要集中在1000 u 以下,ACE抑制肽的半抑制濃度(IC50)數(shù)值主要分布在27～1.18 mg/mL。近些年來的研究表明,文蛤含有多種天然活性物質,能發(fā)揮多方面的生理調節(jié)功能[7-8],目前已有文獻報道蛤蜊蛋白源活性肽具有ACE抑制活性[9-10]。

本研究擬利用復合蛋白酶酶解文蛤蛋白制備ACE抑制肽,酶解過程中實時監(jiān)測反應體系水解度(DH)的變化,在單因素實驗基礎上通過三元二次正交實驗設計建立復合酶制備文蛤活性肽的最優(yōu)工藝參數(shù),以期為生產(chǎn)實踐提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮文蛤肉 購于興隆大家庭購物中心(錦州);復合蛋白酶(活力1.5 AU-N/g) 諾維信公司。

HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇大地自動化儀器廠;JJ-1精密增力電動攪拌器 江蘇省金壇市自動化儀器廠;MG5302電動絞肉機 佛山市海迅電器有限公司;AG204 型電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司;全自動氨基酸分析儀L-8900 日本株式會社日立制作所;高效液相色譜儀 美國安捷倫科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 文蛤蛋白活性肽的酶解工藝 取一定量新鮮文蛤肉經(jīng)絞肉機絞成肉糜,并制成一定濃度的文蛤肉糜水溶液,之后轉移到水解瓶中,置于超級恒溫水浴鍋中調整至所需酶解溫度、底物濃度、加酶量和pH,最后加入一定量的復合蛋白酶啟動水解。水解過程中不斷攪拌,每隔30 min 測定酶解液pH,并不斷加入0.1 mol/L NaOH溶液以維持pH在規(guī)定的范圍內(±0.05),記錄每次加入NaOH溶液的量,根據(jù)所消耗NaOH的量進行水解度計算。酶解180 min后經(jīng)100 ℃滅酶10 min,之后在4 ℃條件下 6000×g離心10 min,取上清液冷凍干燥,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 單因素實驗 以水解度為指標,經(jīng)單因素實驗初步考察酶解溫度、加酶量、底物濃度和pH四個因素對復合蛋白酶水解文蛤蛋白制備活性肽的水解度的影響。

將文蛤肉糜水溶液調整pH分別在6、7、8、9、10和11條件下,并在底物濃度6%、加酶量3%和50 ℃情況下酶解3 h,考察pH對文蛤水解效果的影響。

設定文蛤肉糜水解溫度分別為40、50、55、60和70 ℃,并在底物濃度6%、加酶量3%和pH為8情況下酶解3 h,研究溫度對文蛤水解效果的影響。

將加酶量分別設定為1%、3%、5%和7%,并在pH為8、底物濃度6%和50 ℃情況下酶解解3 h,評價加酶量對文蛤水解效果的影響。

將文蛤肉糜底物濃度分別配制為2%、6%、8%、10%、12%、18%,并在pH為8、加酶量3%和50 ℃情況下酶解3 h,考察底物濃度對文蛤水解效果的影響。

1.2.3 酶解文蛤蛋白制備活性肽三元二次回歸正交模型 在單因素實驗基礎上,進行三元二次回歸正交實驗設計優(yōu)化,分別考察溫度、加酶量、底物濃度和pH及其他兩因素交互作用和因素r次項對水解效果的影響,因素水平見表1。

表1 因素水平編碼表

1.2.4 酶解蛋白質水解度(DH)的測定 水解度測定采用pH-stat法。

1.2.5 血管緊張素轉化酶抑制活性的測定 采用高效液相色譜法,具體步驟如下:取30 μL HHL底物液,加入10 μL抑制劑混合均勻,在(37±0.5 ℃)恒溫水浴中預熱3～5 min,然后加入20 μL ACE(2.0 units/mg protein)液充分混合,37 ℃保溫30 min后,再加入60 μL的1 moL/LHCl終止反應,得到反應液,同時用10 μL pH為8.3的硼酸緩沖液替代抑制劑溶液作為空白對照組[8-10]。該反應液用0.45 μm濾膜過濾后直接用HPLC系統(tǒng)進行分析。色譜條件:Inertsil WP300 C18色譜柱(125 mm×4.0 mm,5 μm),柱溫25 ℃,流速0.5 mL/min,流動相乙腈/水(0.05% TFA)比例為25/75等梯度洗脫,檢測波長228 nm[5]。

ACE抑制活性計算公式如下:

ACE抑制活性(%)=100(M-N)/M

式中:M為空白對照組中馬尿酸的峰面積,N為添加抑制劑組中馬尿酸的峰面積。

配制不同濃度的文蛤蛋白活性肽的水溶液,按照血管緊張素轉化酶抑制活性測定方法測定而獲得不同濃度樣品對ACE活性的抑制率。

1.2.6 活性肽組分氨基酸分析 參考國標GB/T 5009.124-2003,具體操作過程為:準確吸取文蛤ACE抑制肽溶液 300 μL于安剖瓶中,加入6 mol/L鹽酸10 mL,氮吹儀充氮氣2 min,酒精噴燈封口,置于110 ℃恒溫箱內酸解22 h。取出,自然冷卻后開管,吸取1 mL置于燒杯內,放入真空干燥箱,溫度設為50 ℃,真空干燥7 h后取出,吸取2 mL 0.02 N鹽酸復溶。吸取1.5 mL 過0.22 μm膜后置于上樣瓶內,利用全自動氨基酸分析儀L-8900進行測定。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用Origin對數(shù)據(jù)進行處理分析,樣品測定結果采用平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 pH對水解效果的影響

文蛤蛋白水解效果隨pH影響的變化趨勢見圖1。圖1表明在pH為7、8、9和10條件下酶解3 h,結果發(fā)現(xiàn)在pH為8條件下的水解度最高,表明在此條件下復合蛋白酶水解文蛤蛋白效果最佳。水解度隨著pH出現(xiàn)先增大后減小的現(xiàn)象,表明復合蛋白酶都有一個最適pH,在最適pH時酶活性最大,此時對應的蛋白水解效果較好。因此,復合蛋白酶酶解文蛤蛋白制備活性肽在pH為8條件下進行后續(xù)實驗。

圖1 pH對水解效果的影響Fig.1 Influence of pH on the degree of hydrolysis

2.2 溫度對水解效果的影響

由圖2可知,溫度由40～60 ℃升高過程中,水解度逐漸升高;當酶解溫度在50～60 ℃時,隨著溫度升高其水解效果降低較快,在60～70 ℃時水解度變化趨于平緩。因此可以初步得出酶解溫度為50 ℃時文蛤蛋白水解效果好。實驗結果證明在一定溫度范圍內隨著溫度升高,酶促反應和一般化學反應一樣反應速度加快;然而由于蛋白酶本質是蛋白質,當溫度超過一定數(shù)值后,隨著溫度逐漸升高,蛋白酶因逐漸變性而失活,導致水解度降低。范秀萍等[11]在珠母貝糖蛋白分離提取工藝條件優(yōu)化中也得出溫度對糖蛋白提取效果相同的變化趨勢。

圖2 溫度對水解效果的影響Fig.2 Effect of temperature on hydrolysis

2.3 加酶量對水解效果的影響

在一定范圍內,酶的用量增加有利于提高對底物蛋白質的水解程度,圖3為加酶量分別為1%、3%、5%和7%時酶解3 h的水解效果,通過單因素方差分析表明加酶量由1%增加為3% 時,對應文蛤蛋白水解度顯著升高;而3%、5%和7%加酶量對應的水解度差異不顯著。主要是因為在1%～3%期間隨著加酶量的增加,酶的利用量基本趨于飽和狀態(tài),但當加酶量達到3%以后,再增加加酶量無法提升水解度,可能此時酶的利用量處于不飽和狀態(tài),增加加酶量對水解度的影響不大。所以,綜合考慮應選取加酶量3%為最佳條件。

2.4 底物濃度對水解效果的影響

蛋白酶必須溶解于水才能均勻分散于文蛤肉糜中,進而與底物接觸并對其發(fā)生作用,實驗結果如圖4所示,底物濃度在2%～6%范圍內時,水解度變化較為平緩。底物濃度在6%～8%范圍內時,水解度逐漸升高,當?shù)孜餄舛仍黾拥?0%時,水解度繼續(xù)升高。其后在10%～18%范圍內時,水解度逐漸降低。初步得出當?shù)孜餄舛葹?0%時,文蛤蛋白水解效果較好。這主要是因為在底物濃度較低時,水分含量較高,雖然底物分配較均,但酶的濃度相對較低,所以水解度效果不理想;而當?shù)孜餄舛冗^高時,文蛤蛋白在水中分配不均而影響了酶的催化速度及分子擴散,此時也影響水解效果。因此,綜合考慮選取底物濃度為10% 進行后續(xù)優(yōu)化實驗研究。

圖4 底物濃度對水解效果的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on hydrolysis

2.5 三元二次回歸正交設計模型的建立

在單因素基礎上進行了三元二次回歸正交實驗設計,結果見表2。

表2 三元二次回歸正交實驗結果

根據(jù)相關系數(shù)得到回歸方程:Y=24.6+2.28X1+1.8X2+3.24X3-1.88X1X2+1.88X1X3+1.88X2X3-3.94X12-5.608X22-2.88X32

SR=66.55,fR=7;S回=677.3,f回=9;Se=20.67,fe=2;Slf=SR-Se=45.8,flf=fR-fe=5;F回=(S回/f回)/(SR/fR)=7.9>F0.01(9,7)=6.71,表明方程在0.01水平下顯著,且滿足Flf

根據(jù)西爾維斯特不等式判別方程的極值[12],設在穩(wěn)點x0=(x01,x02,…,x0p)處,計算y=xj(j=1,2,…,p)的各階偏導數(shù),并且定義行列式Dj,并對3個變量依次計算3個行列式:D1=-7.88<0,D2=84.85>0,D3=-434.52<0。

根據(jù)西爾維斯特不等式判別方程可以得出方程有極大值,利用求駐點方法求得當水解度取得極值時,x1=0.42,x2=0.22,x3=0.78,將因素編碼表代入方程中,即在底物濃度為10%,酶解pH為8.7,加酶量4.5%和酶解溫度51 ℃條件下,酶解3 h所得的文蛤蛋白水解度為29%,并經(jīng)實驗驗證水解度為33%與回歸方程優(yōu)化結果相近。

2.6 文蛤ACE抑制肽活性及氨基酸組分分析

利用高效液相色譜法對文蛤蛋白酶解液進行體外ACE抑制活性測定,結果表明文蛤活性肽(15 mg/mL)抑制率達到35%。通過對文蛤活性肽進行氨基酸分析,氨基酸組成含量見表3,脯氨酸含量較高。有研究發(fā)現(xiàn)蜥魚肌肉蛋白ACE抑制肽RVCLP(IC50為175 μmol/L),其 C末端的疏水性氨基酸Pro 是使其具有較高ACE抑制活性的重要原因[13]。文蛤ACE抑制肽中脯氨酸含量較高,使其具有開發(fā)高活性ACE抑制肽的潛在優(yōu)勢,但由于目前仍為多種肽的混合物,需要后續(xù)的分離純化以及活性驗證。

表3 文蛤ACE抑制肽氨基酸含量測定結果

3 結論

本研究以文蛤蛋白為原料,利用復合蛋白酶進行酶解制備活性肽,其最優(yōu)酶解工藝參數(shù)為底物濃度10%,酶解pH為8.7,加酶量4.5%、酶解溫度51 ℃,酶解3 h 所得的文蛤蛋白水解度為33%。最優(yōu)工藝參數(shù)下獲得酶解液經(jīng)離心后測定其上清液的ACE抑制活性為35%。文蛤蛋白源ACE抑制肽中氨基酸組成中谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸含量較高,分別為20.5、18.1和12.9 mmol/L。由于目前獲得的文蛤蛋白源ACE 抑制肽為混合物,后續(xù)將重點進行活性肽的多維色譜分離和結構鑒定,并對其抑制ACE作用的構效關系進行研究。

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Enzyme hydrolysis preparation and ACE inhibitory activity s of bioactive Peptides fromMeretrixlusoria

YU Zhi-peng1,WU Yu1,FAN Yue1,ZHAO Wen-zhu1,*,DING Long2,QU Ai-yu1,LIU Jing-bo2,LI Jian-rong1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Bohai University,National & Local Joint Engineering Research Center of Storage Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China; 2.Lab of Nutrition and Functional Food,Jilin University,Changchun 130062,China)

Meretrix lusoria protein was hydrolyzed by protease enzyme through the ternary quadratic orthogonal design based on the single factor experiment,and bioactivity against angiotensin converting enzyme(ACE)of peptides was investigated. Optimal hydrolysis conditions were found that hydrolysis time was 3 h,the substrate concentration was 10%,the value of pH was 8.7,the addition of enzyme was 3% and the hydrolysis temperature was 51 ℃. The degree of hydrolysis was 33%.InvitroACE inhibitory activity of bioactive peptides fromMeretrixlusoriawas performed by high performance liquid chromatography. The results suggested that the activity against the ACE of bioactive peptides was 35%.

Meretrixlusoria;active peptide;enzymatic hydrolysis;characterization

2016-06-28

于志鵬(1984-)，男，博士，講師，研究方向：蛋白質及活性肽的功能研究與產(chǎn)品開發(fā),E-mail：yuzhipeng20086@sina.com。

*通訊作者:趙文竹(1986-)，女，博士，講師，研究方向：營養(yǎng)與功能食品，E-mail：zhaowenzhu777@163.com。 勵建榮(1964-)，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)品加工，E-mail：lijr6491@163.com。

國家科技支撐課題(2012BAD00B03)；渤海大學博士啟動項目(0515bs079)；遼寧省科學事業(yè)公益基金項目(2016004004)。

TS

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000