新型O6-芐基鳥嘌呤衍生物的合成及其細胞毒性

李思思， 彭瑞增

(1. 中國疾病預防控制中心 環境與健康相關產品安全所，北京　100021；

2. 北京工業大學 生命科學與生物工程學院，北京　100124)

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·研究簡報·

新型O6-芐基鳥嘌呤衍生物的合成及其細胞毒性

李思思1*， 彭瑞增2

(1. 中國疾病預防控制中心 環境與健康相關產品安全所，北京100021；

2. 北京工業大學 生命科學與生物工程學院，北京100124)

摘要：以O6-芐基鳥嘌呤(O6-BG)為起始原料，經4步反應合成了一個新型的O6-BG衍生物——4-硝基芐基-[6-(芐氧基)-9H-嘌呤-2]氨基甲酸酯(4)，其結構經1H NMR和HR-ESI-MS表征。用CCK-8法研究了4對人腦神經膠質細胞(SF126， SF763和SF767)的細胞毒性。結果表明：在低氧環境下，4與ACUN的協同作用對SF126， SF763和SF767均有較好的抑制活性，其IC50分別為0.04 mM， 0.1 mM和0.03 mM，優于陽性對照藥O6-BG。

關鍵詞：O6-芐基鳥嘌呤； 低氧激活； 4-硝基芐基-[6-(芐氧基)-9H-嘌呤-2]氨基甲酸酯; 合成； 細胞毒性

氯乙基亞硝基脲類化合物(CENUs)是治療神經膠質瘤等惡性腫瘤的重要化療藥物。該藥物通過產生DNA股間交聯[1-2]，抑制細胞正常復制，從而發揮抗癌作用。O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶(AGT)是存在于細胞內的DNA修復蛋白，可修復CENUs對腫瘤細胞DNA產生的烷化損傷[3-4]，導致腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性[5]。近年來，有多種AGT抑制劑與烷化劑聯合應用于腫瘤患者，其中O6-芐基鳥嘌呤(O6-BG)已進入臨床實驗階段。但O6-BG不具有靶向性，在腫瘤細胞內發揮增敏作用的同時，亦會抑制正常細胞內AGT活性，增加藥物敏感性，導致烷化劑的使用劑量大量降低至無效水平之下[6-8]。因此，合成具有靶向性的AGT抑制劑對提高CENUs抗癌效果具有較大的臨床意義。

藥物作用環境對藥效有較大影響。文獻[9-13]研究表明，實體腫瘤中會出現缺氧腫瘤細胞區域，利用該低氧環境，可以選擇性地激活前體藥物，使其分解產生AGT抑制劑，提高細胞對藥物的敏感性。

Scheme 1

為合成兼具良好AGT抑制活性和靶向性的新型抗腫瘤藥物，本文以O6-BG為原料，與特戊酸氯甲酯經烷基化反應后，與三光氣發生羰基化反應制得中間體(2)； 2與對硝基苯甲醇發生加聚反應后，再經脫保護基反應合成了一個新型的O6-芐基鳥嘌呤衍生物——4-硝基芐基-[6-(芐氧基)-9H-嘌呤-2]氨基甲酸酯(4, Scheme 1)，其結構經1H NMR和HR-ESI-MS表征。用CCK-8法研究了4對人腦神經膠質細胞(SF126， SF763和SF767)的細胞毒性。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

Bruker AC-P 400 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內標)；Bruker Vertex 70型傅立葉變換紅外光譜儀(KBr壓片)；TSQ Quantum型高效液相色譜-質譜聯用儀。

O6-BG，純度98%，百靈威科技有限公司；三光氣(BTC)，純度99%，Sigma公司；其余所用試劑均為分析純或優級純。

1.2合成

(1) 1的合成

在反應瓶中加入O6-BG 0.24 g(1 mmol)和1 mol·L-1乙醇鈉68 mg的乙醇(1 mL)溶液，超聲10 min使其溶解；真空抽干乙醇，殘余物用DMF(2 mL)溶解，攪拌下滴加特戊酸氯甲酯0.14 mL(1 mmol)，滴畢，于室溫反應30 min。真空抽干DMF，殘余物經硅膠柱色譜[洗脫劑：V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=1 ∶1]純化得白色粉末1 0.26 g，產率72.3%， m.p.161~162 ℃；1H NMRδ： 1.09(s, 9H, CH3)， 5.48 (s, 2H, CH2N)， 5.96(s, 2H, CH2in Bn)， 6.64(s, 2H, NH2)， 7.34(m, 1H, ArH)， 7.39(m, 2H, ArH)， 7.50(m, 2H, ArH)， 7.92(s, 1H, 8-H)； ESI-MSm/z： 356{[M+H]+}。

(2) 2的合成

避光、氮氣保護下，在圓底燒瓶中依次加入1 106 mg(0.3 mmol),無水二氯甲烷7 mL和無水吡啶0.5 mL，充分攪拌得溶液A。

冰浴冷卻，在反應瓶中加入20%BTC 0.26 g(0.88 mmol)的甲苯(1.5 mL)溶液，攪拌下滴加溶液A，滴畢，反應20 h。升至室溫得白色結晶2，直接投入下步反應。

(3) 3的合成

超聲至2溶解，攪拌下加入對硝基苯甲醇0.11 g(0.7 mmol)的二氯甲烷(3 mL)溶液，反應2 h。反應液經硅膠柱層析[洗脫劑：V(二氯甲烷) ∶V(乙醇)=30 ∶1]純化得白色粉末3 0.142 g，產率89%， m.p.146~148 ℃；1H NMRδ： 10.20(s, D2O exchangeable, 1H)， 8.24(d,J=8.5 Hz, 2H )， 8.03(s, 1H)， 7.33~7.61(m, 7H)， 6.08(s, 2H)， 5.62(s, 2H)， 5.37(s, 2H)， 1.16(s, 9H)； ESI-MSm/z： 535{[M+H]+}。

(4) 4的合成

在圓底燒瓶中加入3 0.53 g(1 mmol)和0.1 mol·L-1氨的甲醇(40 mL)溶液，攪拌使其溶解；于室溫反應約40 h(TLC跟蹤)。析出白色粉末，水浴反應1 h。過濾，濾餅依次用甲醇和乙醚洗滌，干燥得白色粉末4 0.36 g，產率85%， m.p.233~235 ℃；1H NMRδ： 13.24(s, 1H)， 10.51(s, 1H)， 8.29~8.21(m, 3H)， 7.74(d,J=8.7 Hz, 2H)， 7.61~7.49(m, 2H)， 7.46~7.26(m, 3H)， 5.59(s, 2H)， 5.34(s, 2H)；13C NMRδ： 151.8, 151.7, 147.0, 144.7, 136.3, 128.9, 128.5, 128.3, 123.6, 67.5, 64.5； HR-ESI-MSm/z: Calcd for C20H16N6O5{[M+H]+}421.125 5, found 421.125 7。

1.3細胞毒性測定

以O6-BG為陽性對照，4和O6-BG作前體藥物與CENUs抗腫瘤藥物尼莫司汀(ACNU)協同作用于人腦神經膠質瘤細胞株SF126， SF763和SF767，采用CCK-8法測定4與ACNU聯合用藥的體外抗癌活性。

用完全培養基調整細胞濃度至5~7×104個/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，培養過夜。依次用不同濃度的4的培養基處理細胞，同時設不含藥物的陰性對照組和試劑空白對照組。每個劑量組設3組平行，分別于37°C, 5%CO2培養箱中和厭氧培養罐中培養24 h。更換培養基，每孔加入含10%CCK-8試劑的100 μL培養基，繼續培養2~3 h。用酶標儀測定待測液在450 nm處的吸光值A450(A與活細胞數成正比，取平均值)，計算細胞存活率[細胞存活率/%=(OD實驗-OD空白)/OD對照-OD空白×100%]，再計算IC50。

2結果與討論

2.1合成

合成3時，反應儀器和試劑均需保證嚴格無水，否則可能導致合成失敗。合成4時，需在氮氣保護下，用注射器向反應母液中逐滴加入對硝基苯甲醇，使反應物充分反應。

2.2細胞毒性

表1為4的細胞毒性。由表1可見，在有氧條件下，4與ACNU的協同作用對SF126， SF763和SF767三種腫瘤細胞均無明顯抑制效果，其IC50分別為0.8 mM， 1.2 mM和0.6 mM，與ACNU(0.85 mM， >1.2 mM， 0.9 mM) 無顯著性差異；在無氧條件下，4與ACNU的協同作用對SF126， SF763和SF767三種腫瘤細胞具有顯著的抑制效果，且明顯優于ACNU單獨作用和ACNU與O6-BG的協同作用效果。說明4可以低氧激活靶向作用于腫瘤細胞。

4作為一種低氧激活前體藥物，其本身對細胞無毒或毒性很低，但在低氧條件下可被相應還原酶激活，釋放具有細胞毒性的藥物，從而發揮治療作用，且對還原酶表達水平較低的正常組織影響較小，因此不論是抗腫瘤作用還是安全性均比傳統化療藥物更具優勢[14]。此外，由于4的結構中含有對硝基芐基，使其也能在低氧條件下靶向作用于實體瘤組織。研究表明，硝基芳烴化合物在低氧環境下很容易失去一個電子生成硝基陰離子自由基，而在有氧條件下與氧分子發生氧化反應迅速生成硝基芳烴或超氧歧化物[15]。正是利用硝基芳香化合物的這一特點，4的靶向作用性得以進一步增強。

表1　4與ACNU聯合用藥的IC50

3結論

合成了低氧激活的4-硝基芐基-(6-(芐氧基)-9H-嘌呤-2)氨基甲酸酯(4)。用CCK-8法研究了4的細胞毒性。結果表明：在低氧條件下，4與ACUN的協同作用對人腦神經膠質瘤細胞SF126， SF763和SF767均具有顯著的抑制作用，在有氧條件下無明顯抑制效果，即4具有低氧激活靶向作用。低氧條件下，4作為前體藥物可以顯著抑制AGT活性，其對SF126， SF763和SF767三種腫瘤細胞的 IC50分別為0.04 mM， 0.1 mM和0.03 mM，均明顯優于陽性對照藥O6-BG。

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《合成化學》變更期刊啟事

為縮短出版周期，提高刊物的時效性，滿足廣大科研工作者發表科研成果、加快學術交流的需要，更好地為作者和讀者服務，經四川省新聞出版局批準，《合成化學》從2015年1月起由原來的雙月刊更改為月刊，每月20日出版。

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《合成化學》編輯部

Synthesis and Cytotoxicity of A Novel

O6-benzylguanine Derivative

LI Si-si1*,PENG Rui-zeng2

(1. Institute of Environmental Health and Related Product Safety, Chinese Center for Disease Control and Prevention,

Beijing 100021, China; 2. College of Life Science & Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China)

Abstract：A novelO6-benzylguanine(O6-BG) derivative, 4-nitrobenzyl-[6-(benzyloxy)-9H-purin-2-yl]carbamate(4), was synthesized by a four-step reaction, usingO6-BG as starting material. The structure was characterized by1H NMR and HR-ESI-MS. The cytotoxicities of 4 were investigated by CCK-8 method. The results indicated that 4 exhibited better inhibition activities against human glioma cell lines(SF126, SF763 and SF767) with ACUN thanO6-BG under hypoxia conditions. IC50of 4 against SF126, SF763 and SF767 were 0.04 mM, 0.1 mM and 0.03 mM, respectively.

Keywords：O6-benzylguanine; hypoxia activated; 4-nitrobenzyl-[6-(benzyloxy)-9H-purin-2-yl]carbamate; synthesis; cytotoxicity

作者簡介：李思思(1990-)，女，漢族，北京人，碩士研究生，主要從事抗癌藥物的研究。E-mail: lisisi918731@aliyun.com

收稿日期：2015-03-16;

修訂日期：2015-12-03

中圖分類號：0621.3

文獻標志碼：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.02.15080