兩個谷子CIPK基因在非生物逆境脅迫下的表達分析

余愛麗　趙晉鋒　王高鴻　杜艷偉　李顏方　張　正郭二虎　梁愛華

1山西大學生物技術研究所, 山西太原 030006;2山西省農業科學院谷子研究所 / 特色雜糧種質資源發掘與育種山西省重點實驗室,山西長治 046011

?

兩個谷子CIPK基因在非生物逆境脅迫下的表達分析

余愛麗1,2趙晉鋒1,2王高鴻2杜艷偉2李顏方2張正2郭二虎2梁愛華1,*

1山西大學生物技術研究所, 山西太原 030006;2山西省農業科學院谷子研究所 / 特色雜糧種質資源發掘與育種山西省重點實驗室,山西長治 046011

摘要:CIPK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶, 該蛋白在植物響應逆境脅迫過程中發揮重要作用。本文利用生物信息學方法從谷子基因組中鑒定出2個CIPK基因, 命名為SiCIPK6和SiCIPK16。序列分析表明SiCIPK6基因組序列長1994 bp,編碼451個氨基酸; SiCIPK16基因組序列長1885 bp, 編碼473個氨基酸, 2個基因均無內含子和可變剪切。生物信息學分析顯示這2個基因在蛋白質序列和結構上與其他物種CIPK基因一樣非常保守。實時定量PCR分析表明SiCIPK6和SiCIPK16在ABA、低溫、高溫、干旱、高鹽誘導下表達量均有所上調, SiCIPK6基因在ABA、干旱和鹽處理時表達量上調幅度較大, 而SiCIPK16基因在低溫、干旱和高溫處理時表達量上調幅度較大。半定量PCR檢測結果表明SiCIPK6 和SiCIPK16兩個基因在拔節、孕穗、灌漿期時均有表達, 在相應生育時期受到干旱脅迫時它們表達量均有所提高。推測SiCIPK6和SiCIPK16基因在谷子的干旱或其他逆境脅迫中起一定作用。

關鍵詞:谷子; CIPK基因; 逆境

本研究由山西省基礎研究項目(2015011071), 山西省生物工程重點實驗室開放基金項目和山西省農業科學院科技自主創新能力提升工程項目(2015ZZCX-09)資助。

This study was supported by the grants from Natural Science Foundation of Shanxi Province (2015011071), the Key Laboratory Open Fund Project of Bio-engineering in Shanxi Provincial, and the Enhance Technology Independent Innovation Ability Project in Shanxi Academy of Agricultural Sciences (2015ZZCX-09).

第一作者聯系方式: E-mail: yuailimail@126.com

谷子[Setaria italica (L.) P. Beauv.]起源于我國黃河流域, 由狗尾草經人工選擇和進化而來, 在我國已有8500多年的栽培史, 目前是我國干旱和半干旱地區廣泛種植的區域性特色資源作物[1]。谷子是C4作物, 種子發芽需水少、蒸騰系數低、凈光合強度和水分利用效率高, 具有抗逆性強、適應性廣等特點, 而且谷子基因組小, 高度保守、穩定, DNA重復度低, 是抗逆遺傳和分子生物學研究的理想材料[2-3]。近年來隨著國內外谷子測序工作的完成以及谷子全基因組序列的公布, 谷子耐逆關鍵基因發掘和逆境應答調控機制逐漸成為研究熱點。

非生物逆境下脅迫會嚴重影響植物的萌發、幼苗存活、生物產量、葉片展開度、光合作用強度以及生長發育,嚴重的還會導致植株死亡[4-5]。研究表明非生物逆境脅迫中的干旱、鹽漬、低溫對植物的影響最為明顯, 是制約農作物產量和品質的主要限制因素[6]。在非生物逆境脅迫下植物不僅要感知逆境, 而且要把逆境信號傳遞下去, 激活下游的信號通路來應對不利環境。Ca2+是眾所周知的第二信使, 能夠感知逆境的發生并且能夠傳遞信息啟動逆境應答機制[7-8]。CBL (calcineurin B-like protein)是一類鈣離子感應蛋白, 能夠感知細胞內鈣離子濃度變化, 然后與其靶蛋白CIPK (CBL-interacting protein kinase)互作, 構成的復合物能夠把脅迫信號傳遞下去, 啟動細胞內相關應答基因的轉錄和翻譯來應對脅迫[9]。

CIPK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶, 在植物體內以多基因家族方式存在, 在苔蘚、蕨類、裸子植物以及單子葉和雙子葉植物中都發現有CIPK和CBL家族基因存在[10-12]。CIPK基因在響應逆境脅迫、病原體與防御反應、營養元素吸收與平衡、激素應答等植物生長和發育過程中發揮著重要的作用, 尤其與非生物逆境脅迫的信號傳導密切相關[13]。擬南芥AtCIPK24 (SOS2)參與鹽脅迫應答信號途徑, SOS2通過與鈣結合蛋白AtCBL4 (SOS3)互作, 分別在液泡膜和質膜上行使各自功能保護植株免受鹽脅迫的傷害[14-19]。AtCBL1/AtCBL9-AtCIPK23和AKT1互作通過磷酸化/去磷酸化機制調控質膜K+通道的活性和細胞K+吸收從而維持胞內K+平衡[20-21]。AtCIPK8被高濃度硝酸鹽快速誘導,通過控制硝酸鹽轉運體CHL1和NRT2.1的表達水平正調控硝酸鹽的低親和應答, Atcipk8突變后抑制硝酸鹽響應基因及硼轉運體BOR1的表達[22]。小麥TaCIPK14、TaCIPK29和玉米ZmCIPK21被報道在鹽脅迫條件下會在鈉離子轉運、ROS代謝, 鉀離子平衡和ABA信號傳導方面起一定作用[23-25]。水稻OsCIPK23和OsCBL1已被證實能激活水稻OsAKT1[26], 另外葡萄中的VvKT1.1和VvKT1.2也被證明在灌漿期會受到CBL和CIPK的調控[27-28]。ZmCIPK16被證明在鹽脅迫條件下能夠部分代替AtCIPK24的功能[29]。到目前為止針對CBL和CIPK開展的主要研究領域聚焦在證明CBLs和CIPKs的互作以及他們互作的位置和突變體在不同逆境脅迫下的表型分析, 因此解析CBLs和CIPKs功能要基于對CIPK和CBL組成的信號網絡系統的充分了解, 首先要清楚CIPKs參與了哪些逆境脅迫應答, 在哪些逆境信號通路中起作用。

已有研究表明CBL/CIPK信號網絡系統在植物對逆境應答過程中起重要作用, 加之谷子是我國典型的抗旱耐瘠特色作物, 因此研究谷子的CIPK基因, 發掘谷子抗逆相關基因在分子水平上闡明谷子耐逆機理和調控機制具有重要的理論意義和廣闊的應用前景。目前在許多作物中均發現了CIPK基因家族, 谷子中僅有CBL被報道[30], CIPK基因尚未見被報道。本文通過生物信息學方法從谷子數據庫中得到2個谷子CIPK基因, 我們對這2個基因的結構、序列特征進行了預測和分析, 研究了它們在幼苗期不同逆境脅迫下的動態表達模式及在拔節、抽穗、灌漿等生育時期受到干旱脅迫時的表達情況, 旨在為進一步分析CIPK基因在谷子逆境應答中的功能和機制提供一些有益線索。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

以豫谷1號為試驗材料, 當幼苗生長至三葉期時按照已有研究描述的方法[31-33]分別進行ABA (100 μmol L–1)、低溫(4℃)、高溫(42℃)、干旱、鹽(250 mmol L–1NaCl)處理, 在處理的0、1、3、6、12和24 h取整株幼苗。另外, 當植株生長至拔節、抽穗、灌漿期時, 采用自然控水方式至植株葉片微卷、葉色由鮮綠色變為灰色呈現缺水狀態時取處理及對照樣品葉片, 立即在–80℃冰箱中速凍備用。試驗設2次生物學重復, 所用TRIzol、Real-time PCR試劑盒、逆轉錄酶、LA Taq DNA聚合酶和RNA酶抑制劑購自寶生物工程有限公司; 引物由生工生物工程(上海)有限公司合成; 其他試劑購自生工生物工程(上海)有限公司。

1.2植物總RNA的提取和引物設計

參照TRIzol試劑盒使用說明用TRIzol試劑提取所有材料總RNA, 參照《分子克隆》第3版配制其他所需試劑[34]。根據SiCIPK、SiGAPB轉錄序列, 用軟件Primer Primer 5.0設計SiCIPK、SiGAPB的Real-time PCR和半定量PCR特異性引物。

1.3SiCIPK基因發掘和生物信息學分析

利用玉米中已鑒定CIPK基因序列進行比對, 在JGI谷子數據庫(Ver. 2.1)發現了2個CIPK基因(SiCIPK6、SiCIPK16)。利用ExPASy中ProtParam pI/Mw在線工具對蛋白序列的理化性質、氨基酸組成等一級結構進行預測;利用SignalP 4.1 Server進行信號肽分析; 利用ProtScale進行疏水性/親水性預測、Profun 2.2 Server進行功能預測;利用Psort在線工具對編碼蛋白亞細胞定位進行預測, GOR IV對蛋白進行二級結構預測; 使用Blast工具在NCBI上查找氨基酸同源性序列。利用ClustalX1.83對候選基因序列比對分析, 利用Mega4.1軟件構建不同物種CIPK基因進化樹并比較分析[35]。

1.4半定量RT-PCR分析

用半定量RT-PCR檢測SiCIPK基因在不同生育期干旱脅迫下的表達情況。用分光光度計定量測定每個樣品總RNA的濃度和質量。總RNA經反轉錄后對PCR條件進行預實驗和優化, 根據預試驗中基因PCR產物的線性增長范圍確定循環數27, 反應體積25 μL, PCR反應程序為94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 30 s, 27個循環; 72℃ 5 min。以谷子持家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶基因B亞基(SiGAPB, Si035707m)為RT-PCR對照。反應產物(15 μL)經瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.5Real-time PCR分析

將TRIzol法提取總RNA樣品反轉錄合成cDNA, 均一化后作為實時定量PCR模板, 以SiGAPB作為內參基因。經預實驗優化后PCR反應程序為: 50℃ 2 min; 95℃ 2 min; 94℃變性30 s, 61℃退火30 s, 讀版65℃ 1 s, 讀板, 40個循環; 72℃延伸5 min; 繪制熔解曲線, 0.2℃ s–1。試驗設計3次重復, 采用相對定量2–ΔΔCt方法計算基因在某種逆境處理下某個時間點相對于對照的轉錄水平變化[36]。

2　結果與分析

2.1SiCIPK基因序列的獲得與參數分析

通過NCBI數據庫比對從谷子數據庫中得到2個谷子CIPK基因, 序列比對結果顯示這2個基因和玉米、水稻CIPK基因家族中的CIPK6和CIPK16同源性較高, 因此分別暫時命名為SiCIPK6和SiCIPK16。SiCIPK6基因組序列長1994 bp, CDS序列1356 bp, 編碼451個氨基酸; SiCIPK16基因組序列長1885 bp, CDS序列1422 bp, 編碼473個氨基酸(表1), 2個基因均無可變剪切和內含子。功能域分析顯示2個基因蛋白都含有NAF結構域(與CBL蛋白互作的必需), 另外還含有絲氨酸/蘇氨酸激酶域、ATP結合位點、蛋白磷酸化位點和信號轉導位點等多個CIPK基因的特征結構域。因此推斷SiCIPK6和SiCIPK16是谷子CIPK家族中的2個成員。

2.2SiCIPK基因的生物信息學分析

2.2.1SiCIPK蛋白參數分析SiCIPK6蛋白分子式為C2149H3453N641O628S16, 分子量為48.83 kD, 等電點(pI) 9.14, 平均疏水性(GRAVY) –0.197, 脂肪系數(AI) 86.08。SiCIPK16蛋白分子式為C2266H3620N664O664S18, 分子量為51.37 kD, 等電點(pI) 8.81, 平均疏水性(GRAVY) –0.125,脂肪系數(AI) 87.27。GOR IV軟件預測2個蛋白無規則卷曲所占的比例最高, 其次是α-螺旋和延伸鏈, 不含β-螺旋。根據SignalP 4.1 Server軟件預測結果可推測SiCIPK6 和SiCIPK16基因所編碼的蛋白不存在信號肽為非分泌蛋白, 它們在細胞質中合成后可能不被運轉。ProtScale軟件預測2個蛋白均為弱親水性蛋白。Psort軟件預測SiCIPK6蛋白據其概率大小依次可能存在于質膜、高爾基體、內質網(膜)、微體(過氧物酶體); 而SiCIPK16蛋白可能存在于內質網(膜)、質膜、微體(過氧物酶體)、葉綠體類囊體膜。

2.2.2谷子SiCIPK基因啟動子區域順式元件分析和功能預測順式元件分析發現在SiCIPK6和SiCIPK16啟動子區域主要包括激素類應答元件, 逆境類應答元件, 光應答元件以及其他類元件, 包括厭氧誘導必需(ARE)、細菌激發應答(Box-Wi)、分生組織特異性激活(CCGTCC-box)、胚乳表達(GCN4-motif、SKn-1 motif)、晝夜節律(circadian)元件(表2)。Profun 2.2 Server軟件預測顯示SiCIPK6和SiCIPK16可能參與調控轉錄調控、信號轉導、逆境應答、免疫應答等生理過程, 也可能參與生長因子、激素、離子通道蛋白、受體、結構蛋白等代謝途徑。

2.3不同非生物逆境脅迫下SiCIPK基因表達分析

圖1所示在5種脅迫處理下2個基因在不同時間點表達量不盡相同, 總的來看在誘導過程中表達量均有所上調。SiCIPK6基因在ABA、干旱和NaCl處理時表達量上調幅度較大, 分別在1、24、1 h達到表達量的最大值, 相對表達量分別是對照的4.65、6.42、7.46倍。SiCIPK16基因在低溫、干旱和高溫處理時表達量上調幅度較大, 在1、24、1 h達到表達量的最大值, 相對表達量分別是對照的4.39、4.19、2.56倍。

2.4SiCIPK基因在不同生育期干旱脅迫下的表達

分別在豫谷1號生長至拔節、孕穗、灌漿期時采用自然干旱方法取對照和干旱處理樣品葉片提取總RNA, 合成cDNA經均一化和半定量PCR后, 檢測SiCIPK6和SiCIPK16樣在不同生育期干旱脅迫下的表達情況。檢測結果表明SiCIPK6和SiCIPK16兩個基因在拔節、孕穗、灌漿期對照中均有表達, 而在相應生育時期受到干旱脅迫時它們表達量均有所提高(圖2)。

表2　SiCIPK6、SiCIPK16基因啟動子區域順式元件預測Table 2　Putative cis-elements in the promoter of SiCIPK6 and SiCIPK16

圖1　SiCIPK6和SiCIPK16在ABA、低溫、干旱、高溫和鹽處理下的Real-time PCR表達分析Fig. 1　Real-time PCR analysis of expression levels of the SiCIPK6 and SiCIPK16 under ABA, cold, dehydration, heat, and salt stresses treatments

圖2　SiCIPK6和SiCIPK16基因在不同生育期自然脫水脅迫下的表達分析Fig. 2　Electrophoretogram displaying the loading patterns for expression of SiCIPK6 and SiCIPK16 under dehydration stresses in different growth periods

3　討論

本研究通過生物信息學方法得到抗旱耐瘠作物谷子的2個CIPK基因, SiCIPK6基因編碼451個氨基酸, Si-CIPK16基因編碼473個氨基酸, 2個基因內部沒有內含子和可變剪切。在NCBI數據庫中進行序列比對發現它們與植物中的CIPK基因有較高同源性, 同時含有CIPK基因的標志結構域NAF-motif。功能域分析顯示SiCIPK6、SiCIPK16含有CIPK蛋白C端調控域、絲氨酸/蘇氨酸激酶催化域等CIPK蛋白特有的保守功能域, 因此推斷這2個基因屬于谷子CIPK家族中的2個成員。用ClustalX1.83比較不同物種中CIPK蛋白序列, 發現SiCIPK6、SiCIPK16與擬南芥、水稻和玉米中同源CIPK基因同源性非常高,而且具有非常保守的序列和結構。如圖3所示所有CIPK基因在C端調控域、N端激酶域、NAF結構域、激活環結構域、磷酸化和自磷酸化位點處序列高度一致, 非常保守。分析發現SiCIPK6與ZmCIPK6、OsCIPK6一致性分別為77.73％和72.17％, 與AtCIPK6一致性為52.49％; SiCIPK16與ZmCIPK16、OsCIPK16一致性分別為78.73％ 和74.55％, 與AtCIPK16一致性為45.33％。谷子中CIPK與水稻、玉米一致性要比谷子CIPK與擬南芥CIPK一致性高, 這與谷子與玉米、水稻親緣關系相對較近的現象是一致的(谷子、玉米、水稻同屬禾本科單子葉作物, 擬南芥屬十字花科雙子葉作物)。系統發育進化樹中SiCIPK6、SiCIPK16分別和玉米、水稻相應基因聚在一起也驗證了這一結論, 另外發育樹中除小立碗蘚中的PpCIPK6外,其他物種的CIPK6和CIPK16大都聚集在一起, 這也說明CIPK6和CIPK16這2個基因的祖先在單雙子葉植物分離之前就已存在。這些證明我們發現的SiCIPK6、SiCIPK16是植物CIPK家族中的2個成員, 它們和其他植物CIPK基因一樣具有非常保守的序列和結構。SiCIPK6、SiCIPK16和玉米、水稻中相應基因同源性較高一方面說明谷子和玉米、水稻具有較近的親緣關系, 另一方面也暗示它們在逆境應答或其他信號通路中可能有相似的功能。

圖3　SiCIPK6、SiCIPK16與其他已知CIPK氨基酸序列比對Fig. 3　Sequences alignment of SiCIPK6, SiCIPK16 and other known CIPKs

另外, 我們對這2個基因的生物信息學特征進行了系統的預測和分析, 希望能夠發掘對研究它們的功能有幫助的信息。預測結果顯示SiCIPK6和SiCIPK16很多性狀和參數非常接近類似, 這些結論不僅驗證了它們同屬CIPK基因家族, 而且預示SiCIPK6和SiCIPK16可能共同參與或調控某些信號途徑。順式元件分析和功能預測結果顯示SiCIPK6和SiCIPK16基因可能會參與ABA或其他激素介導的生理生化過程, 預測的部分功能和已證實的不同物種中CIPK基因功能是相吻合的, 已有研究結果也表明CIPK基因在逆境應答中起重要作用[9,12-13,41], 因此我們用ABA (100 μmol L–1)、低溫(4℃)、高溫(42℃)、干旱、高鹽(250 mmol L–1NaCl)處理谷子豫谷1號幼苗, 用Real-time PCR分析他們在不同處理下的表達情況。結果表明2個谷子SiCIPK基因在5種脅迫處理下不同時間點其表達量均有所上調或下調, 但具體動態表達模式不盡相同, 例如SiCIPK6基因在ABA脅迫下, 表達量在1 h迅速增加到最大值, 為對照的4.65倍, 隨后3～24 h表達水平逐漸下降; 在干旱誘導脅迫下1 h表達量快速增加, 3 h表達量急劇減少, 6 h又明顯上升, 12 h有所減少, 在24 h又反彈到最高值, 為對照的6.42倍。整體來看SiCIPK6基因在ABA、干旱和NaCl處理時表達量上調幅度較大,相對表達量最高時分別是對照的4.65、6.42、7.46倍。SiCIPK16基因在低溫、干旱和高溫處理時表達量上調幅度較大, 相對表達量在最高點時分別是對照的4.39、4.19、2.56倍。這些試驗結果與它們在擬南芥、水稻和玉米中的同源基因有著相似的結論, 在擬南芥中AtCIPK6表達量受鹽、滲透脅迫和ABA誘導, AtCIPK16對鹽有強烈應答, 進一步研究表明AtCIPK6參與了鹽、滲透脅迫以及ABA應答過程, AtCIPK16在細胞內Na+外排方面起一定作用[37-39]。水稻中的同源基因OSCIPK6受干旱、ABA和低溫誘導, OSCIPK16受NaCl、ABA、PEG、Cold誘導, 分析表明它們可能參與干旱、低溫、鹽等逆境脅迫和ABA應答[41]。玉米中的同源基因ZmCIPK16受NaCl、20％PEG、高溫、ABA、干旱的強烈誘導, 但卻不受低溫脅迫誘導, 進一步試驗表明, ZmCIPK16在鹽脅迫條件下能夠部分代替AtCIPK24的功能, 在鹽脅迫下轉基因植株能部分互補野生型植株表型[29]。這些結論可能暗示SiCIPK6和SiCIPK16與其他物種中的同源基因有相似或部分相似的功能, 可能參與了干旱、低溫、鹽、高溫以及ABA的應答, 但在不同的逆境應答過程中具體參與調控模式有所不同。

由于SiCIPK6和SiCIPK16均在干旱誘導下表達量上調幅度較大, 因此我們進一步用半定量方法研究了SiCIPK6和SiCIPK16在拔節、孕穗、灌漿期期干旱脅迫下的表達情況。如圖所示, SiCIPK6在拔節、孕穗、灌漿期對照中均有表達, 表達量為拔節期>孕穗期>灌漿期,在受到干旱脅迫時, SiCIPK6表達量受誘導迅速增加, 表達量為拔節期>孕穗期>灌漿期。SiCIPK16在拔節、孕穗、灌漿期對照中也均有表達, 在3個時期表達量基本一致,在受到干旱脅迫時, SiCIPK16表達量受誘導迅速增加, 拔節期和孕穗期表達量上調幅度較大, 灌漿期上調幅度稍微小一些。SiCIPK6和SiCIPK16在不同生育時期受到干旱脅迫后表達量迅速上調說明SiCIPK6和SiCIPK16基因

可能參與了谷子在拔節、孕穗、灌漿期的干旱應答。這些試驗結論與我們的順式元件預測和功能預測分析結論以及其他物種中相應同源基因報道是一致的(表1)。另外在2個基因啟動子區域還發現茉莉酸甲(CGTCA-motif、TGACG-motif)、植物激素(TGA)、水楊酸(TCA-element、胚乳表達(SKn-1 motif)、玉米醇溶蛋白代謝調控(O2-site)、缺氧特異性誘導(GC-motif)、分生組織表達(CAT-box)、分生組織特異性激活(CCGTCC-box)、細菌激發應答(Box-Wi)、厭氧誘導必需(ARE), 這些順式元件的存在暗示SiCIPK6和SiCIPK16可能參與相應的生理生化過程。值得一提的是在啟動子區域還發現了大量的光應答元件和晝夜節律調控(circadian)核心元件, 眾所周知谷子是光溫敏感性作物, 預示SiCIPK6和SiCIPK16可能參與調控谷子的光溫應答調控。盡管這些推測都需要嚴謹的試驗證明, 但還是為我們今后的功能研究提供了一些線索。

本文報道的谷子SiCIPK基因豐富和完善了植物CIPK成員, 為進一步闡明CBL/CIPK信號系統在谷子逆境應答中的功能、機制提供了試驗依據。

References

[1] 智慧, 牛振剛, 賈冠清, 柴楊, 李偉, 王永芳, 李海權, 陸平,白素蘭, 刁現民. 谷子干草飼用品質性狀變異及相關性分析.作物學報, 2012, 38: 800?807

Zhi H, Niu Z G, Jia G Q, Chai Y, Li W, Wang Y F, Li H Q, Lu P, Bai S L, Diao X M. Variation and correlation analysis of hay forage quality traits of foxtail millet [Setaria italica (L.) Beauv.]. Acta Agron Sin, 2012, 38: 800?807 (in Chinese with English abstract)

[2] Devos K M, Wang Z M, Beales J, Sasaki T, Gale M D. Comparative genetic maps of foxtail millet (Setaria italica) and rice (Oryza sativa). Theor Appl Genet, 1998, 96: 63–68

[3] Jayaraman A, Puranik S, Rai N K, Vidapu S, Sahu P P, Lata C, Prasad M. cDNA-AFLP analysis reveals differential gene expression in response to salt stress in foxtail millet (Setaria italica L.). Mol Biotechnol, 2008, 40: 241–251

[4] Zhao D, Oosterhuis D, Bednarz C. Influence of potassium deficiency on photosynthesis, chlorophyll content and chloroplast ultrastructure of cotton plants. Photosynthetica, 2001, 9:103–109

[5] Zhou J, Wang J, Bi Y, Wang L, Tang L, Yu X, Ohtani M, Demura T, Zhuge Q. Overexpression of PtSOS2 enhances salt tolerance in transgenic poplars. Plant Mol Biol Report, 2014, 32: 185–197

[6] Wang W X, Vinocur B, Altman A. Plant responses to drought, salinity and extreme temperature: towards genetic engineering for stress tolerance. Planta, 2003, 2: 1–14

[7] Sanders D, Brownlee C, Harper J. Communicating with calcium. Plant Cell, 1999, 11: 691–706

[8] Choi W G, Toyota M, Kim S H, Hilleary R, Gilroy S. Salt stress-induced Ca2＋waves are associated with rapid, longdistance root-to-shoot signaling in plants. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111: 6497–6502

[9] Batistic O, Kudla J. Analysis of calcium signaling pathways in plants. Biochim Biophys Acta, 2012, 1820: 1283–293

[10] Kolukisaoglu U, Weinl S, Blazevic D, Batistic O, Kudla J. Calcium sensors and their interacting protein kinases: genomics of the Arabidopsis and rice CBL–CIPK signaling networks. Plant Physiol, 2004,134: 43–58

[11] Zhang H, Yang B, Liu W Z, Li H, Wang L, Wang B, Deng M, Liang W, Deyholos MK, Jiang Y Q. Identification and characterization of CBL and CIPK gene families in canola (Brassica napus L.). BMC Plant Biol, 2014, 14: 8

[12] Kleist T J, Spencley A L, Luan S. Comparative phylogenomics of the CBL–CIPK calcium-decoding network in the moss Physcomitrella, Arabidopsis, and other green lineages. Front Plant Sci, 2014, 5: 1–17

[13] 沈金秋, 鄭仲仲, 潘偉槐, 潘建偉. 植物CBL-CIPK信號系統的功能及其作用機理. 植物生理學報, 2014, 50: 641–650

Shen J Q, Zheng Z Z, Pan W H, Pan J W. Functions and action mechanisms of CBL-CIPK signaling system in plants. Plant Physiol J, 2014, 50: 641–650 (in Chinese with English abstract)

[14] Wu S J, Ding L, Zhu J K. SOS1: a genetic locus essential for salt tolerance and potassium acquisition. Plant Cell, 1996, 8: 617–627

[15] Liu J, Zhu J K. An Arabidopsis mutant that requires increased calcium for potassium nutrition and salt tolerance. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94: 14960–14964

[16] Gong D, Guo Y, Jagendorf A T, Zhu J K. Biochemical characterization of the Arabidopsis protein kinase SOS2 that functions in salt tolerance. Plant Physiol, 2002, 130: 256–264

[17] Halfter U, Ishitani M, Zhu J K. The Arabidopsis SOS2 protein kinase physically interacts with and is activated by the calcium-binding protein SOS3. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97: 3735–3740

[18] Quintero F J, Ohta M, Shi H, Zhu J K, Pardo J M. Reconstitution in yeast of the Arabidopsis SOS signaling pathway for Na+homeostasis. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99: 9061–9066

[19] Qiu Q S, Guo Y, Quintero F J, Pardo J M, Schumaker K S, Zhu J K. Regulation of vacuolar Na+/H+exchange in Arabidopsis thaliana by the salt-overly-sensitive (SOS) pathway. J Biol Chem, 2004, 279: 207–215

[20] Xu J, Li H D, Chen L Q, Wang Y, Liu L L, He L, Wu W H. A protein kinase, interacting with two calcineurin B-like proteins, regulates K＋transporter AKT1 in Arabidopsis. Cell, 2006, 125: 1347–1360

[21] Lee S C, Lan W Z, Kim B G, Li L, Cheong Y H, Pandey G K, Lu G, Buchanan B B, Luan S. A protein phosphorylation/dephosphorylation network regulates a plant potassium channel. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104: 15959–15964

[22] Hu H C, Wang Y Y, Tsay Y F. AtCIPK8, a CBL-interacting protein kinase, regulates the low-affinity phase of the primary nitrate response. Plant J, 2009, 57: 264–278

[23] Deng X, Zhou S, Hu W, Feng J, Zhang F, Chen L, Huang C, Luo Q, He Y, Yang G, He G. Ectopic expression of wheat TaCIPK14, encoding a calcineurin B-like protein-interacting protein kinase, confers salinity and cold tolerance in tobacco. Physiol Plant, 2013, 149: 367–377

[24] Deng X, Hu W, Wei S, Zhou S, Zhang F, Han J, Chen L, Li Y, Feng J, Fang B, Luo Q, Li S, Liu Y, Yang G, He G. TaCIPK29, a CBL-interacting protein kinase gene from wheat, confers salt stress tolerance in transgenic tobacco. PLoS One, 2013, 8: e69881

[25] Chen X, Huang Q, Zhang F, Wang B, Wang J, Zheng J. ZmCIPK21, a maize CBL-interacting kinase, enhances salt stress tolerance in Arabidopsis thaliana. Int J Mol Sci, 2014, 15: 14819–14834

[26] Li J, Long Y, Qi G N, Xu Z J, Wu WH, Wang Y. The Os-AKT1 channel is critical for K+uptake in rice roots and is modulated by the rice CBL1–CIPK23 complex. Plant Cell, 2014, 26: 3387–3402

[27] Cuellar T, Pascaud F, Verdeil J L, Torregrosa L, Adam-Blondon A F, Thibaud J B, Sentenac H, Gaillard I. A grapevine Shaker inward K+channel activated by the calcineurin B-like calcium sensor 1-protein kinase CIPK23 network is expressed in grape berries under drought stress conditions. Plant J, 2010, 61: 58–69

[28] Cuellar T, Azeem F, Andrianteranagna M, Pascaud F, Verdeil J L, Sentenac H, Zimmermann S, Gaillard I. Potassium transport in developing fleshy fruits: the grapevine inward K+channel VvK1.2 is activated by CIPK–CBL complexes and induced in ripening berry flesh cells. Plant J, 2013, 73: 1006–1018

[29] Zhao J F, Sun Z F, Zheng J, Guo X Y, Dong Z G, Huai J L, Gou M Y, He J G, Jin Y S, Wang J H, Wang G Y. Cloning and characterization of a novel CBL-interacting protein kinase from maize. Plant Mol Biol, 2009, 69: 661–674

[30] 趙晉鋒, 余愛麗, 田崗, 杜艷偉, 郭二虎, 刁現民. 谷子CBL基因鑒定及其在干旱、高鹽脅迫下的表達分析. 作物學報, 2013, 39: 360–367

Zhao J F, Yu A L, Tian G, Du Y W, Guo E H, Diao X M. Identification of CBL genes from foxtail millet (Setaria italica [L.] Beauv.) and its expression under drought and salt stresses. Acta Agron Sin, 2013, 39: 360–367 (in Chinese with English abstract) [31] Zheng J, Zhao J F, Tao Y Z, Wang J H, Liu Y J, Fu J J, Jin Y, Gao P, Zhang J P, Bai Y F, Wang G Y. Isolation and analysis of water stress induced genes in maize seedlings by subtractive PCR and cDNA macroarray. Plant Mol Biol, 2004, 55: 807–823

[32] 余琴鴦, 尹恒, 安利佳, 李文利. 一個快速響應干旱的F-box基因的克隆和表達分析. 作物學報, 2014, 40: 1531–1539

Yu Q Y, Yin H, An L J, Li W L. Cloning and expression analysis of a calcium-dependent protein kinase gene SiCDPK1 in Setaria italica. Acta Agron Sin, 2014, 40: 1531–1539 (in Chinese with English abstrac)

[33] Zhang J P, Liu T S, Fu J J, Zhu Y, Jia J P, Zheng J, Zhao Y H, Zhang Y, Wang G Y. Construction and application of EST library from Setaria italica in response to dehydration stress. Genomics, 2007, 90: 121–131

[34] Sambrook J, Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edn. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. pp 581–585

[35] Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software Version 4.0. Mol Biol Evol, 2007, 24: 1596–1599

[36] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using Real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 2001, 25: 402–408

[37] Chen L, Wang Q Q, Zhou L, Ren F, Li D D, Li X B. Arabidopsis CBL-interacting protein kinase (CIPK6) is involved in plant response to salt/osmotic stress and ABA. Mol Biol Rep, 2013, 40: 4759–4767

[38] Tripathi V, Parasuraman B, Laxmi A, Chattopadhyay D. CIPK6, a CBL-interacting protein kinase is required for development and salt tolerance in plants. Plant J, 2009, 58: 778–790

[39] Roy S J, Huang W, Wang X J, Evrard A, Schm?ckel S M, Zafar Z U, Tester M. A novel protein kinase involved in Na (+) exclusion revealed from positional cloning. Plant Cell Environ, 2013, 36: 553–568

[40] Xiang Y, Huang Y, Xiong L. Characterization of stressresponsive CIPK genes in rice for stress tolerance improvement. Plant Physiol, 2007, 144: 1416–1428

[41] 趙晉鋒, 余愛麗, 王高鴻, 田崗, 王寒玉, 杜艷偉, 常海霞. 植物CBL/CIPK網絡系統逆境應答研究進展. 中國農業科技導報, 2011, 13(4): 32–38

Zhao J F, Yu A L, Wang G H, Tian G, Wang H Y, Du Y W, Chang H X. Progress of CBL/CIPK signal system in response to stresses in plant. J Agric Sci Technol, 2011, 13(4): 32–38 (in Chinese with English abstract)

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20151207.1121.018.html

Expression Analysis of Two CIPK genes under Abiotic Stress in Foxtail Millet

YU Ai-Li1,2, ZHAO Jin-Feng1,2, WANG Gao-Hong2, DU Yan-Wei2, LI Yan-Fang2, ZHANG Zheng2, GUO Er-Hu2, and LIANG Ai-Hua1,*
1Insitute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China;2Millet Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences / Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Breeding in Minor Crops, Changzhi 046011, China

Abstract:CIPK (CBL interacting protein kinase) is a type of serine or threonine protein kinases, which plays an important role in response to stress. In this study, we identified two CIPK genes designated as SiCIPK6 and SiCIPK16 from foxtail millet (Setaria italica) genome using bioinformatics methods. The sequence analysis showed that SiCIPK6 has a length of 1994 bp in the genome, encoding 513 amino acids residues, and SiCIPK16 is 1885 bp, encoding 473 amino acids residues. These two genes have no alternative splicing and intron. The characters predicted based on the bioinformatics analysis revealed that the protein sequences and structure of the two SiCIPK genes were very conservative just like CIPK genes in other species. Real-time PCR analysis discovered that the expression of SiCIPK6 and SiCIPK16 was up-regulated by ABA, cold, heat, drought and salt stress, respectively. The expression was strongly induced by ABA, drought and salt treatments for SiCIPK6, and by cold, drought and heat treatments for SiCIPK16. The semi-quantitative PCR analysis showed that SiCIPK6 and SiCIPK16 were expressed at the jointing, booting and filling stages, and induced by drought stress in the corresponding growth period. Foxtail millet CIPK genes reported in this study would enrich CIPK members in plant kingdom and provides important information for further elucidating the function and mechanisms of the CBL/CIPK network system responsive to stresses in foxtail millet.

Keywords:Foxtail millet; Calcineurin B-like-interacting protein kinase gene; Stress

收稿日期Received(): 2015-07-20; Accepted(接受日期): 2015-11-20; Published online(網絡出版日期): 2015-12-07.

通訊作者*(Corresponding author): 梁愛華, E-mail: aliang@sxu.edu.cn

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00295