連梅顆粒對糖尿病大鼠腹部脂肪組織中NF-κB及IKKβ蛋白表達的影響※

● 米 佳 王秀閣 陳 曦 王國強 朱浩宇 樸春麗

連梅顆粒對糖尿病大鼠腹部脂肪組織中NF-κB及IKKβ蛋白表達的影響※

● 米 佳*王秀閣 陳 曦 王國強 朱浩宇 樸春麗▲

目的：觀察連梅顆粒對自發性糖尿病大鼠腹部脂肪組織中NF-κB及IKKβ蛋白表達的影響。方法：將高脂飼料喂養的雄性SPF級ZDF(Zucker Diabetic Fatty rat)大鼠隨機分為模型組、連梅顆粒組、吡格列酮組，普通飼料喂養的雄性SPF級ZL(Zucker Lean)大鼠為正常對照組，每組各10只。連梅顆粒組按照5.1g·kg-1灌胃給藥，吡格列酮組按照1.07mg·kg-1灌胃給藥，連續給藥12周。經Western blot法檢測各組大鼠腹部脂肪組織中NF-κB、IKKβ蛋白的表達水平。結果：在治療第12周末，模型組、吡格列酮組、連梅顆粒組大鼠腹腔脂肪組織中NF-κB、IKKβ蛋白的表達明顯高于正常對照組(P<0.01)。連梅顆粒組和吡格列酮組與模型組相比均明顯降低(P<0.01，P<0.05)，且連梅顆粒組優于吡格列酮組(P<0.05)。結論：連梅顆粒組在一定程度上能抑制糖尿病大鼠腹部脂肪組織中NF-κB及IKKβ蛋白的表達。

連梅顆粒 ZDF大鼠 NF-κB IKKβ 糖尿病

糖尿病是一種由多種原因引起的糖、脂肪、蛋白質代謝紊亂綜合征[1]。在我國成人糖尿病人數已超過9200萬，并且糖尿病前期患者約有1.48億[2]。根據預測到2025年患病率將達到5.4%[3]。2013年，全球有510萬人死于糖尿病相關性疾病，占所有死亡人數的8.39%，而糖尿病醫療花費占全球醫療支出的11%。以糖尿病為代表的慢性疾病已經成為導致人口死亡的主要原因，嚴重威脅著人民健康安全。若糖尿病早期及時有效治療，可預防及延緩并發癥的發生，延緩病情進展。胰島素抵抗及胰島功能受損是2型糖尿病(T2DM)發病的兩個基本環節[4]。因此，深入研究能夠改善胰島素抵抗及胰島功能受損的藥物，對于防治糖尿病及其并發癥具有重要意義。此次動物實驗旨在已有的前期研究基礎上，進一步深入探討連梅顆粒對自發性糖尿病大鼠腹腔脂肪組織中NF-κB、IKKβ蛋白表達的影響，探討本方治療T2DM的作用機制，為糖尿病的中醫治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級9周齡雄性ZDF大鼠，體重(244～291)g；SPF級9周齡雄性ZL大鼠，體重(183～220)g，均購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證：SCXK(京)2014-0003。大鼠在北京中醫藥大學基礎醫學院實驗室中飼養，實驗室溫度20～22℃，相對濕度55±5%，12/12小時光照黑暗循環。適應環境1周后開始實驗。

1.1.2 實驗藥物 連梅顆粒，長春中醫藥大學附屬醫院顆粒藥房提供；吡格列酮，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司提供(批號：國藥準字H20040631)。

1.1.3 實驗試劑 鼠NF-κB單克隆抗體(批號：PW2-3)、兔IKKβ多克隆抗體(批號：PW2-3)、Anti-GAPDH(批號：25007)均購于美國CST公司；蛋白裂解液+苯甲基磺酰氟(批號：P0013B)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0006)均購于上海碧云天生物技術公司。

1.1.4 實驗儀器 調節臺式高速低溫離心機(HERAEUS Fresco 17，Thenno Scientific，USA)；溫控震蕩儀(Thenno Scientific，USA)；電泳儀、電泳及電轉移裝置(PowerPac Basic，Bio-Rad，USA)；酶標儀(Model 550 Microplate Reader，Bio-Rad ，USA)；凝膠圖像處理系統(Tanon GIS-1000，上海)。

1.2 動物模型的制作 ZDF大鼠予普通飼料適應性喂養1周后，予高脂飼料#5008(購于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號：SCXK(京)2009-0008，粗脂肪6.5%、粗蛋白23.5%)喂養。大鼠定期行糖耐量實驗，試驗前禁食不禁水15h，剪尾取血用微量血糖儀測空腹血糖后，予30%葡萄糖溶液按2g·kg-1灌胃[5]。糖負荷后分別在0.5h、1h、1.5h和2h剪尾取血，用血糖儀測量血糖。當血糖峰值高于16.7mmol·L-1和/或糖負荷后2h高于11.1mmol·L-1時，可診斷為糖尿病或糖耐量減低，表明造模成功。

1.3 分組及給藥方法 將造模成功的ZDF大鼠30只隨機分為模型組、連梅顆粒組、吡格列酮組3組，每組各10只，10只ZL大鼠為正常對照組。將連梅顆粒和吡格列酮分別配置成混懸液，造模成功后，連梅顆粒使用時按照5.1g·kg-1體重(前期工作已確定的最佳劑量)混懸液灌胃，吡格列酮組按照1.07mg·kg-1體重灌胃，正常對照組和模型組均予等體積蒸餾水灌胃，各組大鼠均連續灌胃12周，每日1次。用藥治療期間正常對照組大鼠飼以普通飼料，其它組飼以高脂飼料，自由進食、飲水，每周稱重，根據體重調整灌胃劑量。

1.4 標本采集 給藥12周后，將大鼠處死后打開腹腔，迅速取出腹部脂肪組織，把組織剪切成細小的碎片，PMSF與PIPA裂解緩沖液以1∶100的比例加入組織中，渦旋振蕩，冰浴中用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解，將勻漿液其置于EP管中，4℃、13000rpm·nim-1離心30分鐘，收集中層清液，用于檢測NF-κB、IKKβ蛋白的表達。

1.5 Western-blot法檢測各組大鼠腹部脂肪組織NF-κB、IKKβ蛋白的表達 Western blot：裂解脂肪細胞并勻漿，離心取上清液，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，取樣品5uL，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜，Anti-NF-κB、Anti-IKKβ、Anti-GAPDH抗體稀釋液與膜充分接觸，4℃過夜，TBST中室溫脫色，放入二抗稀釋液，封閉，37℃孵育1h，顯影曝光、洗片，掃描儀掃描電泳調帶，軟件進行光密度值分析。

2 結果

在治療第12周末，模型組、吡格列酮組、連梅顆粒組大鼠腹腔脂肪組織中NF-κB、IKKβ蛋白的表達明顯高于正常對照組(P<0.01)。連梅顆粒組和吡格列酮組與模型組相比均明顯降低(P<0.01，P<0.05)，說明連梅顆粒和吡格列酮均有降低糖尿病大鼠腹腔脂肪組織NF-κB、IKKβ蛋白表達的作用，且連梅顆粒組優于吡格列酮組(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 western blot檢測各組大鼠腹部脂肪組織中NF-κB、

IKKβ蛋白的表達變化

注：與正常組相比*P<0.01，與模型組相比△P<0.01，△△P<0.05；與吡格列酮組相比，##P<0.05。

圖1 各組大鼠腹部脂肪組織中NF-κB、IKKβ蛋白的表達

(A．正常對照組；B．模型組；C．吡格列酮組；D．連梅顆粒組)

3 討論

課題組所在的團隊經10余年的臨床和動物實驗研究[6，7]證實，六郁和絡滯并存是導致肥胖型2型糖尿病的核心病機。六郁是指以肥甘滋膩之品滯脾礙胃(食郁)為先導而形成的氣郁、血郁、熱郁、痰郁、濕郁的病理狀態；膏、濁、痰、脂、瘀、毒化生，郁滯絡脈。絡滯是由六郁交互作用而形成絡脈郁滯的病理狀態。連梅顆粒主要由黃連、烏梅、大黃、麥冬、生地、干姜組成。黃連為君，其性大苦大寒，《本草衍義》云：“生物者氣也，成之者味也……氣堅則壯，故苦可以養氣。”《黃帝內經》曰：“寒傷形，熱傷氣。”消渴六郁化火，漸耗氣陰，氣因熱而傷，苦可養氣，取黃連苦寒之性以瀉熱，使邪去正安，其氣自復，故為君藥。臣用烏梅、大黃，烏梅性味酸溫，主收斂生津，與黃連相伍以苦酸制甜；大黃苦寒，助黃連瀉熱，并可除積行瘀。干姜辛溫，辛通入絡，合黃連辛開苦降以調暢氣機，使郁滯得除，且可反佐黃連、大黃苦寒之弊，以顧護陽氣；針對消渴陰虛為本的病機特點，以麥冬、生地養陰生津，三藥同為佐使。六藥合用，苦、酸、辛并施，通調結合，達到了燥濕瀉壅、養陰清熱、通調氣機的目的。

實驗結果表明，與空白對照組相比，糖尿病模型組大鼠腹部脂肪組織中NF-κB、IKKβ蛋白表達量顯著上調，連梅顆粒組在一定程度上能抑制糖尿病大鼠腹部脂肪組織中NF-κB、IKKβ蛋白的表達，這可能是連梅顆粒抑制炎癥信號通路的傳導而發揮其改善胰島素抵抗治療糖尿病的機制之一。這為我們以后開展中藥復方有效物質的研究提供了思路。

[1]陳艷芬，王春怡，李衛民，等.黃芪葛根湯對糖尿病心肌病大鼠氧化應激和NF-KB表達的影響[J].中成藥，2012，34(8)：1428-1432．

[2]中華醫學會糖尿病學分會.中國2型糖尿病防治指南/2013年版[S].中國糖尿病雜志，2014，22(8)：2-42.

[3]Shaw J E，Sicree R A，Zimmet P Z.Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030[J]. DiabetRes ClinPract，2010，87(1)：4-14.

[4]Lanuza-Masdeu J，Arevalo mI，Vila C，et al. In vivo JNK activation in pancreatic β-cells leads to glucose intolerance caused by insulin resistance in pancreas[J].Diabetes，2013，Jan 24.Epub ahead of print.

[5]Pick A，Clark J，Kubstrup C，et al．Role of apoptosis in failure of beta-cell mass compensation for insulin resistance and beta-cell defects in the male Zucker diabetic fatty rat [J]．Diabetes，1998，47(3)：358-64.

[6]王淑俊，樸春麗，劉禹辛.苦酸通調I號方治療肥胖型2型糖尿病40例臨床觀察[J].中華實用中西醫雜志，2009，22(4)：221-222.

[7]樸春麗，鄧 悅，米 佳.苦酸通調法抑制糖尿病脂肪組織炎癥機制的理論探討[J].中華實用中西醫雜志，2009，22(3)：146-148.

吉林省教育廳課題(No.吉教科合字2012第65號)

米佳，女，醫學博士，主治醫師。研究方向：中醫藥治療內分泌及其代謝病的研究。

▲通訊作者 樸春麗，女，教授，博士研究生導師。研究方向：中醫藥治療內分泌及其代謝病的研究。E-mail：pcl2013@sina.cn

長春中醫藥大學附屬醫院內分泌科(130021)