腫瘤相關巨噬細胞在肝癌組織中的表達及其與VEGF的相關性

胡鵬，王衛星，王鵬，鄧文宏，余佳

(武漢大學人民醫院普通外科，湖北 武漢 430060)

·論 著·

腫瘤相關巨噬細胞在肝癌組織中的表達及其與VEGF的相關性

胡鵬，王衛星，王鵬，鄧文宏，余佳

(武漢大學人民醫院普通外科，湖北 武漢 430060)

目的 研究腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)在肝癌中的表達及其與血管內皮生長因子（VEGF）的相關性。方法采用免疫組織化學雙染方法檢測2010年1月至2014年1月在我院行肝癌切除術后收集的肝癌組織標本95例，采用免疫組化法分別檢測組織中CD163(TAMs標記物)及VEGF的表達，光鏡下對TAMs計數及VEGF陽性表達進行分析，并分析其與臨床病理參數之間的關系。結果在肝癌組織分期Ⅰ～Ⅱ期的肝癌組織中TAMs平均浸潤(38.39±22.13)個，Ⅲ～Ⅳ期的肝癌組織中TAMs平均浸潤(48.95±25.32)個(P＜0.05)，未出現遠處轉移的肝癌患者組織中TAMs平均浸潤(37.41±22.48)個，而出現遠處轉移的肝癌患者組織中TAMs平均浸潤(47.56±26.45)個(P＜0.05)。VEGF主要是在腫瘤細胞中呈中等強度表達；并且其表達強度與TAMs計數呈正相關關系(r=0.782，P＜0.05)。結論TAMs在肝癌組織中的表達與肝癌侵襲轉移特性以及分期有密切關系，并與VEGF表達呈正相關關系，提示TAMs與VEGF的表達可用來預測腫瘤的惡性程度，以及作為肝癌的輔助治療和改善預后的潛在靶點。

肝癌；腫瘤相關巨噬細胞；血管內皮生長因子；相關性

肝細胞癌(簡稱肝癌)的發病率居全球男性腫瘤發病原因前列，是最常見的消化系統腫瘤之一[1]。近年來，腫瘤微環境在其發生、發展過程中起到至關重要的作用。存在于微環境中的巨噬細胞(TAMs)表達多種特異抗原，例如CD163、CD68等，被作為抗腫瘤作用較強的起關鍵作用的細胞，而且現在TAMs與腫瘤發生發展之間的關系逐漸被重視[2]。TAMs具有促進腫瘤侵襲與轉移的作用，這種作用是通過參與上皮間質轉化(EMT)、血管生成等產生的。據文獻表明，TAMs對缺氧比較敏感，表達缺氧誘導因子相對較多，常聚集于微血管周邊，而在血管的生成過程中血管內皮生長因子(VEGF)起到關鍵性的作用[3-4]。本文通過收集臨床上肝癌患者的組織標本，并運用免疫組織化學方法檢測CD163與VEGF在肝癌組織中的表達，探討TAMs在肝癌組織中的表達以及與VEGF的相關性，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 標本來源 收集武漢大學人民醫院肝膽外科2014年1月至2015年6月期間行肝切除術并術后病理切片證實為肝細胞癌的95例石蠟標本，患者術前未行放、化療等抑制腫瘤生長的治療。其中男性76例，女性19例；年齡37～78歲，甲胎蛋白(AFP)≤400 μg/L者43例，AFP≥400 μg/L者52例；肝包膜完整者57例，不完整者38例；分化程度低者63例，分化程度高者32例；肝癌TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期58例，Ⅲ～Ⅳ期37例；肝癌腫瘤組織Edmondson分級：Ⅰ～Ⅱ級61例，Ⅲ～Ⅳ級34例。

1.2 主要試劑 鼠抗人CD163單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；免疫組化試劑盒，免疫組化雙染試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。

1.3 免疫組化染色 標本先行甲醛固定，后行石蠟包埋，做成3 μm厚的切片。免疫組化染色嚴格遵循標準步驟操作。首先使用隨機方法選擇10個高倍鏡下的視野，統計胞漿變成棕色的陽性細胞在其中的百分比，半定量標準如下：＜10%(-)，≥10%(+)，實驗使用含有牛血清的磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作為陰性對照，陽性對照片由試劑公司提供。

1.4 TAMs計數 采用Leek等[5]使用的計數巨噬細胞的方法進行統計：先采用低倍鏡觀察并選取巨噬細胞比較密集的3個視野進行計數，然后在高倍鏡下進行記數，最后獲得三組的平均數用來分析。

1.5 VEGF的表達測定 采用半定量積分法判定結果。陽性細胞數在5%以內判為0分，5%～25%判為1分，25%～50%判為2分，50%～75%判為3分，大于75%判為4分；將細胞質染色為無色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0分、1分、2分、3分四個等級。將上述所得結果的乘積作為VEGF的最終判定標準。

1.6 統計學方法 應用SPSS21.0軟件進行統計學分析。計量數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義，采用Spearmanm Rank程序進行相關性分析。

2 結 果

2.1 TAMs與VEGF在肝癌組織中的表達 VEGF、CD163染色主要存在于細胞質，細胞膜也有部分染色，見圖1、圖2。肝癌組織中VEGF與CD163的表達明顯高于正常肝臟組織。

圖1 CD163在不同肝臟組織中的表達

圖2 VEGF在不同肝臟組織中的表達

2.2 肝癌組織中TAMs與VEGF的表達與臨床病理之間的關系 TAMs浸潤程度與腫瘤轉移及TNM分期有關(P＜0.05)，見表1。VEGF在分化程度低的肝癌中的陽性率明顯高于分化程度高者(P＜0.05)；VEGF的表達水平在Ⅰ～Ⅱ期肝癌組織中均比Ⅲ～Ⅳ期高(P＜0.05)；出現淋巴結轉移的肝癌細胞中TAMs的陽性率明顯高于未出現淋巴結轉移者(P＜0.05)，見表2。

表1 腫瘤相關巨噬細胞浸潤與肝癌臨床病理特征之間的關系

表2 肝癌組織中VEGF陽性表達與臨床病理之間的關系

2.3 TAMs計數與VEGF表達之間的關系 在浸潤的間質細胞和癌細胞中，VEGF主要是在腫瘤細胞中呈中等強度表達；經Sperrman相關分析，肝癌組織中VEGF的表達強度與TAMs計數呈正相關關系(r=0.782，P＜0.05)，見圖3。

圖3 TAMs與VEGF的相關性：r=0.782，P＜0.05

3 討 論

近年來，炎癥在腫瘤發生發展過程中起到不可替代的作用，腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)分布于腫瘤免疫微環境中，并在腫瘤發生發展中起到至關重要的作用，越來越成為當前研究的熱點。巨噬細胞存在于大多數腫瘤微環境之中，它們通過影響周圍炎性介質的產生、細胞增殖信號、組織結構重塑、血管生成來促進腫瘤的生長。近來，TAMs在腫瘤侵襲、轉移過程中被廣泛關注。常規來說，TAMs存在于大多數惡性腫瘤組織中，并且腫瘤內部及周圍均有腫瘤相關巨噬細胞的浸潤。TAMs活化之后釋放大量炎癥介質，對腫瘤組織、細胞以及腫瘤周圍組織、細胞產生影響，這可以導致免疫系統紊亂及免疫沉默。TAMs轉移到腫瘤當中，并不起殺死腫瘤細胞的作用，而是促進腫瘤的發生、發展。多項研究顯示，在腫瘤微環境中TAMs更容易極化成M2型巨噬細胞并促進腫瘤細胞的生長、侵襲跟轉移。而CD163是M2型巨噬細胞特異性較高的一個標志物，目前認為其具有減弱炎癥損傷，促進腫瘤生長、侵襲的重要作用[6-8]。

研究發現，氧含量的高低可以影響TAMs的表達，TAMs喜厭氧環境，多分布在肝癌等惡性腫瘤的缺氧部位。低氧環境可使細胞分泌前列腺素增加，提高了TAMs對趨化因子的敏感性，并誘導TAMs轉移到腫瘤缺氧部位[9]。作為腫瘤侵潤白細胞的一個主要成分，TAMs在腫瘤的發展中起到決定性的作用，這個作用是通過表達趨化因子、生長因子(VEGF)、金屬蛋白酶類發揮的。而其中VEGF在其中起最重要的作用。

腫瘤生長最重要的是靠腫瘤血管的供血，而腫瘤的侵襲轉移又依靠腫瘤血管。研究證實，腫瘤生長如果沒有新生血管提供充足的血液則會停止生長，血管生成是肝癌生長的基礎，并且促進腫瘤細胞向身體的各個器官轉移。血管內皮生長因子具有非常強的促進血管生長的作用，在誘導腫瘤血管生成、促進腫瘤生長、侵襲及轉移中起著非常重要的作用[10]。通過查閱文獻得知，VEGF高表達于肝癌組織中[11]。本文通過對肝癌患者臨床資料的整理以及免疫組化研究了VEGF及CD163在該部分患者組織中的表達情況，得出以上結果并通過表格及免疫組化圖片證明，由以上結果可以看出VEGF在肝癌生長、轉移以及癌癥復發中起至關重要的作用，并可以為肝癌的治療以及預后提供重要的依據。VEGF在肝癌Ⅲ～Ⅳ期中的表達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期中的表達(P＜0.05)，由此得出VEGF在促進肝癌的生長中起重要作用，其機制可能與VEGF具有促進腫瘤血管生成增多有關。其表達水平的增高，可以作為預測肝癌臨床預后的重要的生物學指標之一。

TAMs是腫瘤微環境中的主要組成部分，并通過多種途徑在腫瘤發生、生長、侵襲、轉移及免疫抑制等方面起著促腫瘤作用[12]。在以上研究中得出，VEGF表達強度與TAMs計數呈正相關關系(P＜0.05)。由此得出，在肝癌中TAMs可能是通過促進VEGF表達進而促進腫瘤血管的形成。

綜上所述，TAMs與VEGF在肝癌組織中的高度表達并與肝癌侵襲轉移特性以及分期有密切關系，因此推斷TAMs可能通過促進VEGF的表達進而促進腫瘤生長，并且可以以此判斷腫瘤的惡性程度，為肝癌的臨床治療和預后提供新的線索。

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Expression of tumor-associated macrophage in the tissue of hepatocellular carcinoma and the correlation with vascular endothelial growth factor.

HU Peng,WANG Wei-xing,WANG Peng,DENG Wen-hong,YU Jia.Department of General Surgery,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of tumor-associated macrophages in hepatocellular carcinoma and its correlation with vascular endothelial growth factor(VEGF).MethodsNinety-five samples of hepatocellular carcinoma tissue collected from the patients undergoing hepatectomy from January 2010 to January 2014 in our hospital were detected by double immunohistochemical staining.The expression of CD163(TAMs marker)and VEGF in hepatocellular carcinoma were detected by immunohistochemistry.Then TAMs count and the positive expression of VEGF were analyzed under light microscope,and their relationship with clinical pathological parameters were analzyed.ResultsThe average infiltration of TAMs was(38.39±22.13)in hepatocellular carcinoma of stageⅠ～Ⅱ, (48.95±25.32)in hepatocellular carcinoma of stageⅢ～Ⅳ(P＜0.05),which was(37.41±22.48)in the patients without distant metastasis and(47.56±26.45)in the patients with distant metastasis(P＜0.05).VEGF was moderately expressed in hepatocellular carcinoma,and the expression intensity was positively correlated with TAMs count(r= 0.782,P＜0.05).ConclusionThe expression of TAMs in the hepatocellular carcinoma has close relationship with the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma as well as staging,and it is positively correlated with expression of VEGF.The expression of TAMs and VEGF can be used to predict the malignant degree of tumor,and as an adjuvant therapy of liver cancer and potential targets to improve the prognosis.

Hepatocellular carcinoma;Tumor-associated macrophages;Vascular endothelial growth factor (VEGF);Correlation

R735.7

A

1003—6350（2016）05—0689—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.05.001

2015-11-12)

國家自然科學基金(編號：81370562)；國家自然科學基金青年項目(編號：81300356)；天晴肝病扶持基金(編號：TQGB20140182)

王衛星。E-mail:sate.llite@163.com