RP—HPLC同時測定益氣固本顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和藁本內酯的含量

張小華　沈濤　梁海寧　李季文　畢映燕

摘要：目的 建立反相高效液相色譜法測定益氣固本顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和藁本內酯含量的方法。方法 采用Waters SymmetryShield C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.2%甲酸梯度洗脫溶液，檢測波長為260 nm。結果 毛蕊異黃酮葡萄糖苷的線性范圍為0.162～0.810 μg（r=0.999 6），加樣回收率為99.64%（RSD=1.94%）。藁本內酯的線性范圍為0.386～1.930 μg（r=0.999 8），加樣回收率為98.56%（RSD=1.60%）。結論 該方法可為益氣固本顆粒質量標準的完善提供依據。

關鍵詞：益氣固本顆粒；反相高效液相色譜法；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；藁本內酯

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.022

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）02-0079-03

Simultaneous Determination of Calycosin-7-glycoside and Ligustilide in Yiqi Guben Particles by RP-HPLC ZHANG Xiao-hua， SHEN Tao， LIANG Hai-ning， LI Ji-wen， BI Ying-yan （Pharmacy Department， Gansu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730050， China）

Abstract： Objective To develop a RP-HPLC method for determining the contents of calycosin-7-glycoside and ligustilide in Yiqi Guben Particles. Methods The contents of calycosin-7-glycoside and ligustilide were determined with a Waters SymmetryShield C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm）. The mobile phase was acetonitrile-0.2% formic acid with gradient elution. The detection wavelength was 260 nm. Results The linear range of calycosin-7-glycoside was within 0.162–0.810 μg （r=0.999 6）， and the recovery rate was 99.64% （RSD=1.94%）. The linear range of ligustilide was within 0.386–1.930 μg （r=0.999 8）， and the recovery rate was 98.56% （RSD=1.60%）. Conclusion This method can provide experimental basis for quality control of Yiqi Guben Particles.

Key words： Yiqi Guben Particles； RP-HPLC； calycosin-7-glycosidase； ligustilide

益氣固本顆粒是由本院展銳主任醫師臨床經驗方研制而成的顆粒劑，全方由黃芪、白術、防風、當歸等8味中藥組成，具有益氣固本、溫腎健脾、扶正祛邪功效，通過調節腫瘤患者免疫功能，扶正抗癌，從而提高患者生存質量，延長生存期。黃芪具有補氣升陽、固表止汗、生津養血等功效，為方中主藥。毛蕊異黃酮葡萄糖苷是2010年版《中華人民共和國藥典》[1]規定的黃芪質量控制的特征指標。藁本內酯是當歸抗腫瘤、鎮痛消炎的主要成分，在其揮發油中含量最高[2-3]。對處方中毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內酯進行準確定量，是該制劑質量控制的關鍵步驟。本試驗建立同時測定益氣固本顆粒中毛蕊異黃酮葡萄

基金項目：甘肅省科技支撐計劃（1304FKCA105）

糖苷及藁本內酯的反相高效液相色譜（RP-HPLC）方法，為其質量標準的擬定提供依據。

1 儀器與試藥

Waters HPLC系統，包括Waters 1525二元泵（美國Waters公司），Waters 2487雙波長紫外檢測器（美國Waters公司），Bree色譜工作站；HS6150型超聲波清洗器（天津市恒奧科技發展有限公司）；METTLER AE240電子分析天平（賽多利斯公司）；RE52CS旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

益氣固本顆粒（甘肅省中醫院，批號20140319、20140514、20141106），毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（天津一方科技有限公司，批號AB019C-a，純度≥99%），藁本內酯對照品（天津一方科技有限公司，批號AB086L，純度≥99%），乙腈為色譜純（天津市光復精細化工研究所），其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters SymmetryShield C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈為流動相A，0.2%甲酸溶液為流動相B，梯度洗脫（見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：260 nm；柱溫：室溫；進樣量：10 μL[4-6]。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品0.81 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為81 ?g/mL的對照品儲備液A液。精密稱取藁本內酯對照品38.53 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，取0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為193 ?g/mL的對照品儲備液B液。將上述對照品儲備液A液和B液按1∶1比例混合均勻，經0.45 ?m濾膜過濾，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取益氣固本顆粒約1 g，精密稱定，研細，置具塞錐形瓶中，加甲醇定容至10 mL，超聲處理（功率150 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，搖勻，經0.45 ?m濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

按益氣固本顆粒的處方及制備方法，制備不含黃芪、當歸的顆粒，作為陰性樣品。取陰性樣品約1 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備，即得。

2.5 系統適用性試驗

按“2.1”項下色譜條件，取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液進樣測定，毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內酯的保留時間分別為19.8、28.5 min，分離度均>1.5。結果表明，樣品中其他成分對毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內酯的測定無干擾。色譜圖見圖1。

2.6 線性關系考察

分別精密吸取“2.2”項下對照品儲備液A液和B液適量，用甲醇稀釋成毛蕊異黃酮葡萄糖苷濃度分別為16.25、32.4、48.62、64.9、81 ?g/mL，藁本內酯濃度分別為38.6、77.2、115.8、154.4、193 ?g/mL的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別進樣測定，記錄峰面積，以峰面積對進樣濃度進行回歸分析，得回歸方程。毛蕊異黃酮葡萄糖苷Y=153 636X+3853.7（r=0.999 6），線性范圍為0.162～0.810 μg；藁本內酯Y=2.153×106X+0.1833（r=0.999 8），線性范圍為0.386～1.930 μg。

2.7 精密度試驗

精密吸取上述混合對照品溶液10 μL，重復進樣6次，分別測其峰面積，結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內酯的峰面積RSD分別為0.43%、1.22%，表明儀器精密度較好。

2.8 重復性試驗

稱取同一批號益氣固本顆粒（批號20140514）6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按含量測定方法進行測定。結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內酯濃度分別為0.21、0.89 mg/g，RSD分別為0.42%、0.77%，表明本方法重復性良好。

2.9 穩定性試驗

精密吸取同一批號益氣固本顆粒（批號20140514），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別在放置0、2、4、6、12、24 h進樣，測定峰面積，計算毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內酯峰面積的RSD分別為1.31%、1.20%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.10 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的益氣固本顆粒（批號20140514）約1 g，平行6份，分別精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內酯對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液并測定，計算回收率，結果見表2。

2.11 樣品含量測定

取3個批次供試品，每批平行3份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，測定峰面積，以外標法計算樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內酯含量，結果見表3。

3 討論

供試品溶液的制備比較了甲醇、70%甲醇、50%甲醇及乙醇為提取溶劑[7]，結果顯示，使用甲醇提取有效成分時，毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內酯提取較為完全，且雜質峰較少，主峰分離度好。同時，比較了超聲20 min及超聲40 min，結果表明，提取時間太長則藁本內酯含量減少較明顯，故選擇甲醇超聲提取20 min的方法進行供試品溶液的制備。

檢測波長的選擇，文獻報道毛蕊異黃酮葡萄糖苷最大吸收波長為260 nm[8]，藁本內酯多在320 nm進行含量測定[9]。本研究測定過程中發現，260 nm波長下毛蕊異黃酮葡萄糖苷及藁本內酯吸收度值均較高，而在320 nm波長下毛蕊異黃酮葡萄糖苷幾乎無吸收度值，故選擇在260 nm波長下進行2個成分的同時測定。

本試驗曾采用乙腈-0.2%甲酸溶液（30∶70）等度洗脫方法進行檢測，結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷分離度不好，且藁本內酯出峰時間較長。隨后采用乙腈- 0.2%甲酸溶液梯度洗脫的方法，得到的色譜峰峰型和分離度較好，同時縮短了檢測時間，提高了檢驗效率。

參考文獻：

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[8] 李圓圓，宋英孫，方芳.HPLC測定益心通脈合劑中丹參素鈉和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（22）：64-67.

[9] 曹建敏，王宗花，丁明玉.反相高效液相色譜法同時測定川芎中的四種內酯類化合物[J].色譜，2005，23（5）：531-533.

（收稿日期：2015-01-19）

（修回日期：2015-01-29；編輯：陳靜）