低成本原料發酵生產生物表面活性劑及其特性研究

李慧娟，丁　瑞，孫云鵬，朱孔福，薛　晉，劉紅藝，李譽琦

(山東科技大學化學與環境工程學院，山東 青島 266590)

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低成本原料發酵生產生物表面活性劑及其特性研究

李慧娟，丁瑞，孫云鵬，朱孔福，薛晉，劉紅藝，李譽琦

(山東科技大學化學與環境工程學院，山東 青島 266590)

摘要：以低成本的泔水油和豆粕為碳、氮源，發酵培養不動桿菌菌株XH-2(Acinetobacter sp.XH-2)生產生物表面活性劑。以表面張力及排油圈直徑為考察指標，對菌株XH-2產生物表面活性劑的發酵條件進行單因素優化，并研究了該生物表面活性劑的穩定性。結果表明，菌株XH-2在最優培養基(泔水油3%、豆粕5%、氯化鎂 2%、磷酸氫二鉀 6%、磷酸二氫鉀 3.8%、三氯化鐵0.5%、氯化鈉2%和初始pH值6.0)中發酵培養2 d后，所產的生物表面活性劑的臨界膠束濃度為200 mg·L-1，其使發酵液的表面張力由73.01 mN·m-1降至25.25 mN·m-1，具有廣泛的溫度、pH值和鹽度適應性，初步的成分分析結果表明該生物表面活性劑可能為糖脂類。

關鍵詞：不動桿菌；生物表面活性劑；發酵條件優化；特性

生物表面活性劑(biosurfactants)是微生物(主要有假單胞菌屬[1]、芽孢桿菌屬[2-3]和酵母菌[4]等)在代謝過程中產生的一類集親水基和疏水基于一體的兩親化合物，具有一定的界面活性；主要包括糖脂、磷脂、脂肽、脂肪酸、多糖-脂類復合物和中性脂等，已知的生物表面活性劑以糖脂為主[5-6]。與化學表面活性劑相比，生物表面活性劑具有降低溶液表面張力、增加泡沫、低毒或無毒、可生物降解、無污染、生物相容性良好、乳化性高、表面活性高以及可引入化學法難以合成的化學基團等優點[7]。因此，生物表面活性劑已在石油、洗滌、醫藥、化妝品等領域得到廣泛的應用，尤其在修復被石油污染的土壤[8-10]、提高原油采收率[11]等方面。然而，通過微生物合成生物表面活性劑因受產量低、成本高等因素的制約，尚未能實現真正的商業化生產，尋找并利用營養豐富的廉價原料作為發酵基質逐漸成為研究的熱點[12]。開發利用工農業廢料[13]、非食用油、餐飲廢油[14]生產生物表面活性劑，不但可緩解環境壓力，變廢為寶，還可降低生產成本。

作者在此以低成本的泔水油、豆粕作為發酵培養基的碳、氮源，對本實驗室篩選的不動桿菌菌株XH-2(Acinetobactersp.XH-2)產生物表面活性劑的發酵條件進行優化，并對菌株所產的生物表面活性劑的性質及成分進行研究，擬為后續的應用開發奠定理論基礎。

1實驗

1.1　培養基與儀器

種子培養基：酵母提取物 0.5%、蛋白胨1%、氯化鈉1%。

基礎培養基：氯化鎂 2%、磷酸氫二鉀 6%、 磷酸二氫鉀3.8%、三氯化鐵 0.5%、氯化銨 5%。

HZQ-F160型振蕩培養箱，哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；WFJ7200型分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；JK9913型全自動張力儀，上海中晨數字技術設備有限公司；Nicolet-380型傅立葉變換紅外光譜儀，美國ThermoFisher公司。

1.2　生物表面活性劑發酵條件的優化

1.2.1生物表面活性劑表面活性的測定

排油圈直徑的測定：參照Chandankere等[15]的方法，略有改進。取一培養皿，加入60mL蒸餾水、5mL液體石蠟和少量蘇丹Ⅲ溶液，形成均勻的油膜。在油膜中心垂直滴加1mL離心后的發酵液上清液，油膜被擠向四周形成一個圓圈，測量其直徑。排油圈直徑與生物表面活性劑含量成正比。

表面張力的測定：將發酵液于10 000r·min-1離心20min，取上清液利用圓環法測定表面張力。

1.2.2碳源對菌株產生物表面活性劑的影響

在基礎培養基中分別添加淀粉、乳清粉、蔗糖、葡萄糖、玉米芯、柴油、甘油、防腐油、泔水油，濃度均為2%；確定最適碳源后，設置碳源的濃度梯度為1%、2%、3%、4%、5%；等量接種菌株XH-2于30 ℃、160r·min-1條件下搖瓶發酵培養2d，取離心后的發酵液上清液測定排油圈直徑及表面張力，確定菌株XH-2發酵培養基的最佳碳源及其濃度。

1.2.3氮源對菌株產生物表面活性劑的影響

在添加優化碳源的基礎培養基中，分別以濃度為2%的蛋白胨、豆粕、酵母提取物(酵提)、硝酸鈉、氯化銨、硫酸銨、尿素為氮源替換原有的氯化銨；確定最適氮源后，設置氮源的濃度梯度為0.5%、1%、2%、3%、5%；等量接種菌株XH-2于30 ℃、160r·min-1條件下搖瓶發酵培養2d，取離心后的發酵液上清液測定排油圈直徑及表面張力，確定菌株XH-2發酵培養基的最適氮源及其濃度。

1.2.4接種量對菌株產生物表面活性劑的影響

取優化碳、氮源后的基礎培養基，將菌株XH-2接種量(V/V，下同)分別設置為1%、2%、4%、6%、8%，在30 ℃、160r·min-1條件下搖瓶發酵2d，取離心后的發酵液上清液測定排油圈直徑及表面張力，確定菌株XH-2的最佳接種量。

1.2.5鹽度對菌株產生物表面活性劑的影響

按4%接種量接種菌株XH-2于添加不同濃度氯化鈉的優化后的培養基中，在30 ℃、160r·min-1條件下搖瓶發酵2d，取離心后的發酵液上清液測定排油圈直徑及表面張力，確定菌株XH-2發酵培養基的最適鹽度。

1.2.6初始pH值對菌株產生物表面活性劑的影響

用1mol·L-1HCl溶液或1mol·L-1NaOH溶液調節優化后的培養基，使其初始pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在30 ℃、160r·min-1條件下搖瓶發酵2d，取離心后的發酵液上清液測定排油圈直徑及表面張力，確定菌株XH-2發酵培養基的最適初始pH值。

1.3　生物表面活性劑的特性分析

1.3.1生物表面活性劑的制備

將菌株XH-2在優化后的培養基中發酵培養60h，經紗布初過濾的發酵液在4 ℃、10 000r·min-1下離心20min，取上清液用6mol·L-1HCl溶液調節pH值至2.0，用等體積的乙酸乙酯溶液萃取2次，合并有機相于旋轉蒸發儀上濃縮，將濃縮液倒入燒杯中，待自然揮發干后即得生物表面活性劑粗品[16]。

1.3.2生物表面活性劑對溫度、pH值和鹽度的耐受性

將生物表面活性劑粗品配制成濃度為0.3g·L-1的溶液，分別在4 ℃、室溫、60 ℃、100 ℃條件下處理30min，冷卻至室溫，測定其表面張力。

用1mol·L-1HCl溶液或1mol·L-1NaOH溶液調節生物表面活性劑溶液的pH值分別為2、4、6、8、10、12，均于室溫下放置12h，測定其表面張力。

加入適量氯化鈉使生物表面活性劑溶液的鹽度分別為0%、1%、3%、5%、7%、9%，均于室溫下放置12h，測定其表面張力。

1.3.3臨界膠束濃度(CMC)的測定

用蒸餾水將生物表面活性劑粗品配制成不同濃度的溶液，在室溫下測定其表面張力。根據生物表面活性劑濃度與表面張力的變化曲線圖得出臨界膠束濃度。

1.3.4生物表面活性劑成分的初步鑒定

表面活性劑的鑒定：采用亞甲基藍-氯仿實驗。將生物表面活性劑粗品配制成濃度為0.3 g·L-1的溶液，取5 mL表面活性劑溶液，依次加入10 mL亞甲基藍和5 mL氯仿，充分混勻，靜置幾分鐘后觀察其顏色。若氯仿層顏色變深，而水層幾乎無色，表明樣品屬于陰離子型表面活性劑；若水層顏色變深，而氯仿層幾乎無色，表明樣品屬于陽離子型表面活性劑；若兩層顏色大致相同，且水層呈乳液狀，表明樣品屬于非離子型表面活性劑。

定性分析：將生物表面活性劑粗品配制成一定濃度的溶液，用1 mol·L-1HCl溶液調節pH值到2左右，于4 ℃靜置過夜，觀察現象。若產生白色沉淀，表明其為脂肽或脂蛋白類表面活性劑；若沒有白色沉淀產生，表明其為糖脂類表面活性劑[17]。

紅外光譜(FTIR)分析：將生物表面活性劑粗品用KBr壓片法進行紅外光譜分析。

2結果與討論

2.1　不同碳、氮源對菌株XH-2產生物表面活性劑的影響(圖1)

圖1　碳、氮源對菌株XH-2產生物表面活性劑的影響

由圖1a可知，菌株XH-2以柴油為碳源時，發酵液的排油圈直徑為0；以泔水油為碳源時，排油圈直徑最大(5.1 cm)，相對應的表面張力最小(31.1 mN·m-1)。相較于葡萄糖、淀粉、甘油這些常用碳源，泔水油用作產生物表面活性劑的原料尚未見報道。以泔水油為原料生產生物表面活性劑，既能廢物利用，又節能環保，具有顯著的現實意義。由圖1b可知，當泔水油濃度為3%時，表面張力最小(30.49 mN·m-1)，排油圈直徑最大(4.8 cm)。因此，確定最適碳源為3%泔水油。

由圖1c可知，以豆粕為氮源時，發酵液的表面張力最小(29.69 mN·m-1)，相對應的排油圈直徑最大(6.1 cm)；當采用無機氮源尿素和硫酸銨時，雖然發酵液的表面張力較小，分別為30.62 mN·m-1和30.56 mN·m-1，但相對應的排油圈直徑也小，分別為3.75 cm和3.25 cm。已有利用無機氮源(如氯化銨[18]、硝酸鈉[19]等)進行發酵生產生物表面活性劑的相關報道，而在本研究中最適的氮源是豆粕。由圖1d可知，隨著豆粕濃度的增大，排油圈直徑增大，在豆粕濃度為5%時，排油圈直徑達到最大(6.75 cm)，表面張力最小(25.83 mN·m-1)。因此，確定最適氮源為5%豆粕。

2.2　最佳接種量、鹽度、初始pH值的確定(圖2)

接種量影響微生物所產生物表面活性劑的產量。接種量過大，培養液中細菌的初始濃度高，過量的菌體在生長過程中因消耗大量的營養底物而使生物表面活性劑的產量降低；接種量過小，培養液中菌體濃度低，培養周期延長。由圖2a可知，在接種量為4%時，表面張力最小(30.39 mN·m-1)，相對應的排油圈直徑最大(5.25 cm)；接種量超過4%后，表面張力增大。因此，確定最佳接種量為4%。

圖2接種量(a)、鹽度(b)和初始pH值(c)對菌株XH-2產生物表面活性劑的影響

Fig.2Effect of inoculum size(a),salinity(b) and initial pH value(c) on biosurfactant produced by strain XH-2

鹽度調節細胞內外的滲透壓，影響微生物的新陳代謝和酶的活性，鹽度過高或過低都會對微生物的新陳代謝產生不利影響。由圖2b可知，鹽度為2%時，表面張力最小(25.75 mN·m-1)，排油圈直徑最大(7.25 cm)；而鹽度低于或高于2%時，發酵液的表面張力增大，排油圈直徑減小。因此，確定菌株XH-2產生物表面活性劑的最適鹽度為2%。

微生物的生命代謝活動與環境的pH值密切相關。微生物機體內的生物化學反應一般是酶促反應，參與反應的酶都有其相應的最適pH值范圍，一般認為pH值6.5～8.5有利于微生物產生物表面活性劑[20]。由圖2c可知，菌株XH-2在初始pH值5.0～10.0范圍內，其表面張力基本上是先減小后增大。當初始pH值為6.0時，發酵液的排油圈直徑最大(7.1 cm)，表面張力最小(25.25 mN·m-1)；當初始pH值為10.0時，發酵液的排油圈直徑最小(5.2 cm)，表面張力為26.91 mN·m-1。因此，確定菌株XH-2產生物表面活性劑發酵培養基的最適初始pH值為6.0。

2.3　生物表面活性劑的耐受性

生物表面活性劑在實際應用中的環境比較復雜，因而必須具有較好的溫度、pH值和鹽度的耐受性和穩定性。菌株XH-2產生物表面活性劑在不同溫度、pH值和鹽度條件下的穩定性變化情況見表1。

表1溫度、pH值和鹽度對生物表面活性劑穩定性的影響

Tab.1 Effect of temperature,pH value and salinity on the stability of biosurfactant

由表1可知，菌株XH-2所產生物表面活性劑在4 ℃、室溫、60 ℃、100 ℃條件下，處理30 min后的表面張力變化不大，均在31.72~33.12 mN·m-1范圍內，表明其具有良好的溫度穩定性，且對高溫具有一定的耐受性。菌株XH-2所產生物表面活性劑在不同pH值條件下處理12 h后，其表面張力的變化很小，均在31.37~32.07 mN·m-1范圍內，表明該生物表面活性劑對pH值的耐受范圍較寬。在鹽度低于9%時，菌株XH-2所產生物表面活性劑都有表面活性，且表面張力維持在相對穩定的范圍(30.39~33.57 mN·m-1)內，表明該生物表面活性劑對鹽度有一定的耐受能力，可應用于高礦化度環境中。

2.4　生物表面活性劑臨界膠束濃度的確定

臨界膠束濃度(CMC)是表面活性劑分子在溶劑中締合形成膠束的最低濃度，當溶液達到CMC時，溶液的表面張力降至最低，此時再提高表面活性劑濃度，溶液的表面張力也不再降低，而是形成大量膠團。CMC是表面活性劑的一種量度，其值越低，表明該表面活性劑形成膠團所需的濃度越低，表面活性越高[21]。通過測定不同濃度生物表面活性劑溶液的表面張力來確定CMC，結果見圖3。

圖3　菌株XH-2所產生物表面活性劑臨界膠束濃度的測定

由圖3可知，生物表面活性劑濃度從0 mg·L-1升至50 mg·L-1時，表面張力從75 mN·m-1快速降至38.58 mN·m-1；隨著生物表面活性劑濃度的增加，表面張力略有降低；當生物表面活性劑濃度達到200 mg·L-1時，表面張力降至33.12 mN·m-1；當生物表面活性劑濃度高于200 mg·L-1后，表面張力幾乎不再下降；因此，該生物表面活性劑的CMC值為200 mg·L-1。常用的化學表面活性劑如十二烷基磺酸鈉(SDS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的CMC值分別為2 120 mg·L-1、1 300 mg·L-1[22]。相比較而言，該生物表面活性劑的CMC值明顯低于常用化學表面活性劑，表明其具有良好的表面活性，更利于實際應用。

2.5　生物表面活性劑的鑒定

將生物表面活性劑溶液與亞甲基藍-氯仿試劑混合均勻，靜置幾分鐘后進行觀察。發現水層顏色變深，表明發酵液中的生物表面活性劑為陽離子型表面活性劑。將生物表面活性劑溶液用鹽酸溶液調pH值至2靜置過夜，結果無白色沉淀產生，表明XH-2菌株所產生物表面活性劑可能為糖脂類。

菌株XH-2所產生物表面活性劑的紅外光譜如圖4所示。

圖4菌株XH-2所產生物表面活性劑的紅外光譜

Fig.4FTIR Spectrum of biosurfactant produced by strain XH-2

由圖4可看出，3 389.6 cm-1附近出現了強而寬的吸收峰，表明該分子中存在大量-OH；2 924.1 cm-1和2 853.8 cm-1處為脂肪族C-H的振動吸收峰，而1 459.9 cm-1附近的吸收峰由碳鏈分子上連續的C-H振動引起；1 671.1 cm-1處的吸收峰來自羰基的伸縮振動；1 727.8 cm-1附近有較強且尖的吸收峰，表明有酯基存在；1 074.3 cm-1與1 025.3 cm-1處的吸收峰來自C-O-C鍵的伸縮振動，表明該分子中存在羧酸酯基團。由紅外光譜分析結果和相關文獻[23-24]可初步推斷該生物表面活性劑為糖脂類化合物，但由于其分子結構復雜，具體結構還有待進一步研究。

3結論

以低成本的泔水油和豆粕為碳、氮源，發酵培養不動桿菌菌株XH-2(Acinetobactersp.XH-2)生產生物表面活性劑。菌株XH-2產生物表面活性劑的最佳碳、氮源分別為3%泔水油和5%豆粕；最佳接種量、鹽度和初始pH值分別為4%、2%和6.0。菌株XH-2在優化后的培養基中發酵培養，發酵液的表面張力由73.01 mN·m-1降至25.25 mN·m-1。

菌株XH-2所產生物表面活性劑具有溫度、pH值和鹽度穩定性，其臨界膠束濃度為200 mg·L-1，明顯低于常用的化學表面活性劑，具有良好的工業應用價值。

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生態保護有你有我

——《化學與生物工程》編輯部

Production and Characterization of Biosurfactant Produced by

Acinetobactersp.XH-2 from Low-Cost Raw Materials

LI Hui-juan,DING Rui,SUN Yun-peng,ZHU Kong-fu,XUE Jin,LIU Hong-yi,LI Yu-qi

(CollegeofChemicalandEnvironmentalEngineering,ShandongUniversity

ofScienceandTechnology,Qingdao266590,China)

Abstract：Using low-cost swill oil and soybean meal as carbon and nitrogen source,the biosurfactant was produced by fermentation with Acinetobacter sp.XH-2.The fermentation conditions were optimized by drop-collapse test and surface tension test.The stability of biosurfactant was also explored.Results showed that critical micelle concentration of biosurfactant produced by strain XH-2 was 200 mg·L-1after fermentation for 2 d and the surface tension of the broth was reduced from 73.01 mN·m-1to 25.25 mN·m-1under the optimized fermentation conditions:swill oil 3%,soybean meal 5%,MgCl22%,K2HPO46%,KH2PO43.8%,FeCl30.5%,NaCl 2% and initial pH value 6.0.The biosurfactant was stable over wide temperature,pH value and salinity.Preliminary component analysis results indicated that the biosurfactant might belong to glycolipids.

Keywords：Acinetobacter;biosurfactant;fermentation condition optimization;characterization

中圖分類號：TQ 920.6

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)01-0043-06

收稿日期：2015-07-01

作者簡介：李慧娟(1970-)，女，內蒙古呼倫貝爾人，博士研究生，副教授，研究方向：生物化工，E-mail：lihuijuan611@126.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.01.011