類胡蘿卜素裂解酶催化不同底物生成非香氣物質的條件及優化

朱明明,樊明濤,何鴻舉,*,馬漢軍

(1.河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003;2.西北農林科技大學食品科學與工程學院,陜西楊凌 712100)

類胡蘿卜素裂解酶催化不同底物生成非香氣物質的條件及優化

朱明明1,樊明濤2,何鴻舉1,*,馬漢軍1

(1.河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003;2.西北農林科技大學食品科學與工程學院,陜西楊凌 712100)

利用高效液相色譜研究類胡蘿卜素裂解酶催化不同底物生成的非香氣物質隨酶解時間、pH、溫度的變化規律,結果表明非香氣物質生成量會隨著酶解時間的增加、pH的降低和溫度的升高出現先增加后減少的趨勢。另外發現β-胡蘿卜素在不同反應pH下可生成不同的裂解產物。利用二次多項式逐步回歸得到酶解的最佳工藝條件,β-胡蘿卜素、玉米黃質、β-阿樸-8′-胡蘿卜醛、角黃質和蝦青素的酶解條件分別為pH4.5、溫度30 ℃、時間15 min,pH4.5、溫度30 ℃、時間13 min,pH4.5、溫度33 ℃、時間45 min,pH4.0、溫度30 ℃、時間41 min,pH4.5、溫度50 ℃、時間7 min。按上述條件進行酶解反應,得到產物β1、z1和z2、a1、c1和c2、x1和x2的生成量分別為定義條件下的1.74、1.80、1.39、1.66和1.75倍。該方法有效提高了非香氣物質的生成量,并節約了時間。

β-胡蘿卜素,β-阿樸-8′-胡蘿卜醛,葉黃素類,類胡蘿卜素裂解酶,酶解因素,二次多項式逐步回歸

類胡蘿卜素是一類由植物和某些光合微生物產生的親脂性異戊二烯類色素,廣泛存在于自然界中[1],已鑒定出的種類超過700種,典型代表有C30類:β-阿樸-8′-胡蘿卜醛;C40類可分為胡蘿卜素類和含氧類胡蘿卜素類,其中β-胡蘿卜素和番茄紅素是前者的典型代表,而后者典型代表為葉黃素類[2-3]。

阿樸類胡蘿卜素(apocarotenoids)是一類由類胡蘿卜素氧化裂解派生的萜類化合物[4]。類胡蘿卜素由于分子氧的作用,可在雙鍵位置斷裂形成醛或者酮從而生成多種多樣的阿樸類物質[5]。阿樸類胡蘿卜素在自然界中廣泛存在,且具有非常重要的生物學功能。類胡蘿卜素的化學鍵斷裂位置決定了阿樸類胡蘿卜素的作用。第一類重要的阿樸類物質是C20化合物如視黃醛及其衍生物,其為脊椎動物視覺周期中視網膜紫質的發色團,起到至關重要的作用[6-7];第二類阿樸類胡蘿卜素可作為化學引誘物、排斥物、生長促進劑和抑制劑等[8-9],如脫落酸,可引發芽休眠、促進葉子脫落和抑制細胞生長,在植物耐旱性和糖感知上也起著重要的作用[10];第三類物質是香氣化合物,如β-紫羅蘭酮、β-環檸檬醛、香葉醛、α-大馬酮及β-大馬酮等[11],由于其較低的香氣閾值,可有效改善食品的風味[12]。另外,β-紫羅蘭酮作為C13類異戊二烯而言還具有一定的生物活性,可抑制癌細胞增殖、調控乳腺癌細胞、抗致畸毒性及降血脂等[13-15]。

本課題組前期研究首次發現巴氏葡萄球菌TS-82可高效降解類胡蘿卜素[16-18],經分離純化得到相應的類胡蘿卜素裂解酶[19],并對其基本酶學特性進行了研究[20-21]。為進一步了解該類胡蘿卜素裂解酶的催化作用機理,測定產生的香氣物質和非香氣物質,推斷該酶的作用位點,需對降解中間產物進行研究。由于由液相檢測得到的中間產物主要為非香氣物質,且中間產物極其不穩定,隨著反應時間的延長、pH的降低以及溫度的升高而降解[20],所以本實驗參照朱明明等酶解蝦青素的方法[20],以β-阿樸-8′-類胡蘿卜醛、β-胡蘿卜素、玉米黃質、角黃質為底物,研究生成非香氣產物的條件,并與蝦青素酶解條件進行對比,得到該酶作用于不同底物的條件、產物,并利用二次多項式逐步回歸[22-23]確定非香氣產物最大生成量的反應條件,以期進行LC-MS分析,為研究該酶催化機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗室分離保存的巴氏葡萄球菌菌株TS-82;β-阿樸-8′-胡蘿卜醛(98%)、β-胡蘿卜素(98%)、玉米黃質(95%)、角黃質(95%)、蝦青素(95%) Sigma-Aldrich;甲醇(HPLC級) 美國Tedia;甲基叔丁基醚 中國Aladdin;色譜級水 娃哈哈;正己烷和丙酮 隴南化學試劑公司;其他分析級試劑 天津科密歐。

CoolSafe冷凍干燥機 Labogene(丹麥)儀器公司;高效液相色譜儀LC-20A 島津(日本)公司;真空離心濃縮儀 Scanlaf(美國)公司;高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;cp2245型分析天平 Sartorius(德國)公司;KQ-2500E型數控超聲波清洗器 昆山禾創有限公司;HH恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 類胡蘿卜素標準品儲備液的配制 由于類胡蘿卜素對光和熱均特別敏感,所有儲備液需現配現用。底物儲備液參照蝦青素儲備液的配制方法[20],分別取一定量的類胡蘿卜素底物和1 g Tween-80溶于20 mL的二氯甲烷溶液中,避光條件下,在通風櫥中不斷振蕩直至有機試劑揮發完全,加入適量的無菌蒸餾水混勻,得到清澈的濃度為160 μmol/L的儲備液,置于4 ℃,待用。

1.2.2 酶催化類胡蘿卜素底物裂解的影響因素 在所有的體外實驗中,分別取450 μL的類胡蘿卜素標品儲備液(160 μmol/L),添加4 μg酶粉,用pH5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液(20 mmol/L)定容至2 mL。雖然所得純酶的最適反應pH為3.0[16],但由于在低pH條件下,一方面酶解反應加速,另一方面中間產物在低pH下極其不穩定,兩方面促使其更易轉化為終產物,所以在研究中間產物過程中選擇反應pH5.0。

1.2.2.1 反應時間對非香氣物質生成量的影響 分別配制β-阿樸-8′-胡蘿卜醛、β-胡蘿卜素、玉米黃質、角黃質、蝦青素的上述反應體系,在30 ℃條件下分別反應15、30、45和60 min。雖然該類胡蘿卜素裂解酶的最適反應溫度是50～60 ℃[16],但在此溫度下,酶解反應快,中間產物很快轉化為終產物,難以檢測到非香氣產物,所以選擇反應溫度為30 ℃進行。以不加酶粉、只加類胡蘿卜素標品儲備液的pH5.0的溶液為對照,在相同條件下處理。在到達預訂反應時間后采用朱明明[20]的方法終止反應并按照色譜條件測定實驗和對照組中非香氣物質峰面積的變化,從而得到產物生成量的變化,用峰面積代表生成量,其中若產物為兩種的,用兩種產物的峰面積總和代表兩產物的總生成量。

1.2.2.2 反應pH對非香氣物質生成量的影響 將上述反應體系稍加修改,采用不同pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)的醋酸-醋酸鈉緩沖液(20 mmol/L)定容至2 mL。根據酶解時間對產物生成量的影響,在30 ℃條件下將各底物的酶解時間控制在其產物生成量最大的時間范圍,以不加酶粉、只加類胡蘿卜素標品儲備液的各相應pH的溶液為對照,在相同條件下處理。采用上述方法測定產物生成量的變化。

1.2.2.3 反應溫度對非香氣物質生成量的影響 設定pH為5.0,根據不同底物的產物生成量最大時的酶解時間不同,將反應體系在30、40、50、60、70 ℃條件下分別酶解不同的時間,以不加酶粉、只加類胡蘿卜素標品儲備液的pH5.0的溶液為對照,在相同條件下處理。采用上述方法測定產物生成量的變化。

實驗中定義得到的非香氣物質的最大峰面積為100%,其余條件下的生成量轉換為相對生成量。以上所有反應均重復三次,取平均值。

1.2.3 酶解的正交實驗及二次多項式逐步回歸分析 優化中間產物生成量的三個變量分別為X1(pH)、X2(溫度T)、X3(時間t),預測的非香氣物質生成量值為Y1(β-胡蘿卜素非香氣物質的相對生成量)、Y2(玉米黃質兩個非香氣物質的總相對生成量)、Y3(β-阿樸-8′-胡蘿卜醛非香氣物質的相對生成量)、Y4(角黃質兩個非香氣物質的總相對生成量)、Y5(蝦青素兩個非香氣物質的總相對生成量)。實驗設計的因素水平根據之前的單因素實驗結果而定,設計三因素三水平的正交實驗,通過考察非香氣產物的生成量優化酶解條件。以蝦青素底物的正交實驗為代表,其因素水平具體見表1。

表1 正交實驗設計因素與水平表

圖1 類胡蘿卜素裂解酶催化β-胡蘿卜素、β-阿樸-8′-胡蘿卜醛、玉米黃質、角黃質和蝦青素酶解反應的液相色譜圖Fig.1 HPLC analysis of β-carotene,β-apo-8′-carotenal,zeaxanthin,canthaxanthin,astaxanthin cleavage reaction cleaved by carotenoid cleavage enzyme 注:a、c、e、g、j-β-胡蘿卜素、β-阿樸-8′-胡蘿卜醛、玉米黃質、角黃質和蝦青素未加酶的液相色譜圖和照片(對照);b、d、f、h、k-β-胡蘿卜素、β-阿樸-8′-胡蘿卜醛、玉米黃質、角黃質和蝦青素加酶反應的液相色譜圖和照片(pH5.0、30 ℃、30 min)。色譜峰:β-胡蘿卜素,保留時間33.787 min;中間產物β1,保留時間30.837 min。β-阿樸-8′-胡蘿卜醛,保留時間21.653 min;中間產物a1,保留時間17.920 min。玉米黃質,保留時間23.361 min;中間產物z1,保留時間24.670 min;中間產物z2,保留時間25.473 min。角黃質,保留時間24.704 min;中間產物c1,保留時間25.330 min;中間產物c2,保留時間25.619 min。蝦青素,保留時間19.982 min;中間產物x1,保留時間20.619 min;中間產物x2,保留時間21.915 min。

利用二次多項式逐步回歸確定方程,采用通徑系數分析反應溫度、時間、pH及其相互作用對非香氣產物生成量的影響。優化過程中定義反應時間30 min、pH5.0、溫度30 ℃條件下生成的非香氣物質的峰面積為100%,其他條件下的生成量轉化為相對生成量。

1.2.4 數據分析 使用DPS軟件(Version Rel.6.55,1997)對數據進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 類胡蘿卜素裂解酶純酶的制備

參照樊明濤等[19]的方法制備純酶粉,4 ℃保存待用。

2.2 非香氣物質生成的條件

實驗結果顯示巴氏葡萄球菌TS-82類胡蘿卜素裂解酶具有催化降解五種類胡蘿卜素底物(β-胡蘿卜素、β-阿樸-8′-胡蘿卜醛、玉米黃質、角黃質和蝦青素)的能力(圖1),表明其可催化多種類胡蘿卜素。由酶解反應和空白對照可看出,在pH5.0、溫度30 ℃條件下反應30 min后,底物峰面積明顯降低,表明該類胡蘿卜素裂解酶活性很好,能夠快速催化底物降解;在底物降解的同時轉化為中間產物,其中β-阿樸-8′-胡蘿卜醛和β-胡蘿卜素分別生成一種產物,即a1和β1,而葉黃素類則均生成兩種中間產物,分別為z1和z2、c1和c2、x1和x2。

2.2.1 反應時間對非香氣物質生成量的影響 由于非香氣物質(中間產物)不穩定,易轉化為終產物,探究酶解過程中反應時間的變化有助于檢測到非香氣物質的最大生成量,其結果如圖2所示。由圖中可看出反應時間對所有非香氣產物的生成量都有著顯著影響(p<0.05)。在酶解反應初期,隨著反應時間的增加,產物生成量逐步增加,這是因為底物的酶解反應生成中間產物;而當反應時間繼續延長時,產物的生成量開始下降,這可能是因為中間產物隨著時間的延長而發生降解轉化為終產物所致。在pH5.0和30 ℃條件下,β-阿樸-8′-胡蘿卜醛的非香氣產物a1最大生成量的酶解時間為60 min,隨著反應的繼續延長,其生成量減少(圖中未顯示);得到β-胡蘿卜素的非香氣產物β1和角黃質的兩個非香氣產物c1和c2總相對含量最高值的酶解時間是30 min;而對于玉米黃質和蝦青素底物而言,反應時間15 min時非香氣物質生成量最高(p<0.05)。這些結果同時也驗證了該酶優先催化玉米黃質裂解,而最后催化β-阿樸-8′-胡蘿卜醛的結論[20]。同時在玉米黃質、角黃質和蝦青素酶解反應過程中,反應初期產物z2、c2和x2的生成量明顯高于z1、c1和x1的生成量,而后隨著時間的延長,產物z2、c2和x2的生成量減少,z1、c1和x1的生成量增加,前者量低于后者量。

圖2 反應時間對五種類胡蘿卜素底物轉化為非香氣物質的相對生成量的影響Fig.2 Effects of reaction time on the relative amounts of non-volatile compounds converted from five carotenoids注:不同小寫字母代表相同香氣產物不同時間下差異顯著(p<0.05)。實驗中定義得到的非香氣產物的最大峰面積為100%,其余的條件下的生成量轉換為相對生成量。圖4、7同。

由于葉黃質類底物的酶解過程相似,因此在文中僅以玉米黃質為例列出產物變化圖,其產物隨時間變化如圖3所示,可看出反應7 min時產物z2峰面積高于z1峰面積,所以z2生成量高于z1生成量;而15 min時兩者生成量相當,反應達到30 min時可明顯觀察到產物z2含量低于z1含量。隨著反應時間繼續延長,兩個產物生成量均降低,可能是因為兩物質都出現降解造成的,該現象表明在玉米黃質酶解反應中,類胡蘿卜素裂解酶可能先催化底物轉化為z2,然后又轉化生成z1。在角黃質和蝦青素中也出現類似結果,表明其裂解路徑可能與玉米黃質相似。

圖3 反應時間對玉米黃質酶解的影響Fig.3 Effects of reaction time on the zeaxanthin degradation注:色譜峰:z代表玉米黃質,保留時間23.361 min;中間產物z1,保留時間24.670 min;中間產物z2,保留時間25.473 min。

相較于報道的其他植物源和微生物源的此類酶[24-26],該類胡蘿卜素裂解酶可在短時間內迅速催化底物裂解,表明該酶作用于各底物的催化效率明顯高于之前報道的酶類。

2.2.2 反應pH對非香氣物質生成量的影響 類胡蘿卜素裂解中間產物在強酸環境下極其不穩定,易降解。如圖4所示,反應pH的變化對非香氣產物的生成量有顯著影響(p<0.05)。在pH4.0時,非香氣產物a1生成量、β1生成量、z1和z2總相對生成量、x1和x2總相對生成量顯著下降(p<0.05)。在30 ℃和各pH條件下根據底物不同,選擇各自中間產物最大生成量的酶解時間進行反應,其生成量變化見圖3,可知β-阿樸-8′-胡蘿卜醛的非香氣產物a1生成量,玉米黃質z1和z2總生成量,蝦青素x1和x2總生成量達到最大化值時的pH為5.0;β-胡蘿卜素的非香氣產物β1生成量最高時的反應pH為5.0;角黃質的兩個產物c1和c2總生成量達到最高值時的反應pH為4.0(p<0.05)。當pH低于4.0時,非香氣產物迅速降解,可能是由于pH對中間產物影響較大,其在酸性條件下不穩定,發生降解所致。在低pH條件下,一方面酶活性變高,另一方面中間產物在酸性條件下易降解,而在相同的反應時間下,中間產物已降解,兩方面導致生成量減少,轉化為終產物,因此并不是酶作用最適pH就是中間產物生成量最大的條件,故從得到非香氣物質最大生成量的角度考慮,選擇酶解底物β-阿樸-8′-胡蘿卜醛、玉米黃質、蝦青素的pH條件為5.0;酶解角黃質的pH條件為4.0。雖然β-胡蘿卜素在反應pH為4.5和5.0時酶解生成的非香氣產物β1的含量無顯著性差異,但在實驗過程中發現在pH低于5.0時,β-胡蘿卜素除了生成非香氣物質β1,在其保留時間之前又生成一種新的非香氣產物β2,這是在其他底物中未發現的現象,也是其他報道中未提到的。如圖5所示,所以在進行非香氣物質純化時,選擇β-胡蘿卜素酶解pH條件為4.5,分別收集產物β1和β2,以期進行LC-MS鑒定,確定非香氣產物。

圖4 反應pH對五種類胡蘿卜素底物轉化為非香氣物質的相對生成量的影響Fig.4 Effects of pH valueson the relative amounts of non-volatile compounds converted from five carotenoids注:不同小寫字母代表相同香氣產物不同pH下差異顯著(p<0.05)。

圖5 不同pH對β-胡蘿卜素酶解反應的影響Fig.5 Effects of different pH valueson the β-carotene degradation注:a-pH5.0條件下β-胡蘿卜素加酶反應的液相色譜圖(40 ℃、30 min);b-pH4.5條件下β-胡蘿卜素加酶反應的液相色譜圖(40 ℃、30 min)。色譜峰:β-胡蘿卜素保留時間33.787 min;中間產物β1,保留時間30.837 min;中間產物β2,保留時間28.667 min。

在玉米黃質、角黃質和蝦青素酶解反應過程中,隨著pH的降低,類胡蘿卜素裂解酶的活性增加,酶解反應加快,酶解反應產物z2、c2和x2的生成量先增加后減少,z1、c1和x1的生成量增加。以玉米黃質為例,其產物隨著pH變化如圖6,可看出在pH由6.0到5.0時z2和z1含量逐步升高,這是由于在6.0時酶活特別低而隨著pH降低酶活升高,但隨著pH繼續降低,酶活性顯著增加,z2生成量卻出現下降,而z1生成量始終升高,原因可能是該酶先催化玉米黃質生成z2,而z2在酸性條件下,又轉化為z1。角黃質和蝦青素也出現類似狀況。隨著反應時間的延長也出現該現象,進一步說明其催化底物先生成z2、c2和x2,而后又轉化為z1、c1和x1的結果。

圖6 反應pH對玉米黃質酶解的影響Fig.6 Effects of pH value on the zeaxanthin degradation注:色譜峰:z代表玉米黃質,保留時間23.361 min;中間產物z1,保留時間24.670 min;中間產物z2,保留時間25.473 min。

圖7 反應溫度對五種類胡蘿卜素底物轉化為非香氣物質的相對生成量的影響Fig.7 Effects of temperature on the relative amounts of non-volatile compounds converted from five carotenoids注:不同小寫字母代表相同香氣產物不同溫度下差異顯著(p<0.05)。

2.2.3 反應溫度對非香氣物質產量的影響 由于類胡蘿卜素裂解中間產物在高溫環境下極其不穩定,易降解,如圖7所示,反應溫度的變化對非香氣產物的相對生成量有顯著影響(p<0.05)。當反應溫度在50 ℃及以上時,所有產物的相對生成量都顯著下降(p<0.05)。在pH5.0條件下反應,β-阿樸-8′-胡蘿卜醛的非香氣產物a1的生成量,玉米黃質產物z1和z2總生成量,β-胡蘿卜素的產物β1生成量達到最大時的反應溫度是40 ℃;蝦青素產物x1和x2總生成量和角黃質產物c1和c2總生成量最高時的反應溫度是30 ℃(p<0.05)。當溫度高于40 ℃時,非香氣物質迅速降解,原因可能是反應溫度對中間產物影響較大,其在溫度較高的條件下不穩定,發生降解所致;當溫度低于30 ℃時,由于酶的活性受到抑制,導致底物轉化效率低,使非香氣物質生成量較低。因此并不是酶最適作用溫度就是非香氣物質生成量最大的條件,故從得到非香氣物質最大生成量的角度考慮,選擇酶解底物β-阿樸-8′-胡蘿卜醛、玉米黃質、β-胡蘿卜素的反應溫度是40 ℃;酶解蝦青素和角黃質的反應溫度是30 ℃。

表2 蝦青素酶解的正交實驗結果與分析

注:Y51、Y52和Y53代表三次重復實驗得到的蝦青素非香氣產物的相對生成量。2.3 二次多項式逐步回歸分析

2.3.1 建立回歸方程 通過單因素實驗分別考察了反應時間、反應pH和反應溫度對中間產物生成量的影響后,選用正交實驗探討這3個因素對中間產物生成量的影響,以蝦青素底物的正交實驗為代表,結果見表2。

對所有底物的正交實驗結果進行二次多項式逐步回歸分析,由DPS數據處理系統擬合得出剔除不顯著項的回歸方程:

Y1=1262.83-73.12X3-45.30X12-0.14X22-0.16X32+13.88X1X3+0.37X2X3(Eq.1)

Y2=2827.40-130.03X2-121.12X12-0.26X22-0.16X32+29.34X1X2+0.14X2X3

(Eq.2)

Y3=1460.43-43.96X3-76.72X12-0.15X22-0.10X32+2.28X1X2+11.15X1X3

(Eq.3)

Y4=-349.60+37.84X3+22.56X12+0.09X22-0.19X32-2.00X1X2-5.52X1X3

(Eq.4)

(Eq.5)

同時得到二次多項式逐步回歸方程的相關統計學指標:按照上述方程(Eq.1)～(Eq.5)的順序,相關系數r分別為0.9943、0.9981、0.9940、0.9996和0.9977,F值分別為288.4028、888.7373、274.1786、4243.9423和490.5013,p均為0.0001,調整后的相關系數ra分別為0.9925、0.9976、0.9922、0.9995和0.996 7,剩余標準差S=2.4732、1.2983、1.3332、0.9554、3.4261,Durbin-Waston統計量d=2.18032406、1.50983326、2.39660911、1.43751667、1.94520693。由上述回歸方程統計學指標可知,回歸方程(Eq.1)～(Eq.5)都能夠正確反應各因素與非香氣物質生成量之間的關系,可靠性較高,同時因為r>ra,Y回歸效果顯著。

2.3.2 非香氣物質生成量與考察因素及其交互作用之間的相關關系 類胡蘿卜素底物酶解生成的非香氣物質相對生成量與考察因素及其交互作用的相關關系如表3所示。從各方程的回歸系數來看,反應pH、反應時間和反應溫度與產物生成量的相關性與單因素實驗結果一致。由表中數據可知,反應pH和反應時間的交互作用對β-胡蘿卜素的非香氣產物β1的生成量、β-阿樸-8′-胡蘿卜醛的非香氣產物a1的生成量、角黃質的兩個非香氣物質c1和c2的總生成量、蝦青素的非香氣物質x1和x2的總生成量都有顯著性影響(p<0.001),均呈正相關關系,表明pH越高,酶活性越低,隨著時間的延長,底物緩慢降解,產物含量逐步增高;反應時間和反應溫度的交互作用與β-胡蘿卜素的非香氣產物β1的生成量和玉米黃質產物z1、z2的總生成量呈正相關關系,而與蝦青素酶解產物的總生成量呈負相關關系,表明時間越長,溫度越高,酶活越高,中間產物降解越嚴重,含量越低;反應pH和反應溫度的交互作用可顯著影響玉米黃質產物z1、z2的總生成量、角黃質產物c1、c2的總生成量、蝦青素酶解產物x1和x2的總成生量(p<0.001),但相關性各不相同,分析其原因可能是pH升高會降低酶活,而溫度升高又會促進酶活,但中間產物在高溫下又不穩定。

表3 非香氣物質的相對生成量與考察因素及其交互作用的相關關系

注:***p<0.001。

表4 優化條件下各因素與非香氣產物生成量的直接通徑系數

注:利用F檢驗計算顯著性;**差異極顯著(p<0.01)。在得到的回歸方程的條件下,各個因素與非香氣物質生成量的直接通徑系數見表4。各因素對非香氣產物β1生成量的相對重要性根據直接通徑系數的絕對值由大到小依次排序是X3、X1X3、X2X3、X12、X32、X22,即反應時間對其產量影響最大,其次是反應pH和反應時間的交互作用,而反應溫度的二次項影響最小,因此在優化β-胡蘿卜素非香氣產物生成量的過程中需要注意反應時間和pH的選擇;各因素對玉米黃質產物z1和z2生成量的重要性從大到小依次是X1X2、X2、X12、X22、X32、X2X3,即反應pH和反應溫度的交互作用影響最大,而反應時間和反應溫度的交互作用影響最小,因此在優化玉米黃質非香氣產物生成量的過程中要慎重選擇反應pH和反應溫度;考察因素對非香氣物質a1生成量的影響從大到小依次是X1X3、X3、X12、X32、X22、X1X2,即反應pH和反應時間的交互對其生成量影響最大,而反應pH和反應溫度的交互影響最小,因此在優化β-阿樸-8′-胡蘿卜醛產物生成量的過程中首要平衡反應pH和反應時間的關系;對產物c1和c2總生成量有影響的因素從大到小依次排列為X3、X1X3、X32、X12、X1X2、X22,即反應時間的影響最大,其次是pH和時間的交互作用,而溫度的二次項影響最小,因此在優化角黃質非香氣物質生成量時也要時刻注意反應時間和反應pH的選擇;各因素對蝦青素產物x1和x2總生成量的影響從大到小排列為X1X3、X22、X32、X1、X2、X3、X2X3、X12,即pH和時間的交互作用對其生成量有較大影響,而反應溫度和反應時間的交互作用有較小影響,pH的二次項影響最小,故在優化蝦青素非香氣物質生成量時要平衡反應時間和pH的選擇。綜上在優化各非香氣產物生成量的過程中要注意平衡反應pH、溫度和時間的關系,以便得到最大生成量。

2.3.3 優化條件的驗證 由回歸方程(Eq.1)得到非香氣產物β1生成量達到最高指標時,各個因素組合為Y1=182.6984;X1=4.5;X2=30;X3=15,即反應pH為4.5、反應溫度30 ℃、反應時間15 min,在此條件下,產物β1的生成量可達到定義條件下的1.82倍;同樣地,由回歸方程(Eq.2)～(Eq.5)得到,玉米黃質的酶解條件為反應pH4.5、反應溫度30 ℃、反應時間13 min,在此條件下,產物z1和z2總生成量為定義條件下的2.02倍;β-阿樸-8′-胡蘿卜醛的酶解條件為反應pH4.5、反應溫度33 ℃、反應時間45 min,此條件下非香氣物質a1的生成量為定義條件下的1.57倍;角黃質的酶解條件為pH4.0、反應溫度30 ℃、反應時間41 min,此時產物c1和c2的生成量為定義條件下的1.83倍,蝦青素的酶解條件是反應pH4.5、反應溫度50 ℃、反應時間7 min,由此得到非香氣物質x1和x2的生成量可達到定義條件下的1.95倍。

為檢驗預測結果是否可靠,采用優化后的酶解反應條件進行各底物的酶解反應,重復3次實驗得到非香氣物質相對生成量。產物β1、z1和z2、a1、c1和c2、x1和x2相對產量分別為定義條件下的1.74、1.80、1.39、1.66和1.75倍,接近最優預測值,明顯高于單因素實驗結果,說明此優化結果可靠,對實驗指導具有一定的價值。

3 結論

通過研究酶解時間、pH和溫度對非香氣物質生成的影響,得到不同底物生成非香氣物質的變化規律,在酶解反應初始隨著酶解時間的增加、pH的降低和溫度的升高,非香氣物質生成量增加直到達到最大值,而隨著酶解時間的繼續延長、pH的繼續降低和溫度的繼續升高,非香氣物質生成量迅速降低。另外研究發現,β-胡蘿卜素在不同反應pH下生成不同的裂解產物。

選擇反應時間、pH和溫度為考察因素利用二次多項式逐步回歸優化酶解產物的生成量,得到其酶解的最佳工藝條件分別為:β-胡蘿卜素的酶解條件為反應pH為4.5、反應溫度30 ℃、反應時間15 min;玉米黃質的酶解條件為pH4.5、溫度30 ℃、時間13 min;β-阿樸-8′-胡蘿卜醛的酶解條件為pH4.5、溫度33 ℃、時間45 min;角黃質的酶解條件為4.0、溫度30 ℃、時間41 min;蝦青素的酶解條件為pH4.5、溫度50 ℃、時間7 min。按上述條件進行酶解反應,得到產物β1、z1和z2、a1、c1和c2、x1和x2的生成量分別為定義條件下的1.74、1.80、1.39、1.66和1.75倍。該方法有效提高了非香氣物質的生成量,并節約了時間,為產物的鑒定奠定基礎。

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Conditions and optimization for the degradation of different substrates by a carotenoid cleavage enzyme

ZHU Ming-ming1,FAN Ming-tao2,HE Hong-ju1,*,MA Han-jun1

(1.School of Food Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China; 2.College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100,China)

The variation of the non-volatile compounds generated from the degradation of different substrates by carotenoid cleavage enzyme was investigated using HPLC method,with the changing of enzymolysis time,pH value and temperature. The results showed that the production of non-volatile compounds had a trend of increased at the beginning and then decreased,with the increasing of enzymolysis time and temperature and decreasing of pH. In addition,it was found that theβ-carotene was degraded into different products at different pH values. By using quadratic polynomial stepwise regression analysis,the optimum reaction conditions for cleaving different substrates by purified enzyme were obtained and summarize as follows:pH4.5,15 min at 30 ℃ forβ-carotene,pH4.5,13 min at 30 ℃ for zeaxanthin,pH4.5,45 min at 33 ℃ forβ-apo-8′-carotenal,pH4.0,41 min at 30 ℃ for canthaxanthin,pH4.5,7 min at 50 ℃ for astaxanthin,respectively. Under these conditions,the total yields of non-volatile products were 1.74,1.80,1.39,1.66 and 1.75-fold higher than the defined yields,respectively. In conclusion,this method could be used to enhance the yields of non-volatile products effectively and was also time-saving.

β-carotene;β-apo-8′-carotenal;xanthophylls;carotenoid cleavage enzyme;hydrolysis factors;quadratic polynomial stepwise regression analysis

2016-06-28

朱明明(1989-)，女，博士，講師，研究方向：食品分析及食品生物技術，E-mail:happyzhumingming@126.com。

*通訊作者:何鴻舉(1983-)，男，博士，教授，研究方向：食品質量分析與快速檢測，E-mail:hongju_he007@126.com。

河南省高等學校重點科研項目(17A550001)；河南科技學院高層次人才科研啟動項目(2015015)；國家自然科學基金面上項目(31171728)；河南省高校科技創新團隊支持計劃(13IRTSTHN006)。

TS

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000