堿式法對板栗多糖提取的優化研究

張澤俊，汪武春，李 燕，馬元鏗，師 睿，陳祥剛

(1.昭通學院 化學與生命科學學院， 云南 昭通 657000； 2.昭通市昭陽區 北閘中學， 云南 昭通 657000)

●化學與環境資源研究

堿式法對板栗多糖提取的優化研究

張澤俊1，汪武春1，李 燕1，馬元鏗1，師 睿1，陳祥剛2

(1.昭通學院 化學與生命科學學院， 云南 昭通 657000； 2.昭通市昭陽區 北閘中學， 云南 昭通 657000)

以昭通市售板栗板栗粉為原料,采用堿提取法對板栗干粉中多糖進行提取.經sevage試劑除去蛋白質、乙醇沉淀、有機溶劑(無水乙醇、丙酮、石油醚)洗滌脫去脂肪后用蒽酮-硫酸溶液比色法測定其含量，通過單因素實驗法在以固定的料液比(1∶40)、原料粒徑(過80目分樣篩)分別研究不同濃度、時間、溫度條件下的最優提取參數.結果表明：最佳提取參數為：提取濃度0.5mol/l、提取時間90min、提取溫度80℃，在最佳的提取參數下浸提一次的提取率高達26.47%.

板栗； 多糖； 堿式提取； 優化研究

1 引言

板栗(Castanea mollissima)，又名栗子、毛栗、風栗，是殼斗科栗屬植物，原產于中國，分布極其廣泛，栗子生命力強，易存活，雌雄同株，適應生長于海拔370—280 0m的地區，多見于山地，目前我國板栗已被命名的品種多達300余個，但主要可分為兩大品種類型，即北方板栗和南方板栗，現已由人工大量栽培.其人工種植板栗多為野生板栗雜交培養后的改良品種，因個大、味甜、抗病性強，已成為山區農民主要農產品經濟收入之.板栗屬于堅果類，是我國的特產果品之一，其果實秋季成熟時采收，營養價值高，素有“干果之王”的美譽，與桃、杏、李、棗并稱“五果”，國外稱之為“健康食品”，民間常將其與棗、柿并稱“鐵桿莊稼”或“木本糧食”可代糧食用.對其營養成分進行分析測定后得知，其果實含水量高達40%左右，蛋白質含量為5.7%—10.7%，脂肪含量為2.0%—7.4%，淀粉含量高達50%左右，并含有多種維生素(如維生素A、維生素B1、維生素B2、維生素C)和礦物質(如P、K、Ca、Fe、Zn等)[1].板栗不但具有較高的經濟價值和營養價值，而且藥用價值也很高，其性能自古以來便受到人們的重視，許多醫學典籍中也多有論述.中醫認為，板栗味甘、性溫，有健脾胃、益氣、補腎、壯腰、強筋、止血和消腫強心的功效，老少皆宜，適合于腎虛引起的腰膝酸軟、腰腿不利、小便增多以及脾胃虛寒引起的慢性腹瀉、外傷后引起的骨折、瘀血腫痛、筋骨疼痛、尿血、便血等癥.板栗中所含的豐富不飽和脂肪酸和維生素，能防治高血壓病、冠心病和動脈硬化等疾病是抗衰老、延年益壽的滋補佳品，堪與人參、黃芪、當歸等名貴中藥材相媲美且價格低廉，因此備受歷代醫家的推崇.唐代大醫學家孫思邈稱栗子為“腎之果也，腎病宜食之”.

多糖(polysaccharide)不是一種純粹的化學物質，而是一類分子結構復雜聚合程度不同且龐大的糖類混合物質.是由糖苷鍵結合的糖鏈，多個組成的聚合糖高分子碳水化合物及其衍生物，可用通式(C6H10O5)n表示.由相同的單糖組成的多糖稱為同多糖，也稱均一性多糖.如淀粉、纖維素和糖原；以不同的單糖組成的多糖稱為雜多糖或不均一性多糖，如阿拉伯膠是由戊糖和半乳糖等組成.多糖類一般不溶于水，無甜味，不能形成結晶，最終完全水解得到單糖.

多糖在自然界分布極廣，亦很重要.近些年的研究發現，多糖不僅僅是機體儲存能量的物質，而且具有一系列重要的生物學功能，在臨床作用中有增強機體免疫力、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗病毒、抗衰老、抗輻射、抗疲勞、抗炎、鎮痛、抗潰瘍、預防急性腎衰、抗凝血等功效[2-3].如肽聚糖和纖維素，是構成動植物細胞壁的組成成分；糖原和淀粉是動植物儲藏的養分；人體中的肝素有抗凝血作用，肺炎球菌細胞壁中的多糖有抗原作用；劉敏等從植物中獲得一種具有良好的保濕、抗皺等作用的酸性雜多糖[4]；板栗是世界上多糖含量較高的果實之一，越來越受人們的關注，近年來國內外均有對板栗及板栗殼多糖提取工藝和相關生物性質的文獻報道.如李潤豐，刁華娟等[5]對板栗多糖的提取及抗氧化活性研究；楊利劍[6]板栗多糖的提取 、 成分分析及活性測定.目前我國對多糖的提取方面研究較為深入，主要采用方法有超聲波輔助提取技術[7-10]熱水浸提[11-13]酸提取[14-16]堿提取[17-19]酶解[20]微波提取[21-22]醇提取法[23]等本文采用堿提取法對板栗多糖的提取優化研究.

2 材料與方法

2.1 材料

原材料：板栗(昭通市售).

主要試劑：葡萄糖、氫氧化鈉、活性炭、三氯甲烷、正丁醇、丙酮、石油醚、蒽酮、濃硫酸、無水乙醇均為分析純，去離子水.

主要儀器：80目分樣篩、電熱鼓風干燥箱(上海-恒科學儀器有限公司)、HH-S型恒溫水浴鍋、高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)、電子天平、SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵、WFJ-7200型可見分光光度計(上海尤尼科儀器有限公司)、移液槍.

2.2 方法

2.2.1 板栗多糖的提取流程如下

板栗→剝殼去衣→烘干→粉碎過篩→提取→離心→脫色→過濾→濃縮→除蛋白質→乙醇沉淀→離心→洗滌→干燥

2.2.2 樣品預處理

將市板栗剝殼去皮后置于電熱鼓風干燥箱中50℃下烘干至恒重，粉碎過80目分樣篩，裝入密封袋備用.

2.2.3 板栗多糖的提取

參照文獻[24]的方法準確稱取經預處理后的板栗干粉1.000 0g，以1∶40的料液比(m/v)加入用去離子水精準配置好的，一定濃度的氫氧化鈉溶液.按不同的氫氧化鈉濃度、提取時間、提取溫度為實驗因素做單因素試驗，進行多糖的提取.離心5min(6 000r/min)除去細渣，上清液加入活性炭脫色離心去渣，重復脫色3次，清液至于電熱鼓風干燥箱中60℃濃縮至粘稠，移至分液漏斗中加入sevage試劑(三氯甲烷：正丁醇=4∶1，v/v)充分振蕩搖勻后靜置分層，棄去下層液，反復操作至無蛋白質即繼續加入sevag試劑下層不在出現灰白色黏液為止.上清液加入2倍體積的無水乙醇，5℃沉淀過夜.離心5min(6 000r/min)除去清液，沉淀物分別用無水乙醇、丙酮、石油醚洗滌多次除去脂肪，電熱鼓風干燥箱中65℃烘干稱重.

2.3 多糖含量的測定參考文獻[24-26]

2.3.1 標準溶液的配置

準確稱取經干燥至恒重的葡萄糖0.250 0g，用去離子水溶解并移至250mL容量瓶中搖勻、定容、標定至刻度線，得萄糖標準溶液.用移液槍分別移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的標準溶液依次置于6支試管中，并編號，再分別加入去離子水稀釋至10mL，搖勻備用.

2.3.2 標準曲線的繪制

圖1 葡萄糖的標準曲線

分別移取1mL上述稀釋后的葡萄糖標準溶液于試管中，編號，以1mL去離子水作為空白對照組，再向每支試管中加入4mL現配置的0.2%的蒽酮-硫酸溶液(0.200g蒽酮溶于100mL濃硫酸)，立即振蕩搖勻，冷卻至室溫，置于沸水浴鍋中反應5min后取出置于裝有冷水的燒杯中冷卻至室溫，靜置5min后，在620nm波長下分別測出其吸光度，記錄數據，以葡萄糖的質量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，做回歸處理，繪制標準曲線如圖1，并求出回歸方程Y=0.006 0X+0.033 9(相關系數R2=0.991 1).

2.3.3 板栗多糖含量的測定

將提取所得的樣品用去離子水溶解至1 000mL容量瓶中定容，用移液槍移取1mL于100mL容量瓶中定容，然后分別移取1mL與三支試管中做平行測定，以1mL去離子水做空白對照，分別加入4mL蒽酮-硫酸溶液，按標準曲線的測定方法測定樣品溶液的吸光度，根據標準溶液的回歸方程求出多糖含量.

2.3.4 板栗多糖提取率的計算

計算公式：提取率=m提取物/m原料×100%

2.4 堿式法提取板栗多糖的參數工藝優化

2.4.1 單因素試驗

分別稱取相同質量的板栗干粉，在固定的料液比(板栗干粉∶氫氧化鈉溶液=1∶40，m/v)[20]，來研究不同濃度、提取時間、溫度對堿式法提取板栗多糖效果的影響，從而研究板栗多糖提取條件的最佳優化.

2.4.2 不同的提取液濃度

準確稱取1.000 0g經處理后的板栗干粉7份，在料液比為1∶40，提取溫度為70℃，提取時間為90min的相同條件下，分別以不同濃度的氫氧化鈉溶液(0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、3.5mol/L)為變量，進行板栗多糖的一次性提取，按2.2.1中的優化流程操作完成，并計算提取率.

2.4.3 不同的提取時間

準確稱取1.000 0g經處理后的板栗干粉4份，在料液比為1∶40，提取溫度為70℃，2.4.2中提取率最高的氫氧化鈉溶液濃度即1.5mol/L的相同條件下，分別以不同的提取時間(30min、60min、90min、120min)為變量進行板栗多糖的一次性提取，按2.2.1中的優化流程操作完成，并計算提取率.

2.4.4 不同的提取溫度

準確稱取1.000 0g經處理后的板栗干粉4份，在料液比為1∶40，1.4.1和2.4.3中提取率最高的提取時間90min、氫氧化鈉溶液濃度1.5mol/L的相同條件下，分別以不同的提取溫度(55℃、70℃、80℃、95℃)為變量進行板栗多糖的一次性提取，按2.2.1中的優化流程操作完成，并計算提取率.

3 結果與分析

3.1 不同提取液濃度對板栗多糖提取率的影響

由圖2可以看出在氫氧化鈉溶液濃度為0.5-1.0mol/L之間，多糖的提取率增長幅度較大，在1.5mol時出現峰值，之后大幅度降低，由此說明堿式法對板栗多糖的優化提取最適濃度參數為1.5mol/L.

圖2 氫氧化鈉溶液濃度對多糖提取率的影響

3.2 不同的提取時間對板栗多糖提取率的影響

由圖3可以看出提取時間小于90min之間，多糖的提取率隨著時間的增加而逐漸增大，在90min時提取率最大，之后逐漸降低，由此說明堿式法對板栗多糖的優化提取最適提取時間參數為90min.

圖3 提取時間對多糖提取率的影響

3.3 不同的提取溫度對板栗多糖提取率的影響

由圖4可以看出提取溫度在80℃之前，隨著提取溫度的不斷升高多糖的提取率也隨之增大，且在80℃時最大，之后隨溫度的升高而大幅度降低，由此說明堿式法對板栗多糖的優化提取最適提取溫度參數為80℃.

圖4 提取溫度對多糖提取率的影響

4 結論與討論

本實驗采用堿提法對板栗多糖的一次性提取進行了初步研究，以過80目分樣篩板栗干粉1.000 0g，1∶40的料液比為固定値，設置不同的濃度(氫氧化鈉溶液mol/L)、溫度、時間為變量做單因素實驗，研究板栗多糖提取的最優條件參數.結果表明：板栗多糖的一次性提取最優參數為：堿溶液濃度1.5mol/L，提取時間為90min，提取溫度為80℃.該試驗僅為此方法的初步研究，堿提法下影響板栗多糖提取效果的因素還有很多，如料液比、樣品顆粒大小、提取次數及這些因素影響力大小的正交試驗等都還需我們經一步的研究.

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Optimization for Alkali Type Method Extraction of Castanea mollissima Polysaccharide

ZHANG Ze-jun1, WANG Wu-chun1, LI Yan1, MA Yuan-keng1, SHI Rui1, CHEN Xiang-gang2

(1.School of Chemistry and Life Science, Zhaotong University, Zhaotong 657000， China; 2.Beizha Middle School, Zhaotong 657000， China)

zhaotong’s chestnut powder as raw material, it’s polysaccharide were extracted with alkali method. By sevage reagent to remove protein, ethanol precipitation, organic solvents, anhydrous ethanol, acetone and petroleum ether. after washing to take off fat by anthrone colorimetry of sulfuric acid solution-determination of its content, through the single factor experiment method in fixed ratio (1∶40), particle size of material liquid sample (80 mesh sieve) study of different concentration, time, temperature under the condition of the optimal extraction parameters.The results show that the optimal extraction parameters for the extraction of the concentration of 0.5mol/L, 90min extraction time, extraction temperature 80℃, under the optimal extraction parameters extraction a withdrawal rate is as high as 26.47%.

Castanea mollissima; Polysaccharides; Alkali extraction; Optimization

2016-08-18

云南省科技廳應用基礎研究項目(青年項目)(2013FD057).

張澤俊(1983— )，男，云南昭通人，講師，碩士，主要從事功能材料的合成與色譜分析研究.

TS255.1

A

2095-7408(2016)05-0043-04