聚合稻瘟病、白葉枯病和褐飛虱抗性基因的三系恢復系改良效果的評價

樓　玨　楊文清　李仲惺　羅天寬　謝永楚　鄭國楚　岳高紅徐建龍　盧華金,*

1溫州市農業科學研究院 / 浙南作物育種重點實驗室, 浙江溫州 325006;2溫州市植物保護站, 浙江溫州 325000;3中國農業科學院作物科學研究所 / 農作物基因資源與遺傳改良國家重大科學工程, 北京 100081

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聚合稻瘟病、白葉枯病和褐飛虱抗性基因的三系恢復系改良效果的評價

樓玨1楊文清1李仲惺2羅天寬1謝永楚1鄭國楚1岳高紅1徐建龍3盧華金1,*

1溫州市農業科學研究院 / 浙南作物育種重點實驗室, 浙江溫州 325006;2溫州市植物保護站, 浙江溫州 325000;3中國農業科學院作物科學研究所 / 農作物基因資源與遺傳改良國家重大科學工程, 北京 100081

摘要:結合分子標記輔助輪回選擇和田間鑒定的方法, 將三黃占2號的抗稻瘟病基因Pi-GD-1(t)和Pi-GD-2(t)(分別簡稱G1和G2)、CBB23中的抗白葉枯病基因Xa23 (簡稱X)和IR65482-7-216-1-2-B (簡稱IR65482)的抗褐飛虱基因Bph18(t) (簡稱B)導入溫恢845、溫恢117和溫恢143等3個中秈恢復系, 獲得了8個兼抗稻瘟病和褐飛虱聚合系, 溫恢845-G1-G2-B-4、溫恢845-G1-G2-B-5、溫恢117-G1-G2-X-B-3、溫恢143-G1-G2-B-3、溫恢143-G2-X-B-9、溫恢143-G2-X-B-10、溫恢143-G1-G2-B-11和溫恢143-G1-G2-B-37。這些聚合系及其與不育系五豐A的測交種, 對稻瘟病和褐飛虱的抗性水平接近或略低于稻瘟病抗性親本三黃占2號和稻飛虱抗性親本IR65482。部分改良恢復系如溫恢117-G1-G2-X-B-3、溫恢143-G2-X-B-9和溫恢143-G2-X-B-10及其測交種對白葉枯病表現為抗病或中抗。改良恢復系及其測交種在正常條件下的農藝性狀與原始恢復系及其測交種相仿或更優, 具有生產應用價值。研究結果表明, Xa23在不同恢復系背景下抗性表達完全, 而Pi-GD-1(t)、Pi-GD-2(t)和Bph18(t)對稻瘟病和褐飛虱抗性的改良效果與恢復系的遺傳背景有關。

關鍵詞:水稻恢復系; 稻瘟病; 白葉枯病; 褐飛虱; 抗性改良; 標記輔助選擇

本研究由浙江省農業科研重大專項(“8812”計劃, 2012C12901-17), 溫州市種子種苗科技創新專項(N20120019), 浙江省教育科學規劃課題(2015SCG183)和浙江省教育廳一般科研項目(Y201533916)資助。

This study was supported by Special Projects of the Zhejiang Agricultural Key Research (8812 Plan, 2012C12901-17) and Wenzhou Seeds and Seedlings Technology Innovation (N20120019), Project of the Zhejiang Education Science and Planning (2015SCG183) and General Research Program for the Education Department of Zhejiang Province (Y201533916).

第一作者聯系方式: E-mail: yyljlu@wzvcst.edu.cn

稻瘟病、白葉枯病、褐飛虱是水稻生產上主要病蟲害, 分別由稻瘟病菌(Pyricularia grisea Sacc.有性世代為Magnaporthe grisea)、水稻黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)和Nilaparvala lugens Stal.引起, 每年在全球各個水稻生產國或地區都有不同程度的發生, 嚴重時甚至會導致絕收[1-4], 極大地威脅著糧食安全, 還會導致稻米品質下降。

根據農業部全國農業技術推廣服務中心提供的雜交水稻的統計資料[5], 2011年全國年推廣面積在6.7×103hm2以上的雜交稻組合499個, 有抗性表現的雜交稻組合共計485個, 其中抗稻瘟病雜交稻組合266個, 占全國大面積種植雜交稻的54.85％; 抗白葉枯病雜交稻組合198個, 占40.82％; 抗褐飛虱雜交稻組合18個, 占3.71％; 抗白背飛虱雜交稻組合6個, 占1.24％; 兼抗稻瘟病和白葉枯病的102個, 占21.30％; 兼抗稻瘟病和稻飛虱的7個, 占1.44％; 兼抗白葉枯病和稻飛虱的12個, 占2.47％; 兼抗3種抗性的3個, 僅占0.62％。可見, 目前我國種植的雜交稻組合抗病蟲性普遍不高。由于稻瘟病和白葉枯病生理小種的變異, 褐飛虱生物型的改變, 導致抗病品種的小種專化抗性容易喪失[6-8], 引起病蟲害的暴發流行。水稻生產因病蟲危害造成大幅減產的事件時有報道, 如何提高水稻品種抗性的持久性和廣譜性, 延長品種使用壽命是育種工作者急需解決的問題。

目前, 已報道80多個稻瘟病抗性基因, 并鑒定出眾多廣譜或持久抗稻瘟病的抗源, 如Moroberekan、Dourode Perecose、0S6、IR36、IR42、Tetep、三黃占2號、地谷、谷梅2號和湘資3150等[9]。廣東省農業科學院育成的三黃占2號不僅對國內稻瘟病菌株表現廣譜、穩定、持久的抗性, 而且對菲律賓稻瘟病病菌也達到98％的抗性頻率[10]。經鑒定, 三黃占2號攜帶Pi-GD1(t)、Pi-GD2(t)和Pi-GD3(t) 3個稻瘟病抗性主基因, 以及位于第2和第7染色體上的3個抗稻瘟病QTL[11]。多個質量和數量抗性基因的聚集確保了三黃占2號在生產上十多年穩定持久的稻瘟病抗性。至少有35個水稻抗白葉枯病基因被發掘和鑒定[12], 其中Xa23是從普通野生稻中鑒定的一個在全生育期表現廣譜、高抗白葉枯病的基因, 位于第11染色體SSR標記RM206和RAPD標記RpdH5的區間內, 與2個標記間的遺傳距離分別為1.9 cM和7.0 cM,該抗性基因轉移性強[13], 具有廣闊的應用前景。已發掘和鑒定了27個抗褐飛虱的主效基因[14-15], 其中Bph18(t)基因是一個廣譜、高抗的顯性主效基因, 高抗我國褐飛虱生物型I和生物型II種群[16], 該基因已被Jena等定位在水稻第12染色體上, 并設計了與之緊密連鎖的分子標記[17]。

本研究通過分子標記輔助選擇, 回交育種和田間鑒定, 將抗稻瘟病基因Pi-GD-1(t)、Pi-GD-2(t)和Pi-GD-3(t), 抗白葉枯病基因Xa23以及抗褐飛虱基因Bph18(t)聚合到中秈恢復系溫恢845、溫恢117和溫恢143中, 選育帶有抗性基因且農藝性狀優良的改良恢復系, 評價各抗性基因的抗性改良效果, 以期為雜交稻抗病蟲育種提供理論依據。

1　材料與方法

1.1供試材料

抗性供體親本為攜帶抗稻瘟病主基因Pi-GD-1(t)、Pi-GD-2(t)和Pi-GD-3(t)(分別簡稱G1、G2和G3)的三黃占2號, 攜帶抗白葉枯病基因Xa23 (簡稱X)的CBB23, 以及攜帶抗褐飛虱基因Bph18(t)(簡稱B)的IR65482-7-216-1-2-B (簡稱IR65482)。受體親本溫恢845、溫恢117和溫恢143是溫州市農業科學研究院育成的中秈三系恢復系。選擇細胞質雄性不育系五豐A與原始恢復系及抗性改良恢復系配制測交種, 進行雜種優勢和抗性評價。原豐早、IR24和臺中本地1 號(TN1)分別作為稻瘟病、白葉枯病和褐飛虱接種評價的對照品種。

水稻苗瘟分菌株接種和抗性評價的稻瘟病菌株共有16個, 包括7群15個小種(2012-2B1, 2005-20-1B1, 2011-44B3, 2009-30-1B11, 2012-43B13, 2010-45B25, 2011-91B29, 2007-90C13, 2011-213C15, 2009-312A49,

2012-105-1D1, 2009-104-2D3, 2007-034-4E1, 2007-234E3, 2013-13F1, 2012-067G1), 葉苗瘟混合接種的稻瘟病菌株為13-98 (ZA1)、13-46 (ZA9)、12-217 (ZB9)、10-151 (ZC1)、13-76 (ZC11), 皆是我國主要的致病菌株。

水稻白葉枯病接種和抗性評價的菌株C5 (GD1358)是我國V型致病力較強的菌株。

1.2分子標記輔助改良抗性

三黃占2號、CBB23和IR65482分別與溫恢845、溫恢117和溫恢143雜交得到F1, 然后選擇供體親本不同而受體親本相同的F1彼此復交, 復交F1植株與第3個供體親本和相同受體親本的F1再次復交, 復交后代選株與輪回親本回交, 通過連續回交與自交,聚合抗稻瘟病、抗白葉枯病和抗褐飛虱基因于同一恢復系中(圖1)。在每輪復交和回交世代, 苗期分單株提取DNA, 利用與抗性基因緊密連鎖的分子標記(表1), 進行PCR擴增檢測抗性基因, 結合表型目測,篩選攜帶目標抗性基因且與輪回親本表型接近的個體進行后續的回交或自交。結合綜合農藝性狀選擇和分子標記輔助選擇, 最終選育出農藝性狀與輪回親本相似的穩定抗性改良恢復系。

圖1　分子改良恢復系稻瘟病、白葉枯病和褐飛虱抗性的圖示Fig. 1　Sketch of molecular improvement of blast, bacterial leaf blight, and brown planthopper resistance for restorer lines

表1　稻瘟病、白葉枯病和褐飛虱抗性基因緊密連鎖的分子標記信息Table 1　Information of molecular markers associated with resistance genes for rice blast, bacterial leaf blight, and brown planthopper

1.3抗性改良恢復系及其測交種的抗性評價

2014年夏, 對原始恢復系和改良恢復系分別于浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所開展苗葉瘟的混合接種鑒定和16個菌株人工接種鑒定; 于稻瘟病重發區浙江省文成縣三源村開展自然誘發穗瘟的抗性鑒定。參照倪大虎等的方法進行苗瘟的混合接種和單個菌株接種[18]。將試驗品種(系)和對照原豐早、三黃占2號的種子浸種催芽后, 按順序均勻播種在帶孔、裝有細土、穴間隔3 cm的塑料盤中,每個品種(系) 10～15粒。供試品種(系)長至三葉一心時, 用彌霧噴霧器將濃度約為2×105個孢子 mL–1的稻瘟病菌(Pyricularia oryzea)分生孢子懸浮液噴灑于秧苗上, 接種量為每百株苗30 mL懸浮液。接種后將供試秧苗置網室內, 用黑色塑料布遮光保濕24 h, 然后去除遮光條件, 在遮陰保濕條件下培養10 d, 待感病對照品種原豐早稻瘟病情穩定時, 根據目測法調查每個品種(系)所有植株的病斑大小,取平均值。根據國家標準GB/T 15790-2009將抗性分級指標劃分為9級, 1～3級分別為HR、R和MR, 4～5級為MS, 6～7級為S, 8～9級為HS[19]。試驗設2次重復。苗葉瘟單個菌株接種鑒定中, 按照MR以上為抗病, 其他為感病計算抗性頻率。穗瘟鑒定試驗以感病對照原豐早作為誘發品種, 以原豐早和三黃占2號為對照, 每個品種(系)材料種植2行, 每行7株, 行株距20 cm ×17 cm, 設2次重復。黃熟期對2行中間的6株進行穗瘟調查, 參照國家標準GB/T 15790-2009評價穗瘟的抗性, 將抗感反應型劃分為高抗、抗、中抗、中感、感和高感6級[19]。

委托中國農業科學院作物科學研究所完成原始恢復系和白葉枯抗性改良恢復系及其測交種的白葉枯病抗性鑒定。2014年夏, 將供試材料播種于中國農業科學院作物科學研究所水槽, 每份材料種植2 行, 每行種6株, 行株距為20 cm×17 cm, 設2次重復。待孕穗期采用剪葉法[18], 接種中國強致病力白葉枯病菌系C5, 菌液濃度為5×108mL–1, 接種每個品種(系)中間的4株, 每株從葉尖剪去1～2 cm, 每株接種2～3片葉。接種20 d后, 當感病對照IR24發病情況穩定后, 調查植株的抗性表現。根據4株接種植株上病斑占葉面積百分率的平均值劃分抗性級別: 剪口處無明顯病斑的為高抗(HR); ≤10％為抗(R); 11％～20％為中抗(MR); 21％～40％為中感(MS); 41％～ 75％為感病(S); ≥75％為高感(HS)。

在中國水稻研究所開展褐飛虱抗性鑒定, 參照劉光杰等[20]的方法, 將催芽后的原始恢復系和抗性改良恢復系及其測交種, 以及感蟲對照品種TN1按照行長20 cm, 行距5 cm, 每行20粒的規格播種在塑料盆內, 設置2次重復。當秧苗長至二至三葉時, 向每株秧苗平均接入5～7頭1～2齡的褐飛虱若蟲。當感蟲對照品種TN1的死苗率達到95％時, 根據各供試材料的死苗率評定抗性級別[20], 即死苗率≤1.0％為0級; 1.1％～10.0％為1級; 10.1％～30.0％為3級; 30.1％～ 50.0％為5級; 50.1％～70.0％為7級; >70.0％為9級。取2次重復的平均值作為鑒定結果。

1.4抗性改良恢復系及其測交種的綜合農藝性狀評價

2014年夏, 在溫州市農業科學研究院藤橋基地對原始恢復系和抗性改良恢復系及其測交種開展綜合農藝性狀評價。采用2次重復的隨機區組試驗, 每個材料種植3行, 每行10株, 株行距為30.0 cm×23.3 cm, 外設保護行。待到成熟時取每份材料中間的5株測定株高和有效穗數, 從中間5株上取2個主穗考察穗長、每穗總粒數、每穗實粒數、結實率和千粒重等性狀, 混收中間5株計算單株產量[21]。用SPSS軟件處理和分析所得數據。

2　結果與分析

2.1抗性改良恢復系的選育

利用與Pi-GD-1(t)、Pi-GD-2(t)、Pi-GD-3(t)、Xa23 和Bph18(t)緊密連鎖的分子標記(表1)分析供體親本與3個恢復系之間的標記多態性, 除與抗稻瘟病基因Pi-GD-3(t)緊密連鎖的分子標記RM179在3個受體親本與抗源供體間均不存在多態性外, 其他標記都具有良好的多態性并易于開展分子標記檢測抗性基因。

在選育抗性改良恢復系的過程中(圖1), 從復交F1世代至BC4F2, 每一代都進行分子標記輔助選擇,篩選攜帶目標抗性基因且農藝性狀接近輪回親本的單株進行后續的回交或自交(圖2)。以溫恢845抗性改良為例, 溫恢845分別與三黃占2號、CBB23和IR65482雜交獲得F1, 將溫恢845/三黃占2號F1植株與溫恢845/CBB23 F1復交, 得到復交群體620株, 利用與Pi-GD1(t)、Pi-GD2(t)和Xa23緊密連鎖的分子標記RM6208、RM3855和RM206檢測, 篩選出同時帶有3個抗性基因的個體45株, 從中選擇農藝性狀接近輪回親本溫恢845的個體3株, 分別與溫恢845/IR65482 F1植株復交, 得到780個第2次復交群體, 利用分子標記篩選出攜帶Pi-GD1(t)、Pi-GD2(t)、Xa23和Bph18(t)

基因的25個單株, 從中選擇綜合性狀接近溫恢845的個體3株, 分別與溫恢845回交, 共產生BC1F1群體545株, 后續3次連續回交都針對上述4個抗性基因進行分子檢測, 每次選擇聚合4個抗性基因且農藝性狀近似溫恢845的個體3株分別與溫恢845回交,產生下一代回交群體, 其中BC2F1、BC3F1和BC4F1群體分別有446、686和850株, 從BC4F1群體中選擇聚合4個抗性基因且農藝性狀與溫恢845相似的個體3 株, 混合種成860株規模的BC4F2群體, 結合抗性基因的分子標記檢測, 從中選擇不同抗性基因純合的聚合體種成BC4F3株系, 擇優用于與五豐A測定雜種優勢。

綜合分子標記檢測結果和各株系的綜合農藝性狀, 從3個恢復系回交改良后代初步選育出52個BC4F3穩定改良恢復系, 與五豐A配制相應的測交種。進一步對這些改良株系及其測交種進行抗病蟲鑒定, 最終選出攜帶2個或3個抗性基因、農藝性狀與輪回親本相似的改良恢復系8個, 分別命名為溫恢845-G1-G2-B-4、溫恢845-G1-G2-B-5、溫恢117-G1-G2-X-B-3、溫恢143-G1-G2-B-3、溫恢143-G2-XB-9、溫恢143-G2-X-B-10、溫恢143-G1-G2-B-11和溫恢143-G1-G2-B-37 (圖3)。

圖2　與抗瘟基因Pi-GD-1(t)緊密連鎖的RM6208標記在溫恢845×三黃占2號BC4F1群體中PCR擴增結果Fig. 2　PCR amplification of the marker RM6208 linked to the blast resistance gene Pi-GD-1(t) in the BC4F1population derived from Wenhui 845×Sanhuangzhan 2

圖3　改良恢復系抗性基因分子標記驗證Fig. 3　Confirmation of the resistances for the improved restorer lines using molecular markers

2.2抗性改良恢復系的稻瘟病抗性評價

抗性親本三黃占2號在自然誘發穗瘟和混合接種苗瘟條件下分別表現抗病和高抗, 分菌株接種除對S14表現中感外, 其他菌株皆表現抗性, 抗性頻率達到93.75％, 表現高水平抗性; 感病對照原豐早高感穗瘟, 感苗瘟, 僅對4個稻瘟病菌株有抗性, 抗病頻率為25.00％, 表現高度感病(表2)。3個恢復系親本在3種不同稻瘟病鑒定條件下表現出不同的抗性水平, 溫恢117混合接種苗瘟和自然誘發穗瘟分別表現感病和中抗, 對16個菌株中的15個表現出抗性,抗性頻率為93.75％; 溫恢143中感苗葉瘟, 感穗瘟, 對S2、S7、S10 3個菌株表現感病, 抗性頻率為81.25％; 溫恢845感苗葉瘟, 中感穗瘟, 對S1、S2、S6和S15 4個菌株表現感病, 抗性頻率為75.00％。可見, 3個恢復系親本中, 溫恢117的稻瘟病抗性表現最好, 溫恢845最差。

8個多基因聚合恢復系對16個稻瘟病菌株、混合接種以及自然誘發的抗性表現強于溫恢845, 優于或相似于溫恢117和溫恢143。溫恢845的稻瘟病抗性改良效果明顯, 苗瘟和穗瘟抗性都得到了較好的改良。8個稻瘟病抗性改良恢復系在自然誘發穗瘟和混合接種苗瘟條件下抗性表現為中感至抗不等,其對16種稻瘟病菌株的抗性頻率變化范圍在75.00％～ 93.75％ (表2)。除溫恢117-G1-G2-X-B-3的抗性頻率沒有變化, 溫恢143-G2-X-B-11的抗性頻率低于原始親本溫恢143, 苗瘟抗性與親本相同外, 8個改良恢復系在抗性頻率, 苗瘟或穗瘟上都得到了不同程度的改善。

2.3抗性改良恢復系及其測交種的白葉枯病抗性評價

孕穗期接種中國強致病力白葉枯病菌系C5, CBB23表現抗病, IR24表現高度感病。溫恢117和溫恢143表現感病, 而攜帶Xa23基因的3個改良恢復系均表現抗白葉枯病(表3), 抗性改良效果顯著。抗性改良恢復系測交組合的白葉枯病皆表現為中等抗性,優于原始親本測交組合; 其抗性水平之所以達不到抗級, 主要是由于測交的不育系五豐A感白葉枯病。

2.4抗性改良恢復系及其測交種的褐飛虱抗性評價

溫恢117、溫恢143、五豐A和感蟲對照品種TN1對褐飛虱的抗性均為9級, 表現為高感褐飛虱, 溫恢845中感褐飛虱, 抗性品種IR65482平均抗性級別為0.5級, 表現高抗(表4)。8個抗性改良恢復系中有7個褐飛虱抗性得到了明顯提高, 1個與輪回親本相似,其中溫恢143-G1-G2-B-3抗性最好, 達到0.5級。3個輪回親本與五豐A配制的測交種的褐飛虱抗性表現為9級高感, 8個改良恢復系與五豐A的測交種褐飛虱抗性優于或等于原始親本的測交種但略差于或等于改良恢復系自身, 表明Bph18(t)基因的導入能提高恢復系的褐飛虱抗性水平, 但改良效果可能與被改良恢復系的遺傳背景有關。

2.5抗性改良恢復系及其測交種的綜合農藝性狀表現

與原始恢復系比, 所有改良恢復系的株高、穗長、穗粒數都有所降低, 結實率都得到了提高, 但差異顯著性各不相同, 而單株產量與原始恢復系差異不明顯。改良恢復系與五豐A測交種的農藝性狀與原恢復系與五豐A的測交種的基本相仿, 僅溫恢143-G2-X-B-10測交種的單株產量極顯著高于原始恢復系的測交種產量(表5)。

3　討論

溫恢845、溫恢117、溫恢143是溫州市農業科學研究院育成的強三系恢復系, 其配制的多個組合如II優845、宜優845、K優117等通過了浙江省、湖南省和江西省等多地審定[22-24]。但是溫恢845, 溫恢117和溫恢143對稻瘟病、白葉枯病和褐飛虱的抗性表現一般, 配制的雜交稻組合的抗性也相對較差。隨著推廣面積的擴大, 必然會存在病蟲害大規模爆發的潛在威脅。因此, 利用轉育抗性強、抗譜廣的抗性基因改良恢復系, 提高雜交組合抗擊病蟲害的能力顯得尤為重要。本研究通過利用分子標記輔助選擇和田間雜交、回交, 將抗性親本三黃占2號, CBB23和IR65482中的3個抗稻瘟病基因, 抗白葉枯病基因Xa23和抗褐飛虱基因Bph18(t)導入到中秈恢復系溫恢117、溫恢845和溫恢143中, 獲得了抗性水平得到改善且農藝性狀與輪回親本基本一致的多個抗性基因聚合恢復系8個, 其與五豐A配制的測交種的白葉枯病抗性和褐飛虱抗性水平都優于原始恢復系與五豐A配制的組合。因此, 本研究得到的8個改良恢復系既是水稻抗病育種新的種質資源, 又具有良好的生產應用價值。

據報道, 三黃占2號中攜帶了3個抗稻瘟病基因Pi-GD-1(t)、Pi-GD-2(t)和Pi-GD-3(t), 其緊密連鎖的分子標記分別為RM6208、RM3855和RM179[11]。本研究中, RM6208和RM3855在抗源三黃占2號和輪回

親本間有較好的多態性差異, 利用分子標記輔助選擇鑒定跟蹤抗性基因流向, 確保了抗性基因正常導入的可行性和操作性; 但是RM179在恢復系與抗源供體間未能檢測到多態性, 因而不能確定三黃占2號所攜帶的Pi-GD-3(t)基因是否導入改良系。在陳凱等的研究中也發現同樣的情況[21]。由于多個抗性基因的聚合涉及到的親本較多, 分子標記輔助選擇的難度和復雜性要比轉育單個抗性基因更高。因此,進一步加強水稻抗性基因的分子標記開發顯得十分重要。通過利用已知秈、粳稻全基因組序列的SNP位點設計開發標記, 或者根據克隆基因序列信息開發位于基因內部的功能標記, 確保所開發的標記在不同的抗性差異材料間具有豐富的多態性, 提高選擇效率及準確率, 以便能更好地應用于分子標記輔助選擇聚合育種, 為抗病蟲育種提供有力的技術支持。

表3　改良恢復系及其測交種孕穗期對白葉枯病菌C5菌系的抗性評價Table 3　Evaluation of resistance of the improved restorer lines and their tester lines to the virulent Chinese strain C5 of Xanthomonas oryzae pv. oryzae at the booting stage

從抗性鑒定結果可知, 導入Xa23基因的改良恢復系的白葉枯病抗性水平與抗源CBB23相同, 都表現為抗病, 說明該基因的白葉枯病抗性表達徹底,并不會因為遺傳背景的差異影響其抗性表現, 是一個非常利于分子標記輔助選擇育種的白葉枯病抗性基因, 這與Zhang等[25]的研究結果一致。導入Bph18(t)基因后, 在一定程度上提高了改良恢復系的褐飛虱抗性水平, 但未達到抗源供體IR65482的水平, 表明該基因的抗性表達較易受到遺傳背景的影響, 這與陳凱等的研究結果一致[21]。三黃占2號抗稻瘟病基因的導入, 對溫恢845的抗性改良效果顯著, 對溫恢143的抗性有不同程度的改善, 對溫恢117的改善不明顯, 這可能與溫恢117自身抗性相對較好, 所攜帶的抗瘟基因與三黃占2號存在一定程度的同質性有關。說明作為優質稻瘟病抗源的三黃占2號可以較好地改良稻瘟病抗性相對較差恢復系的抗瘟性, 但若利用其改良本身抗性水平較高的恢復系, 由于抗瘟基因同質性等原因, 可能存在改良效果不佳的潛在風險。改良恢復系中溫恢845-G1-G2-B-4和溫恢143-G2-X-B-10的抗性頻率要高于溫恢845-G1-G2-B-5和溫恢143-G2-X-B-9, 稻瘟病綜合抗性表現也更好,這可能是由于無法用分子標記檢測的Pi-GD-3(t)基因在回交過程中被轉入前面兩個改良恢復系, 提高了其抗性水平, 也可能是因為溫恢845和溫恢143遺傳背景中未知位點與Pi-GD-1(t)或Pi-GD-2(t)基因產生互作效應進而提高了抗性水平, 這些互作位點的定位和效應還有待進一步發掘和驗證。分子標記檢測結果顯示, 溫恢143-G1-G2-B-11攜帶Pi-GD-1(t)和Pi-GD-2(t)基因, 但其稻瘟病抗性頻率低于原始親本, 這可能是在多代回交選育過程中發生小概率的遺傳交換事件, 導致了抗性基因的喪失[26]。因此, 在利用分子標記輔助選擇進行抗性選育的過程中要適當減少回交次數, 擴大回交群體的容量, 提高農藝性狀和抗性兼顧株系入選的幾率。

利用回交選育的方法進行恢復系的抗性改良是行之有效的方法, 但是培育出的株系在綜合農藝性狀及配合力方面與原始親本表現相似, 很難實現突破。正如本研究中篩選出的8個抗性改良恢復系, 雖然抗性在不同程度上得到了改良, 但是農藝性狀方面基本上與輪回親本差異不明顯。因此, 為了突破原有恢復系的潛力限制可以嘗試開展攜帶抗性基因不同背景恢復系之間的復交, 在分子標記輔助選擇目的抗性基因的基礎上, 根據分離世代中所產生重組體的綜合農藝性狀及配合力表現, 進行抗性與產量等的同步改良。如潘曉飚等利用浙恢7954/三黃占2號的F1與明恢86/IRBB23的F1的復交后代選育的雙抗聚合恢復系明浙-G1-G2-G8-Xa23, 即為一個產量和抗性同步改良的苗頭恢復系[27]。

需要指出的是, 由于改良恢復系與五豐A配制測交種的種子量有限, 本研究沒有開展其稻瘟病抗性評價, 因而對三黃占2號改良雜交組合的稻瘟病抗性還缺少研究數據, 有待今后進一步完善。

4　結論

利用分子標記輔助選擇和回交育種技術, 將三黃占2號抗稻瘟病基因Pi-GD-1(t)和Pi-GD-2(t)、CBB23抗白葉枯病基因Xa23和IR65482抗褐飛虱基因Bph18(t)聚合到溫恢845、溫恢117和溫恢143三個恢復系中, 得到了8個攜帶2～3個抗性基因的改良恢復系。這些改良恢復系及其與五豐A測交種的稻瘟病和褐飛虱抗性得到了明顯的提高, 抗性水平接近或略低于三黃占2號和IR65482。3個白葉枯病改良恢復系的抗性水平與CBB23相同, 表現抗病; 測交種表現中抗。在正常條件下, 改良恢復系及其測交種的農藝性狀與原始恢復系及其測交種相似或更優, 具有較好的應用前景。

致謝: 感謝浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所柴榮耀和郝中娜幫助稻瘟病抗性評價, 中國水稻研究所胡陽協助褐飛虱抗性評價。

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URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20151013.1508.002.html

Evaluation of Improvement Effect of Restorer Lines on Pyramiding Genes Resistant to Rice Blast, Bacterial Leaf Blight and Brown Planthopper

LOU Jue1, YANG Wen-Qing1, LI Zhong-Xing2, LUO Tian-Kuan1, XIE Yong-Chu1, ZHENG Guo-Chu1, YUE Gao-Hong1, XU Jian-Long3, and LU Hua-Jin1,*
1Southern Zhejiang Key Laboratory of Crop Breeding, Wenzhou Academy of Agricultural Sciences, Wenzhou 325006, China;2Wenzhou Plant Protection Station, Wenzhou 325000, China;3Institute of Crop Science / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Abstract:The novel blast resistance genes, Pi-GD-1(t) and Pi-GD-2(t) (abbreviated as G1 and G2, respectively) from rice cultivar Sanhuangzhan2, bacterial blight resistance gene Xa23 (abbreviated as X) from CBB23 and brown planthopper resistance gene Bph18(t) (abbreviated as B) from IR65482-7-216-1-2-B (abbreviated as IR65482) were introgressed into three rice restorer lines, Wenhui 845, Wenhui 117 and Wenhui 143, by marker-assisted backcross and pyramiding breeding methods integrated with artificial inoculation, natural induction and phenotypic selections. The eight resistant restorer lines pyramiding blast and brown planthopper resistance genes, i.e. Wenhui 845-G1-G2-B-4, Wenhui 845-G1-G2-B-5, Wenhui 117-G1-G2-X-B-3, Wenhui 143-G1-G2-B-3, Wenhui 143-G2-X-B-9, Wenhui 143-G2-X-B-10, Wenhui 143-G1-G2-B-11, and Wenhui 143-G1-G2-B-37, and

their tester lines crossed with the sterile line Wufeng A demonstrated the similar or slight lower level of resistance against rice blast and brown planthopper as compared with the resistant donor parents Sanhuangzhan 2 or IR65482. Part of developed restorer lines (Wenhui 117-G1-G2-X-B-3, Wenhui 143-G2-X-B-9, and Wenhui 143-G2-X-B-10) and their tester lines showed resistance or moderate resistance to bacterial blight. The newly developed restorers resistant to blast, bacterial blight and brown planthopper were similar or superior to their respective original types in agronomic traits under normal condition, implying these resistant restorer lines can be useful in hybrid rice breeding and production. The results indicated that Xa23 could completely express its dominant resistance against different restorer genetic backgrounds whereas effects of resistance improvement in Pi-GD-1(t), Pi-GD-2(t), and Bph18(t) depend on their genetic background.

Keywords:Rice restorer lines; Blast; Bacterial blight; Brown planthopper; Resistance improvement; Marker-assisted selection

收稿日期Received(): 2015-06-12; Accepted(接受日期): 2015-09-06; Published online(網絡出版日期): 2015-10-13.

通訊作者*(Corresponding author): 盧華金, E-mail: luhjzw@163.com

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00031