苦參堿對人膀胱癌BIU—87/ADM細胞多藥耐藥的影響

左陵君　張耘新　段建敏

摘要：目的 探討苦參堿對人膀胱癌BIU-87/ADM細胞多藥耐藥逆轉作用的機制。方法 MTT法檢測細胞生長抑制率；熒光分光光度計檢測阿霉素（ADM）的蓄積和外排；免疫印跡法檢測P-糖蛋白（P-gp）表達；P-gp-GloTMAssay System試劑盒檢測P-gp ATP酶活性。結果 經(jīng)ADM作用后，與敏感細胞株BIU-87存活率比較，耐藥細胞株BIU-87/ADM存活率明顯增加（P<0.001），苦參堿呈劑量依賴地降低BIU-87/ADM細胞存活率（P<0.01），而對敏感細胞株BIU-87細胞存活率無顯著影響。苦參堿呈劑量依賴地增加ADM在BIU-87/ADM細胞中蓄積水平，抑制ADM細胞內外排。苦參堿明顯抑制P-gp蛋白表達，降低P-gp ATP酶活性。結論 苦參堿通過抑制BIU-87/ADM細胞P-gp蛋白和ATP酶活性，減弱P-gp外排功能，增加細胞內ADM蓄積，從而發(fā)揮對人膀胱癌BIU-87/ADM細胞多藥耐藥的逆轉作用。

關鍵詞：苦參堿；BIU-87/ADM細胞；多藥耐藥；逆轉

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.020

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）02-0073-03

Effects of Matrine on Multidrug Resistance of Human Bladder Cancer BIU-87/ADM Cells ZUO Ling-jun， ZHANG Yun-xin， DUAN Jian-min （Department of Urology Surgery， The Second Hospital Affiliated to Lanzhou University， Lanzhou 730030， China）

Abstract： Objective To investigate the reversal mechanism of matrine on multidrug resistance （MDR） in BIU-87/ADM cells. Methods The cell proliferation inhibition rate was detected by MTT assay； the accumulation and efflux of ADM was detected by fluorescence spectrophotometer； the expression of P-gp protein was tested by Western blot； the activity of P-gp ATPase was measured by P-gp-GloTM Assay System kit. Results Compared with the sensitive cell line BIU-87， the survival rate of multidrug resistant cell line BIU-87/ADM was significantly increased after treated with ADM （P<0.001）； matrine reduced the survival rate of BIU-87/ADM cells with a manner of dose-dependently （P<0.01）， without significant effect on the BIU-87 cell. Matrine increased accumulation of ADM and inhibited P-gp-mediated efflux of ADM. Matrine decreased the expression of P-gp and inhibited the activity of P-gp ATPase significantly. Conclusion Matrine can reverse multidrug resistance in BIU-87/ADM cells by inhibiting the expression of P-gp and ATPase activity， reducing P-gp-mediated efflux of ADM， and increasing accumulation of ADM to play the role in reversal effects on multidrug resistance of human bladder cancer BIU-87/ADM cells.

Key words： matrine； BIU-87/ADM cells； multidrug resistance； reversal

腫瘤細胞的多藥耐藥（multidrug resistance， MDR）是導致腫瘤化療失敗主要原因之一。目前研究表明，細胞膜上P-糖蛋白（P-gp）的過度表達及P-gp ATP酶活性升高是腫瘤細胞產(chǎn)生MDR的主要機制[1-2]。苦參堿作為苦參的主要活性成分，具有明顯的化療增敏作用，目前已廣泛用于腫瘤的輔助治療[3-6]，但對人膀胱癌阿霉素（ADM）耐藥是否具有逆轉作用，目前尚不清楚。本實驗擬探討苦參堿對人膀胱癌BIU-87/ADM耐藥細胞的逆轉作用及其機制，

基金項目：甘肅省自然科學研究基金計劃（145RJYA256）

以期為其臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞

人膀胱癌BIU-87細胞及BIU-87/ADM耐藥細胞由四川大學華西醫(yī)院泌尿外科贈送，蘭州大學第二醫(yī)院泌尿外科研究所保藏。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI1640培養(yǎng)基（北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司），胎牛血清、MTT（美國Sigma公司），RIPA裂解液、Bradford蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術研究所），P-gp抗體、β-actin抗體（美國Santa Cruz公司），HRP偶聯(lián)羊抗鼠二抗（北京中杉金橋公司），P-gp-GloTM Assay System試劑檢測盒（美國Promega公司）；CO2培養(yǎng)箱、全波長Multiskan Spectrum酶標儀（美國Thermo公司），熒光光度計（RF-5301PC，日本島津）。

1.3 藥物

苦參堿注射液，山西振東泰盛制藥有限公司，批號130120；注射用鹽酸多柔比星，山西普德藥業(yè)有限公司，批號1211-1。

1.4 細胞存活率檢測

取對數(shù)生長期人膀胱癌BIU-87細胞及BIU-87/ ADM耐藥細胞接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后加不同濃度苦參堿（0.5、1.0、2.0 ?g/mL）和10 ?g/mL ADM，對照組在培養(yǎng)體系中加同濃度DMSO。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)基，各孔加5 mg/mL MTT 20 ?L，繼續(xù)孵育4 h。棄培養(yǎng)基，每孔加DMSO 200 ?L，待溶解顯色后于酶標儀570 nm波長處測定OD值，計算細胞存活率（實驗組平均OD值÷對照組平均OD值×100%）。所有實驗均重復3次。

1.5 阿霉素蓄積檢測

參考文獻[2，7]方法，通過檢測ADM自發(fā)熒光強度反映ADM的蓄積程度。收集1×106 BIU-87/ADM細胞，與不同濃度苦參堿或DMSO于37 ℃孵育1 h加10 ?g/mL ADM孵育3 h。冷PBS洗滌細胞3次后，重懸收集細胞，熒光光度計檢測分析相同數(shù)目細胞的熒光強度，激發(fā)波長480 nm，發(fā)射波長570 nm，并計算相對熒光強度值。

1.6 阿霉素外排檢測

加含10 ?g/mL ADM的培養(yǎng)液與細胞孵育3 h后，棄培養(yǎng)基。加不同濃度苦參堿或DMSO培養(yǎng)液后，繼續(xù)孵育1 h。冷PBS洗滌3次后，重懸收集細胞，熒光光度計檢測。

1.7 Western blot檢測

按“1.4”項處理細胞24 h后收集細胞，PBS洗滌加蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA細胞裂解液提取總蛋白。Bradford法蛋白定量，上樣量30 ?g，10%SDS-PAGE進行電泳2.5 h。PVDF膜轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗（1∶1000稀釋）4 ℃孵育過夜；1×TBST洗滌3×10 min。二抗（1∶2000稀釋）37 ℃孵育2 h，1×TBST洗滌3×10 min。ECL顯色法進行檢測。采用軟件Image pro plus 6.0比較條帶的積分光密度。

1.8 P-糖蛋白ATP酶檢測

嚴格按P-gp-GloTM Assay System試劑盒使用說明書進行檢測。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析，組間均數(shù)多重比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 苦參堿逆轉BIU-87/ADM細胞對阿霉素耐藥性的影響

經(jīng)ADM作用后，與敏感細胞株BIU-87存活率比較，耐藥細胞株BIU-87/ADM存活率明顯增加（P<0.001），即BIU-87/ADM細胞對ADM表現(xiàn)出明顯的耐藥性。預實驗結果顯示，苦參堿單獨作用于BIU-87/ADM細胞的IC50為32.5 ?g/mL，本實驗選取對BIU-87/ADM細胞無明顯細胞毒作用的劑量0.5，1.0、2.0 ?g/mL。結果顯示，苦參堿呈劑量依賴地降低BIU-87/ADM細胞存活率，即有效地逆轉BIU-87/ADM細胞對ADM的耐藥性，而對敏感細胞株BIU-87細胞存活率無顯著影響，見表1。

2.2 苦參堿對阿霉素BIU-87/ADM細胞內蓄積的影響

預先未加苦參堿，單純ADM作用后，BIU-87/ ADM細胞內ADM的熒光強度較弱，即ADM蓄積水平較低。苦參堿呈劑量依賴地增加ADM在BIU-87/ADM細胞中蓄積水平，見表2。

2.3 苦參堿對阿霉素BIU-87/ADM細胞內外排的影響

經(jīng)ADM孵育BIU-87/ADM細胞3 h后，再加不同濃度苦參堿或DMSO。結果顯示，溶劑組BIU-87/ADM細胞內熒光強度較低，即ADM外排較多；苦參堿明顯增加細胞內熒光強度，即抑制ADM的外排，見表3。

2.4 苦參堿對BIU-87/ADM細胞P-糖蛋白表達及其ATP酶活性的影響

苦參堿明顯抑制BIU-87/ADM細胞P-gp蛋白表達（見圖1），并呈劑量依賴地抑制P-gp ATP酶活性，見表4。

3 討論

人膀胱癌BIU-87/ADM耐藥細胞模型是研究膀胱癌多藥耐藥的最常用模型之一[8]。本研究通過建立該模型評價苦參堿對BIU-87/ADM耐藥的逆轉作用，結果顯示，苦參堿可劑量依賴地逆轉BIU-87/ADM細胞對ADM的耐藥性。

P-gp具有ATP依賴性“藥泵”功能，通過與ATP結合將細胞內藥物轉移至細胞外，減少藥物蓄積，降低細胞內的藥物濃度，從而導致細胞產(chǎn)生耐藥性。本實驗結果顯示，苦參堿能顯著抑制ADM外排，增加ADM在BIU-87/ADM細胞中蓄積水平，這提示苦參堿對BIU-87/ADM耐藥的逆轉作用可能與調節(jié)P-gp蛋白表達有關。進一步Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，苦參堿呈劑量依賴地抑制P-gp蛋白表達，驗證了上述推斷，即苦參堿通過抑制P-gp蛋白表達，減少ADM外排，增加ADM在BIU-87/ADM細胞中蓄積水平，從而發(fā)揮其對BIU-87/ADM耐藥的逆轉作用。

一般認為，P-gp藥物外排作用與ATP的水解相偶聯(lián)，所以P-gp底物可誘導ATP酶活性。本研究發(fā)現(xiàn)，在BIU-87/ADM耐藥細胞株中ADM能明顯增加P-gp ATP酶活性，即ADM為P-gp底物，這與前人報道一致[9]。同時，我們發(fā)現(xiàn)苦參堿能抑制BIU-87/ADM耐藥細胞株中P-gp ATP酶活性。

綜上，苦參堿對BIU-87/ADM細胞耐ADM具有較強的逆轉作用，其機制是通過抑制P-gp蛋白表達，降低P-gp ATP酶活性，減少P-gp外排作用，從而增加ADM在細胞內的蓄積。

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（收稿日期：2015-04-21）

（修回日期：2015-05-30；編輯：華強）