GmMYB042基因對類黃酮生物合成的調控作用

杜　?！∪健▲P　馬珊珊　柯蘊倬　孫麗萍　李加納,*　唐益雄

1西南大學農學與生物科技學院, 重慶400715;2中國農業科學院生物技術研究所, 北京100081

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GmMYB042基因對類黃酮生物合成的調控作用

杜海1冉鳳1馬珊珊1柯蘊倬1孫麗萍1李加納1,*唐益雄2,*

1西南大學農學與生物科技學院, 重慶400715;2中國農業科學院生物技術研究所, 北京100081

摘要:MYB類轉錄因子是植物中最大的轉錄因子基因家族之一, 廣泛參與植物生長發育全過程, 對植物次生代謝等具有重要的調控作用。本研究對大豆GmMYB042基因的表達特性和功能進行了系統研究, 針對該基因C端的保守氨基酸基序(PDLNLELTIS)和鋅指結構進行了一系列的序列刪除突變, 并將各缺失突變體在煙草中進行了過表達, 以驗證目的基因及其特殊基序的功能。表達特性分析結果表明, GmMYB042基因在大豆的根瘤、根、莖、葉、花、莢果皮和種子中均有表達, 且在莖、種子和花中的表達量相對較高; GmMYB042基因在大豆中的表達受PEG、高鹽、低溫和UV-B輻射的誘導。過表達分析結果表明, GmMYB042基因的過表達使轉基因煙草類黃酮代謝途徑部分關鍵酶基因(如PAL、CHS和FLS)的表達量明顯上升, 轉基因煙草總黃酮的含量明顯高于對照; 各缺失突變體的轉基因煙草類黃酮代謝途徑相應酶基因的表達量發生了相應的變化, 進一步證明目的基因對類黃酮生物合成的調控作用; 各缺失突變體的轉基因煙草的葉緣有明顯皺褶, 說明目的基因可能還參與調控葉的形態建成。

關鍵詞:MYB轉錄因子; 類黃酮; 缺失突變; 功能研究

本研究由國家自然科學基金項目(31471528), 國家博士后基金面上項目(2014M552297)和中央高?；究蒲袠I務費專項資金(SWU113104, XDJK2014B035, 2362015xk05)資助。

This study was supported by National Natural Science Foundation of China (31471528), Postdoctoral Science Foundation of China (2014M552297) and Fundamental Research Funds for the Central Universities of China (SWU113104, XDJK2014B035, 2362015xk05).

第一作者聯系方式: E-mail: haidu81@aliyun.com, Tel: 18223480008

MYB類轉錄因子以其N端含有的一段保守DNA結合域(DNA-binding domain)為共同特征, 廣泛存在于真核生物界, 是植物基因組中最大的轉錄因子家族之一[1]。MYB結構域一般由1～4個串聯的、不完全重復的MYB重復區域(R1、R2和R3)組成。通常根據MYB重復區的數量對該類轉錄因子分類,如含有1個重復區或含2個彼此間隔開的MYB重復區的為MYB-related類(1R-MYB), 含有2個串聯MYB重復區的為2R-MYB類(R2R3-MYB), 含有3個串聯MYB重復區的為3R-MYB類(R1R2R3-MYB), 含有4個串聯MYB重復區的則4R-MYB類(R1R2R2R1/2-MYB)[2-4]。它們共同組成了植物基因組中一個龐大的MYB轉錄因子基因家族。其中, 2R-MYB類是植物中數量最多、最為典型的MYB類轉錄因子。MYB轉錄因子的C端則為其轉錄激活區(Transcription activation domain), 富含酸性氨基酸, 一般折疊成雙親性的螺旋發揮作用。

首個MYB轉錄因子基因v-MYB是從引起禽急性成髓細胞白血病病毒AMV和E26 (avian myeloblastosis virus (AMV))中發現的[1]。隨后, v-MYB的同源基因, A-MYB、B-MYB和C-MYB在多種脊椎動物中也相繼被鑒定, 并被證實參與調控細胞增殖、分化和凋零過程[5]。植物中鑒定的第一個MYB轉錄因子基因是參與調控玉米花青素生物合成的C1基因[6]。隨后在許多植物基因組中陸續發現了大量的MYB基因。例如, 在擬南芥基因組中就有126個2R-MYB基因[7]、大豆基因組中有255個有完整讀碼框的2R-MYB基因[8]、楊樹中則有191個2R-MYB基因[9]等。大量功能研究表明該類轉錄因子基因廣泛參與植物生長發育全過程, 如次生代謝調控、激素和環境因子的應答、細胞分化、形態建成等[10-15]。

類黃酮廣泛分布于植物界, 在許多植物組織,如根、葉、花和果實中均有大量分布[16-17]。該類化合物具有多種生物學功能, 如調節植物生長、參與植物抗逆脅迫、作為植物抗毒素和活性氧清除劑等。相關藥理和臨床實驗證實黃酮類化合物具有非常重要的藥理功能, 是藥用植物的主要活性成分之一,對人體健康具有非常重要的影響。如抗癌、抗氧化、降低膽固醇、抑制和預防冠心病以及其他老年和婦科疾病等[18-19]。因此, 類黃酮類化合物一直備受人們的重視, 被認為是一類極富醫療和保健價值的天然物質, 具有廣泛的開發前景。類黃酮是植物苯丙烷類代謝途徑的一類重要次生代謝產物, 其代謝途徑和木質素代謝途徑是苯丙烷類代謝途徑的兩大主要分支。

近年來研究證實2R-MYB轉錄因子廣泛參與植物苯丙烷代謝途徑[20-23], 對類黃酮的生物合成有重要的調控作用[24-25]。大豆是世界重要的油料作物,也是類黃酮的重要來源。因此, 克隆和鑒定大豆中調控類黃酮生物合成的MYB轉錄因子基因、研究它們的調控機理具有重要的學術意義和廣闊的應用前景。本研究在前期研究基礎上[26-27], 采用RT-PCR技術進一步分析了GmMYB042 (GmMYBZ2)基因在大豆不同組織和逆境脅迫下(ABA、PEG、NaCl、低溫等)的表達模式; 基于PCR技術對該基因C端特殊的保守氨基酸基序(PDLNLELTIS)和鋅指結構進行了一系列的序列刪除突變, 并將各缺失突變體在煙草中過表達, 以驗證它們的功能, 以期能為進一步闡明該基因調控類黃酮生物合成的分子機制提供實驗證據。

1　材料與方法

1.1材料、菌株、載體和試劑

煙草品種NC89、大腸桿菌(E. coli) DH5α、農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404、植物表達載體pCAMBIA2301均由本實驗室保存。植物總RNA提取試劑TRNzol購于天根生化科技(北京)有限公司; 反轉錄試劑盒(PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit)和限制性內切酶購于TaKaRa公司; 質粒提取試劑盒(EasyPure Plasmid MiniPrep Kit)、膠回收試劑盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit), pEASY-T1 Simple載體、普通Taq酶購于北京全式金生物技術有限公司; RQ1 RNase-Free DNase購于美國Promega公司; 實時熒光定量PCR試劑盒(SsoAdvanced Universal超混合液)購自Bio-Rad公司;大豆苷元(Daidzein)標準品購于中國藥品生物制品檢定所; ABA、6-BA、NAA等激素購于Sigma公司;卡那霉素、頭孢拉定購于Amersco公司; X-Gluc購于Inalco公司。其他常規生化試劑均為國產分析純。

1.2脅迫處理和表達特性分析

高鹽和干旱處理是分別將大豆幼苗置含300 mmol L–1NaCl和10％ PEG-8000的B5液體培養基中, 室溫下分別于0、6、12、24、48和72 h時取樣。低溫處理是將大豆幼苗置4℃培養箱中, 分別于0、6、12、24、48和72 h時取樣。激素處理是分別將大豆幼苗置含100 μmol L–1ABA、100 μmol L–1GA3、

75 μmol L–1NAA和75 μmol L–16-BA的B5液體培養基中, 室溫下分別于0、1、3、6、12和24 h時取樣。液氮速凍所有樣品, 于–80℃超低溫冰箱保存備用。

1.2.1qPCR法分析目的基因的組織表達特性

采用TRIzol法分別提取大豆不同組織(根瘤、根、莖、葉、花和未成熟種子)總RNA, 經DNase I處理去除RNA中殘留的痕量基因組DNA, 根據TaKaRa公司的反轉錄試劑盒說明書合成第1鏈cDNA。使用SsoAdvanced Universal Mix (SYBR Green)試劑盒和Bio-Rad公司的CFX96 Touch熒光定量PCR儀進行Real-time PCR擴增。以反轉錄獲得的cDNA為模板, 以大豆泛素基因Subi-1 (D16248)為內標基因(UBQ-qF: 5′-GACCCTTACGGGTAAGA CTATTAC-3′和UBQ-qR: 5′-GTCCTTCCATCCTCTA GCTGT-3′), 以基因特異引物MYB042-qF (5′-GCAA CTGCTGCAACTGTTACA-3′)和MYB042-qR (5′-CA AACCCAAACTGCAAACG-3′) 進行Real-time PCR擴增。采用兩步法反應程序, 95℃ 5 min; 95℃ 15 s, 61℃ 20 s, 40個循環; 繪制熔解曲線。設3 次重復,取平均值, 采用2–ΔΔCt法計算基因在不同樣品中的相對表達量。

1.2.2RT-PCR法分析目的基因在脅迫誘導下的表達特性同理, 分別提取大豆脅迫和誘導處理材料的總RNA, 并反轉錄合成第1鏈cDNA。以反轉錄獲得的cDNA為模板, 預實驗確定RT-PCR指數擴增循環數, 以保證在此循環數內PCR產物呈指數增長(28個循環)。以大豆泛素基因Subi-1 (D16248)為內標基因(UBQ-F: 5'-CTCTGACAGGGAAGACCGT AAC-3'和UBQ-R: 5'-GAGACCGTGCATAGCAAGC TA-3')對模板進行均一化處理。以基因特異引物MYB042-F (5'-CGGGGAGAACAGACAATGAAATA AA-3')和MYB042-R (5'-CAAACCCAAACTGCAAA CGAAAC-3') 進行PCR擴增, 檢測目的基因在不同組織或脅迫處理下的表達模式。PCR程序為94℃5 min; 94℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 30 s, 28個循環; 72 ℃ 10 min, 瓊脂糖凝膠電泳法檢測RT-PCR結果。

大豆RNA-Seq表達譜數據來源于共享數據[28]和SoyBase (http://soybase.org/AffyChip/)[29]。

1.3植物過表達載體的構建及煙草的遺傳轉化

前期我們對GmMYB042基因C端保守的氨基酸基序和鋅指結構進行了一系列的序列刪除突變[28](圖1-A), 此基礎上, 本研究分別將目的基因及其突變體序列克隆到植物表達載體pCAMBIA2301上(前引物含有EcoR I酶切位點, 后引物含有Sal I酶切位點), 構建相應的植物過表達載體p2301-35S:: GmMYB042, p2301-35S::TB1, p2301-35S::TB2, p2301-35S::TB3和p2301-35S::TB4 (圖1-B)。采用農桿菌LBA4404介導法, 將重組質粒和空載體(對照)分別轉入煙草NC89, 利用Kan抗性篩選轉基因抗性苗。

1.4轉基因煙草的鑒定

圖1　GmMYB042基因及其缺失突變體的植物過表達載體的構建示意圖Fig. 1　Sketch map of the overexpression constructs of GmMYB042 gene and its mutants

挑選生長良好的轉基因Kan抗性苗, 剪取少許葉片浸入GUS染液進行組織染色(37℃放置過夜),

以75％乙醇脫色2～3次(以轉空質粒和野生型的煙草為對照), Nickon SME 1000體視顯微鏡觀察GUS染色結果。選擇GUS染色為陽性的轉化植株, 以TRIzol法提取葉片總RNA, 反轉錄獲得的cDNA為模板, 利用基因特異引物(MYB042-F和MYB042-R, 同1.2)通過RT-PCR法檢測轉化苗。進一步經多代擴繁獲得轉基因T3代陽性株系, 并對T3代轉基因植株和陰性對照(轉化空載體)進行表型觀察。

1.5轉基因煙草總黃酮含量的測定

1.5.1標準曲線的建立大豆苷元標準品和樣品以50％甲醇為空白, 在紫外分光光度計上200～700 nm范圍內全波段掃描, 以確定標準品的最大吸收波長。精密稱取大豆苷元標準品2.0 mg置25 mL容量瓶中, 以50％甲醇溶解定容(濃度為80 μg mL–1); 制備一系列的標準品溶液(表1), 在最大波長處以50％甲醇為空白測定吸光度值, 以濃度(x)與吸光度(y)進行線性回歸, 求得回歸方程及相關系數。

1.5.2樣品的提取植物材料經液氮中充分研磨后稱取約0.1 g (3次重復), 按照0.1 g mL–1鮮重甲醇的比例加入預冷的色譜純甲醇, 密閉、避光、超聲波處理15 min, 7100 × g離心10 min, 吸取上清液; 0.45 μm微孔膜過濾, 密閉, 4℃保存備用。

1.5.3樣品的測定吸取0.5 mL樣品轉入15 mL比色管, 加5％ NaNO2溶液1 mL, 搖勻, 靜置6 min; 加5％的AlCl3溶液1 mL, 搖勻, 靜置6 min; 再加4％的NaOH溶液5 mL, 用蒸餾水定容至10 mL, 靜置15 min。在波長510 nm處測定吸收值。

1.6以RT-PCR法分析苯丙烷代謝途徑各關鍵酶基因的表達量

分別設計類黃酮代謝途徑關鍵酶基因PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H和FLS的特異引物(表2)。提取轉基因植株的總RNA, 反轉錄獲得總cDNA,以煙草Actin基因(X63603)為內標基因, 設計基因特異引物N-Act-F和N-Act-R, 預實驗進行模板均一化處理。以PCR法檢測相關酶基因在轉基因煙草中的表達量(方法同1.2)。

2　結果與分析

2.1大豆GmMYB042基因的表達特性

2.1.1GmMYB042基因在大豆中的組織表達特性

圖2表明, 目的基因在大豆的根瘤、根、莖、葉、花、果莢皮和未成熟種子中均表達。其中, 在莖中的表達量最高, 比葉和根瘤中的表達量約高4 倍; 在花和種子中的表達量也較高, 在根瘤和葉中的表達量則相對較低。

表1　大豆苷元標準品的制備Table 1　Preparation of daidzein standards

表2　煙草類黃酮合成途徑關鍵酶基因的特異引物Table 2　Primers of key enzyme genes in flavonoid biosynthesis pathway in tobacco

圖2　不同大豆組織器官中GmMYB042基因的表達量Fig. 2　Expression pattern of GmMYB042 gene in soybean

為進一步驗證GmMYB042基因的表達特性, 我們還利用2組公共的大豆RNA-Seq表達譜數據分析了目的基因在大豆不同發育時期和組織中的表達模式。在第1組轉錄組表達譜數據中(圖3), 目的基因在大豆根、莖尖分生組織、莢果皮、花、葉和毛狀根中均有表達, 且在花中的表達量最高。此外, 目的基因在毛狀根中的表達還受到大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)的誘導(24 h), 說明該基因可能參與調控大豆根瘤的形成過程。

在第2組轉錄組表達譜數據中(圖4), GmMYB042基因在大豆花、根和莢果皮中均有較高的表達量。同理, 目的基因在花中的表達水平明顯高于其他組織, 說明該基因可能參與花的發育過程。此外, 目的基因在種子發育14～35 d的表達量比種子發育早期(10 d)和晚期(42 d)高, 暗示該基因可能與種子發育中期相關。

綜上所述, qPCR法分析的結果與兩組轉錄組數據的結果一致性較好, 均證明目的基因在大豆花中有較高的表達量。此外, 本研究還證明目的基因在大豆莖中的表達水平相對最高, 暗示目的基因可能還與莖的發育相關。

2.1.2GmMYB042基因在紫外和紅光誘導下的表達譜如圖5所示, 目的基因的表達量隨著UV-B輻射處理時間的增加逐漸增高, 在3～6 h達到峰值, 此后又逐漸降低。在受紅光誘導時, 則先減小, 后增加, 在12 h達到峰值。證明目的基因參與了植物對這2種光信號的應答反應, 且對UV-B的誘導相對更加敏感。因為類黃酮類化合物在植物中具有抗紫外輻射的作用, 暗示GmMYB042基因可能通過調控類黃酮類物質的合成來抵御紫外輻射對植物的傷害。

2.1.3GmMYB042基因受激素和環境因子脅迫誘導的表達情況為探究GmMYB042基因受激素誘導的表達情況, 本研究分析了目的基因受ABA、GA3、NAA 和6-BA 4種激素誘導的表達模式。結果如圖6-A所示, 4種激素處理后目的基因的表達量沒有發生明顯變化,說明該基因的表達不受這4種激素的誘導。

圖3　GmMYB042基因在大豆RNA-Seq數據組1中的表達模式Fig. 3　Expression patterns of GmMYB042 gene in soybean in the first RNA-Seq dataset

圖4　GmMYB042基因在大豆RNA-Seq數據組2中的表達分析Fig. 4　Expression profiles of GmMYB042 gene in soybean in the second RNA-Seq dataset

圖5　GmMYB042基因受UV-B和紅光誘導的表達情況Fig. 5　Expressions of GmMYB042 gene induced by UV-B and red-light radiation

同理, 本研究還分析了目的基因受高鹽、低溫和PEG誘導的表達情況。結果如圖6-B所示, PEG-8000處理后, 目的基因的表達量在24 h最高; NaCl處理后在12 h的表達水平相對最高; 低溫脅迫時, 基因的表達水平則在24 h達到峰值。說明該基因的表達受到PEG-8000、NaCl和低溫的脅迫誘導。

2.2以RT-PCR法分析轉基因煙草類黃酮合成途徑關鍵酶基因的表達量

圖6　GmMYB042基因受激素和非生物脅迫誘導的表達情況Fig. 6　Expression patterns of GmMYB042 gene induced by phytohormone and abiotic stresses

提取轉基因煙草陽性苗T3代葉片的總RNA, 反轉錄合成第1鏈cDNA, 分別對類黃酮代謝途徑各

關鍵酶基因的表達量進行RT-PCR檢測分析(方法同1.2)。結果如圖7所示, GmMYB042基因的導入明顯提高了轉基因煙草中類黃酮生物合成途徑PAL、CHS、CHI和FLS酶基因的表達量。相反, 苯丙烷類代謝途徑的另一主要支路, 木質素生物合成途徑的CAD、CAOMT和OMT酶基因的表達量沒有明顯的變化。說明目的基因的導入提高了煙草中類黃酮代謝途徑酶基因的表達量, 進而促進類黃酮化合物的生物合成。

如圖7所示, GmMYB042基因各缺失突變體的轉基因煙草中類黃酮代謝途徑各關鍵酶基因的表達量則隨著其C端序列的縮短而逐漸降低, 而木質素代謝途徑相關酶基因的表達量則沒有明顯變化。進一步驗證目的基因對類黃酮代謝途徑PAL、CHS、CHI和FLS酶基因的表達有調控作用。

2.3轉基因煙草總黃酮含量的測定

圖7　GmMYB42基因及其C端缺失突變體的轉基因煙草的類黃酮代謝途徑酶基因的表達量Fig. 7　Expressions of flavonoid biosynthetic enzyme genes in transgenic tobacco lines of GmMYB042 gene and its C-terminal mutations

對轉GmMYB042基因煙草的4個株系(MYB042-2、MYB042-5、MYB042-16和MYB042-17)和對照NC89進行總黃酮含量的測定。每個株系測定3個植株, 每株重復測3次。方差分析結果表明處理間差異顯著(結果未顯示)。進一步利用LSD法進行多重比較分析表明, MYB042-16株系與對照總黃酮的含量差異顯著; 其他3個株系雖然與對照差異不顯著,但也有明顯提高(表3)。說明轉基因植株的總黃酮含量均有提高, 進一步證明目的基因可能參與調控煙草中類黃酮的生物合成。

表3　GmMYB042轉基因煙草總黃酮含量的多重比較分析Table 3　Multiple comparison analysis of flavonoids in GmMYB042 transgenic lines

2.4轉基因煙草的表型觀察

將轉基因煙草陽性苗及對照植株經煉苗后移栽到花盆中種植, 定期觀察其表型。結果發現GmMYB042基因及其突變體TB1的轉基因植株與對照NC89的表型沒有明顯差異。但是TB2～TB4突變體的轉基因植株的表型與對照NC89有明顯的差異(圖8-A)。這3個突變體的轉基因煙草均表現為節間增長、葉片變小、葉緣有明顯的皺褶(圖8-B), 暗示目的基因可能還參與葉的形態建成。

3　討論

MYB轉錄因子基因在植物基因組數量龐大, 是植物中最大的轉錄因子家族之一。雖然目前已有很多MYB基因的功能已被證明, 如參與次生代謝調控、激素和環境脅迫的應答、器官發育等[6-15], 但是這些研究進展主要集中在模式植物擬南芥中。擬南芥是研究基因功能的重要模式植物, 但是農藝性狀差, 其研究結果的應用價值有限。相對于擬南芥, 在具有重要農藝性狀的農作物中開展相關基因的挖掘和功能研究, 不僅具有重要的理論意義, 還具有重要的應用前景。類黃酮類化合物廣泛分布于豆科植物中, 具有非常重要的醫療和保健價值[16-19]。大豆是人類食物和類黃酮的主要來源, 因此挖掘和研究大豆中調控類黃酮生物合成的MYB轉錄因子基因、明確其功能, 可以為分子育種提高大豆類黃酮的含

量提供重要的基因資源和理論參考。鑒于此, 本研究對從大豆中克隆得到的GmMYB042基因在類黃酮生物合成的調控作用進行了系統的研究。

圖8　GmMYB042基因及其C端突變體轉基因煙草的表型Fig. 8　Phenotypic traits of transgenic tobacco lines of GmMYB042 gene and its C-terminal mutations

目前, 絕大多數的MYB轉錄因子被證實在植物生長發育過程中起轉錄激活作用, 但也有少數起轉錄抑制作用。例如, 矮牽牛中的AmMYB308基因抑制C4H、4CL和CAD基因的表達[30], 擬南芥的AtMYB4基因抑制C4H基因的表達[31]等。前期, 我們對MYB基因家族在陸生植物中分子進化機制的系統研究發現, 該類基因屬于一個在進化過程保守的S4亞家族。序列分析發現這類基因的C端均有一個保守氨基酸基序pdLNLD/ELXiG/S和一個鋅指結構[32], 推測它們可能與該類基因的轉錄抑制作用有關。GmMYB042基因也屬于S4亞家族, 其C端同樣含有一個保守的氨基酸基序PDLNLELTIS和鋅指結構(圖1-A)。鑒于此, 我們前期基于PCR技術對目的基因的這兩個結構域進行了序列刪除突變(圖1-A),并通過酵母單雜交實驗證明了該基序對目的蛋白的轉錄激活活性具有抑制作用[28]。為了進一步證實該基序的功能, 本研究在模式植物煙草中過表達了目的基因及其相應的缺失突變體序列。結果發現, GmMYB042基因及其突變體的過表達植株中類黃酮合成途徑的PAL、CHS、CHI、FLS基因的表達量有明顯的變化(圖7); GmMYB042轉基因植株的總黃酮含量明顯高于對照植株。上述研究結果說明GmMYB042基因對類黃酮的生物合成具有正調控作用。因此, 我們推測GmMYB042基因可能是通過抑制苯丙烷類代謝途徑中類黃酮代謝途徑的競爭性分支(共用同一代謝底物, 如木質素代謝途徑)相關酶基因的表達以提高類黃酮合成支路的代謝流量, 進而增加類黃酮的生物合成; 當GmMYB042蛋白因C端缺失PDLNLELTIS基序后, 其抑制作用降低, 代謝能量重新流向類黃酮合成途徑的競爭性分支, 進而導致類黃酮代謝途徑相關酶基因的表達量隨之降低(圖7)。以上結果為我們后續深入挖掘GmMYB042基因調控的下游靶基因, 利用定點突變技術研究該基序在目的蛋白抑制其下游靶基因表達的過程中的分子作用機制奠定了理論依據。

此外, 近年來有研究發現植物MYB轉錄因子廣泛參與植物對激素和抗逆脅迫的應答過程[10-15]。因此, 為了解析GmMYB042基因在大豆抗逆脅迫過程中的作用, 本研究還分析了目的基因在大豆中受激素和環境因子誘導的表達情況。結果證明GmMYB042基因的表達沒有明顯受到ABA、GA3、BA和NAA的誘導, 說明其不依賴于這4種激素的信號轉導途徑(圖6-A); 但是其表達明顯受到PEG、高鹽、低溫和UV-B輻射的誘導(圖5和圖6-B), 說明該基因可能參與植物的抗逆脅迫應答過程。本研究結果還表明GmMYB042基因的導入使煙草的葉形發生了明顯的變化, 證明目的基因可能還參與調控植株葉的形態建成(圖8)。本研究的相關工作主要是在模式植物煙草中完成的, 目的基因在大豆中的功能還有待我們進一步在大豆加以驗證和解析。

4　結論

GmMYB042基因在莖、花等組織中優勢表達,而且其表達受PEG、高鹽、低溫和UV-B的脅迫誘導, 證明該基因可能參與調控植物對這些環境因子的應答過程。GmMYB042基因及其突變序列的過表達明顯影響轉基因煙草中類黃酮合成途徑酶基因的

表達量, 且明顯提高了轉基因煙草總黃酮的含量,證明該基因參與調控類黃酮的生物合成; 該基因C端保守氨基酸基序和鋅指結構對其功能具有轉錄抑制作用, 影響其對類黃酮生物合成的調控作用。

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URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20151008.1403.026.html

Regulating Effects of GmMYB042 Gene on Flavonoid Biosynthesis

DU Hai1, RAN Feng1, MA Shan-Shan1, KE Yun-Zhuo1, SUN Li-Ping1, LI Jia-Na1,*, and TANG Yi-Xiong2,*
1College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China;2Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Abstract:MYB transcription factor is one of the largest transcription factor gene families in land plants, and is involved in a myriad of regulatory processes, such as secondary metabolism. In the present study, the expression profiles and function of GmMYB042 gene were systematically studied. In order to investigate the roles of the conserved amino acid motif PDLNLELTIS and a predicted zinc finger region at its C-terminal, a series of sequence deletions of these two regions were made by PCR method. Subsequently, the corresponding over-expression constructs of GmMYB042 gene and its mutants were made and transformed into tobacco NC89 with Agrobacterium LBA4404, respectively. Expression analyses revealed that GmMYB042 gene was expressed in nodule, root, stem, leaf, flower, pod, and seed of soybean, and with a relative higher expression level in stem, flower, and seed; its expression could be induced by PEG, high salt, low temperature, and UV-B radiation stresses. Over-expression analyses showed that the expressions of some enzyme genes in flavonoid biosynthesis pathway (including PAL, CHS, CHI, and FLS) were obviously increased in GmMYB042 transgenic lines, resulting in an increased content of the flavonoid compounds. Accordingly, the transcription levels of the corresponding enzyme genes involved in flavonoid biosynthesis pathway were decreased in the transgenic lines of GmMYB042 mutants, further supporting the conclusion of regulating role of GmMYB042 gene in tobacco flavonoid biosynthesis pathway.

Keywords:MYB transcription factor; Flavonoid; Deletion mutation; Functional research

收稿日期Received(): 2015-06-08; Accepted(接受日期): 2015-09-06; Published online(網絡出版日期): 2015-10-08.

通訊作者*(Corresponding authors): 李加納, E-mail: ljn1950@swu.edu.cn, Tel: 13509496702; 唐益雄, E-mail: yixiongtang@sohu.com, Tel: 010-62121506

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00001