中藥抑制神經細胞凋亡作用的研究進展

馬丙祥，陳恬恬，王怡珍

(1. 河南中醫學院第一附屬醫院，河南 鄭州 450000；2. 河南中醫學院，河南 鄭州 450000)

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綜述

中藥抑制神經細胞凋亡作用的研究進展

馬丙祥1，陳恬恬2，王怡珍1

(1. 河南中醫學院第一附屬醫院，河南 鄭州 450000；2. 河南中醫學院，河南 鄭州 450000)

[關鍵詞]中藥；抑制；神經細胞凋亡

相對于神經細胞壞死而言，神經細胞凋亡是由基因調控的有序的主動死亡過程。研究發現，在中樞神經系統損傷早期，神經損傷以細胞壞死為主，后續損傷是以細胞凋亡占主導地位[1]。調控細胞凋亡的因子較多，且相互之間關系復雜，尋找抗神經細胞凋亡的藥物，并積極探索其作用機制，對提高中樞神經系統(CNS)損傷的臨床療效非常重要。近年來，中藥在治療神經系統疾病的效果得到了更多人的認可，因此，探討中藥抑制神經細胞凋亡的作用機制及靶點具有重要意義。

1神經細胞凋亡的作用機制

細胞凋亡的發生機制錯綜復雜，主要通過線粒體通路、死亡受體介導通路和內質網通路這三種方式實現[2]。

1.1線粒體通路在線粒體通路介導的細胞凋亡過程中，存在2個非常重要的中介物質，即線粒體通透性轉換孔(MPTP)和Bcl-2家族。MPTP位于線粒體內外膜之間，當細胞受到各種外源性損傷，如氧化應激過度、Ca2+超載等，引起MPTP開放，則位于線粒體膜間隙的促凋亡蛋白細胞色素C(Cytc)釋放到胞漿。此時胞漿內凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)會與之結合形成多聚復合體，從而引發胱天蛋白酶-9(Caspase-9)前體及Caspase-3活化，后者剪切靶細胞的功能蛋白質導致細胞凋亡。另外，Bcl-2家族包括促凋亡蛋白(如Bax和Bak)、抑凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xl)以及BH3-only蛋白(如Bim、Bid)，它們主要控制著線粒體內外膜的通透性，致Cytc釋放參與細胞凋亡[3]。

1.2死亡受體通路死亡受體通路主要包括死亡因子受體(Fas)/死亡因子Fas配體(FasL)死亡通路和腫瘤壞死因子受體相關蛋白(TNFR)死亡通路。前者通過Fas和FasL在細胞內結合形成三聚體的活化形式，再與胞內的Fas相關死亡結構域蛋白(FADD)結合，形成死亡誘導復合物(DISC)。它能夠一方面激活下游的Caspase相關蛋白酶級聯反應誘導細胞凋亡[4]，一方面切斷Bid生成具有促凋亡活性的tBid，促使線粒體釋放CytC，導致細胞凋亡。TNFR死亡通路是通過TNF和TNFR-1結合，使受體死亡結構域發生聚集。一方面TNFR銜接蛋白(TRADD)募集FADD導致細胞凋亡，另一方面活化轉錄因子NF-κB和激活蛋白AP-1，導致相關因子表達，從而誘導細胞凋亡[5]。

1.3內質網受體通路內質網受體通路是新近發現的內質網應激(ERS)誘發的細胞凋亡的途徑。包括生長停滯及DNA損傷基因(CHOP/GADD153)通路、c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路和Caspases通路。CHOP通路是在ERS狀態下活化需肌醇酶-1(IRE-1)、激活轉錄因子(ATF6)和蛋白激酶樣內質網激酶(PERK)，誘使CHOP表達增加，導致細胞凋亡。CHOP的下游機制尚未明確，目前認為，激活后的CHOP能下調Bcl-2水平，上調促凋亡基因Bim，增加ERS的敏感度[6]。還可能通過增加活性氧簇副產物巰基氧化酶Ero-1 的水平啟動凋亡程序[7]。此外還發現激酶類似蛋白TRB3可與絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶AKT結合，降低CHOP活性。目前發現的JNK通路有2條途徑[8]。其一是JNK通過激活c-Jun、c-Fos等轉錄因子，調控下游相關基因的轉錄和凋亡蛋白的表達，從而介導線粒體途徑和死亡受體途徑的細胞凋亡。其二是通過直接調節胞質內相關蛋白的活性而介導線粒體途徑的細胞凋亡。Caspases通路中的Caspases-12在內質網產生，在ERS狀態下被激活，并與其他應激分子共同激活Caspase-9酶原，而后通過Caspase-3途徑誘導細胞凋亡[9]。

2中藥對抑制神經細胞凋亡的作用

目前不斷有研究發現，通過藥物干預能抑制早期神經細胞的凋亡，從而達到減輕神經損傷的目的。近年研究發現中藥抗神經細胞凋亡的作用顯著，其臨床應用療效仍有待深入研究。

2.1以Bcl-2、Bax及Caspase-3 蛋白為靶點的抗神經細胞凋亡中藥

2.1.1復方胡南等[10]用腦內定向聯合注射 Aβ1～40和興奮性氨基酸制備老年性癡呆動物模型，發現養壽丹(出自《御藥院方》)能有效抑制神經細胞凋亡，其作用機制可能為下調了Caspase-3 的表達，阻止了Caspase-3誘導的凋亡級聯反應。王勇等[11]用改良的Feeney法建立大鼠腦外傷模型，發現加味圣愈湯(由圣愈湯基礎上加丹參、制沒藥、石菖蒲、郁金組成)能同樣通過抑制Caspase-3發揮抗凋亡作用，減輕腦外傷后的海馬神經細胞損傷。中風膏(由當歸、川芎、赤芍、黃芪、水蛭、羌活和甘草組成)[12]、二根龍蛭湯(葛根、白茅根、地龍、水蛭、丹參、紅花、川芎)[13]是治療腦缺血的經驗方，可降低神經功能的受損程度。養血清腦顆粒(由補血名方“四物湯”加減而成)可以改善血管性癡呆和老年性癡呆(AD)大鼠的學習及認知功能[14-15]。研究發現，它們均能通過提高抑凋亡蛋白Bcl-2、降低促凋亡蛋白Bax以及Caspase-3蛋白的表達，發揮抑制神經細胞凋亡的作用。此外，寧神溫膽湯(溫膽湯加石菖蒲、酸棗仁)、補陽還五湯、柴胡疏肝散、消栓顆粒、脈絡寧注射液、腦心通、蛭龍活血通瘀等多種經方和驗方，涉及腦缺血再灌注、急性脊髓損傷、新生鼠缺氧缺血腦損傷、精神分裂、腦出血、卒中后抑郁、癲癇等多種CNS疾病，均以Bcl-2、Bax和/或Caspase-3 蛋白為靶點，研究中藥復方對神經細胞凋亡的抑制作用。

2.1.2單體成分研究表明5，6-二羥乙基黃芩苷能抑制急性腦缺血再灌注神經細胞的凋亡[16]，可能通過減少促凋亡蛋白 Bax 及Caspase-3 的表達，升高抑凋亡蛋白Bcl-2的表達發揮抗凋亡作用。除此之外，針對急性腦缺血損傷神經細胞凋亡的研究，還有丹參酮天麻素、熊膽粉、生姜、白扁豆多糖、黃芩苷、羅布麻提取物、茶黃素、西洋參皂苷、銀杏葉提取物和黃芪多糖等十余種單體有效成分或單藥通過作用于 Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白減少神經細胞凋亡。女貞子、川芎嗪、白藜蘆醇、羥基紅花黃色素 A等對急性脊髓損傷的神經細胞同樣有抗凋亡作用。在其他CNS損傷中，七葉皂苷鈉對中毒性腦病、梔子苷對慢性腦缺血、黃芩對血管性癡呆以及甘草總黃酮對應激抑郁行為大鼠的相關研究中，都能以Bcl-2、Bax 及Caspase-3為靶點降低細胞凋亡數。此外，獨活、白芍總苷、遠志總苷對阿爾茨海默病、黃芩苷對海人酸致癇和參附注射液對缺氧缺血性新生腦損傷鼠等都在實驗研究中證明了其在抗細胞凋亡的有效性。

2.2以其他相關調控基因為靶點的抗凋亡中藥在細胞凋亡發生機制的研究中，Fas/FasL、c-Jun、c-Fos、p53等是參與細胞凋亡過程的重要因子。紅花注射液能明顯降低腦復蘇后腦組織中Fas、P53蛋白的表達水平和神經細胞凋亡數[17]。在以c-Jun和c-Fos因子為靶點的研究中，竹葉參皂苷、遠志總苷和黃芪多糖都證明了其下調c-Jun、c-Fos和凋亡細胞數的有效性[18-20]。歸延膠囊(當歸、莪術和延胡索)能調控Bcl-2/Bax、Fas/FasL和Caspase-3的表達實現抗神經細胞凋亡[21]。星蔞承氣湯和補陽還五湯亦能下調腦缺血損傷后Fas/FasL及Caspase-3的表達，且在缺血后1 d的作用最顯著[22]。葛根素和黃芩苷能減少核轉錄因子(NF-κB)活化及神經細胞凋亡數起到腦保護作用[23-24]。

2.3以抗氧自由基、炎癥因子損傷為靶點的抗神經細胞凋亡中藥CNS在急性缺氧缺血情況下，可產生大量的自由基及細胞因子。它們可直接損傷神經元，同時能啟動神經細胞凋亡程序[25]。血管性癡呆大鼠在應用人參總皂苷聯合淫羊藿苷后，相比于模型組，腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性提高、 丙二醛(MDA)含量降低，海馬 CA1 區的神經細胞凋亡數減少[26]。地黃寡糖、醒智散同樣能提高血管性癡呆大鼠SOD活力、減少MDA含量及神經細胞的凋亡數[27-28]。對腦出血的研究中，燈盞花素注射液可有效減少出血灶周圍腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 和白細胞介素-8(IL-8)的表達，減低神經細胞凋亡率[29]。牛膝應用到重型顱腦損傷早期時，可提高IL-2含量，但不能減少神經細胞凋亡數。原因可能為牛膝增強了機體的免疫功能，加重了組織間細胞的免疫反應，從而介導細胞凋亡[30]。脊神經根炎大鼠在硬膜外腔注射脈絡寧注射液后，IL-8 含量明顯降低，脊髓神經細胞的凋亡數減少[31]，再次證明了脈絡寧注射液能夠減少炎癥因子誘導的神經細胞凋亡。

2.4以相關蛋白激酶為靶點的抗神經細胞凋亡中藥胞漿內的激酶大多是絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要包括P38MAPK、細胞外信號調節激酶 (ERK)和Ras 3種。安朝旺等[32]探討參芎化瘀膠囊對海馬細胞凋亡的研究中，證實了P38MAPK在神經細胞凋亡的關鍵作用。研究發現P38MAPK 不僅能活化Caspases和Bax，而且能激活 c-Jun 和c-Fos參與內質網通路，也能通過 Elk-1，ATF-2 等轉錄因子參與死亡受體通路[33]。給予缺血再灌注模型注射丹參酮ⅡA磺酸鈉后，腦組織中Ras、MEK以及ERK的表達均下調，且細胞凋亡數減少[34]。王婷婷等[35]研究發現，胡黃連苷Ⅱ干預后，神經細胞的凋亡數與p-ERK1/2的表達水平明顯降低。葛根素在抑制AKT表達方面也有明顯抑制作用[36]。養陰通絡方為治療肝腎陰虛兼血瘀證缺血性中風經驗方劑，由生地、山茱萸、葛根、川芎、川牛膝、水蛭、白芍、石菖蒲組成，可降低缺血性大鼠腦內的糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、Caspase-3的表達。GSK-3β通過磷酸化eIF2B而抑制蛋白合成，并激活凋亡相關蛋白激酶Caspases家族，引起下游的一系列酶聯反應，導致細胞凋亡[37]。

2.5其他楊云芳等[38]對腦出血模型應用蛭龍活血通瘀膠囊，結果證實缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)與細胞凋亡關系密切，且能減少蛋白酶激活受體-1(PAR-1)表達。研究發現，人參皂苷也能降低缺氧缺血性腦損傷仔鼠腦組織中HIF-1α的表達[39]。另有學者研究發現柴胡皂苷A和清熱化瘀方能通過提高腦源性神經生長因子(BDNF)蛋白及基因的表達，減少神經細胞凋亡[40-41]。

3小結

基于辨證論治及整體觀念的理論基礎，中醫藥治療CNS損傷的療效顯著，越來越多醫務人員認可其走進疾病的早期階段。近年來，中藥劑型不斷增多，得益于其有效成分和作用機制的逐漸明朗。通過對116篇文獻的總結與歸納，仍發現存在一些問題值得思考：①研究靶點主要集中在Bcl-2、Bax及Caspase-3因子上，而對死亡受體通路及內質網通路的探討相對較少。②神經細胞凋亡機制復雜，而中藥復方及單體成分對相關因子的探討范圍稍顯狹窄及單一。③中藥復方成分復雜，多種藥物之間的相互作用尚不能明確。④西醫造模方法及中藥應用少有體現中醫藥辨證論治特色。⑤實驗方法多為在體研究，體外實驗相對較少。因此，不斷探索建立有中醫特色的實驗動物模型，采用體內和體外相結合的實驗方法，從多種啟動因子、多種通路和多樣因子為切入點，探索單體有效成分及復方的抗神經細胞凋亡的機制，從而為中藥新藥的研發和應用提供堅實的理論基礎。相信通過廣大中醫藥研究者的不斷努力和實驗技術的不斷發展，中藥單體成分及復方的抗神經細胞凋亡的作用會得到國內外學者的認同。

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[收稿日期]2015-09-15

[中圖分類號]R97

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)11-1241-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.11.035

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(81473727)；河南中醫學院研究生創新基金項目(00104091)

[通信作者]陳恬恬，E-mail：ctt0704@126.com