HBV相關慢加亞急性肝衰竭患者中Th17細胞、Treg細胞的變化及其與肝功能和HBV-DNA載量間的研究

沈敏，林明強，馮奇桃，呂友凱，李永武

(海南省農墾總醫院感染性疾病科1、分子生物學實驗室2，海南 海口 570311)

HBV相關慢加亞急性肝衰竭患者中Th17細胞、Treg細胞的變化及其與肝功能和HBV-DNA載量間的研究

沈敏1，林明強1，馮奇桃1，呂友凱1，李永武2

(海南省農墾總醫院感染性疾病科1、分子生物學實驗室2，海南 海口 570311)

目的 通過檢測乙型肝炎病毒(HBV)相關慢加亞急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者外周血中的Th17細胞、Treg細胞的水平，探討Th17、Treg細胞在HBV-ACLF發病機制中的作用。方法流式細胞術檢測22例HBV-ACLF患者、24例慢性乙型肝炎患者（CHB）以及20例健康對照者(HC)外周血Th17、Treg細胞的頻率，熒光定量PCR法檢測患者外周血HBV-DNA水平，同時分析Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg與谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總膽紅素(TB)及HBV-DNA載量間的相關性。結果HBV-ACLF組患者的Thl7細胞、Treg細胞、Th17/ Treg較CHB組和HC組明顯增高，CHB組又較HC組Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg升高，差異均有統計學意義(P＜0.05)；HBV-ACLF組外周血中Th17細胞與Treg細胞間存在正相關(r=0.873，P＜0.05)，CHB組外周血中Th17細胞與Treg細胞間存在正相關(r=0.638，P＜0.05)，HC組外周血中Th17細胞與Treg細胞間存在正相關(r=0.617，P＜0.05)。HBV-ACLF組Thl7細胞與ALT呈正相關(r=0.612，P＜0.05)，Th17/Treg與ALT呈正相關(r=0.592，P＜0.05)；CHB組Thl7細胞與ALT呈正相關(r=0.636，P＜0.05)，Th17/Treg與ALT呈正相關(r=0.712，P＜0.05)。HBV-ACLF組、CHB組和HC組Th17、Treg、Th17/Treg與AST和TB間無相關性。HBV-ACLF組和CHB組Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg與HBV-DNA載量間無相關性。結論Thl7細胞和Treg細胞在機體內可能處于一種平衡狀態，在CHB和HBV-ACLF體內這種平衡可能已經打破。Thl7細胞、Treg細胞可能參與了慢性乙型肝炎和HBV相關慢加亞急性肝衰竭的發生發展，同時，Th17細胞有望成為評估HBV-ACLF患者肝臟損傷程度的一個免疫學指標。Th17細胞、Treg細胞與HBV-DNA載量無相關性。

Th17；Treg；HBV；慢加亞急性肝衰竭；谷丙轉氨酶；谷草轉氨酶

目前全球約有4億人感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)，而這4億慢性HBV感染者中有約 1/3在中國[1-2]，HBV相關慢加亞急性肝衰竭(Acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF)是在HBV感染的基礎上引起的肝臟急性炎癥壞死反應，臨床上可以出現消化道出血、自發性細菌性腹膜炎、肝腎綜合征、肝性腦病等并發癥。目前，HBV-ACLF缺乏特異的治療手段，臨床上仍以內科綜合治療為主，預后差，死亡率高。關于HBV-ACLF的具體發病機制目前仍未完全清楚，很多研究表明機體免疫調節紊亂在HBV-ACLF的發生發展中發揮重要作用。Th17細胞和Treg細胞是近年來發現的CD4+T細胞新亞群[3-4]，Th17細胞主要介導免疫炎癥[5]，Treg細胞主要介導免疫耐受，研究表明，它們在介導炎癥反應、自身免疫性疾病、腫瘤和移植排斥等的發生和發展中發揮重要的作用[5-6]。本研究擬就HBV-ACLF患者外周血中Th17、Treg細胞頻率的變化及其與肝功能和HBV復制水平的關系進行探討，進一步了解HBV-ACLF的免疫學發病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取海南省農墾總醫院2013年4月至2014年12月的門診、住院患者及健康體檢者共66例，其中，HBV-ACLF組患者22例；慢性乙型肝炎組(CHB組)患者24例；健康對照組(HC組)20例。診斷參照2010年中華醫學會肝臟病學分會制定的《慢性乙型肝炎防治指南》[7]和2006年中華醫學會感染病學分會制定的《肝衰竭診療指南》[8]，同時排除合并其他類型病毒性肝炎、HIV感染、酒精性肝病、自身免疫性疾病、甲亢等，發病前均未行系統的抗病毒治療、免疫調節治療和人工肝治療。

1.2 主要試劑與儀器 改良型RPMI1640培養液(北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司)，人淋巴細胞分離液和胎牛血清(北京索萊寶科技有限公司)，佛波酯(PMA)、離子霉素(Ion)、莫能霉素和Human Th17/ Treg Phenotyping Kit(BD Bioscience)，PBS緩沖液(Hyclone)。美國BD公司CANTO-Ⅱ流式細胞儀，美國ABIABI 5700實時定量PCR擴增儀。

1.3 檢測方法

1.3.1 血清HBV-DNA、ALT、AST、TB的檢測 采用熒光定量PCR法檢測患者外周血HBV-DNA水平，采用速率法檢測血清ALT、AST(我院日立7600型全自動生化分析儀)。

1.3.2 外周血Th17、Treg細胞的培養與檢測 取外周抗凝血300μl，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液900μl，加入佛波酯(PMA)及離子霉素1.2μl，莫能霉素0.8μl，充分混勻，置于溫度為37℃、濃度為5%的CO2培養箱中培養10 h后離心。依次加入固定破膜液BufferA(1 500μl)、Buffer C(500μl)，充分混勻后常溫避光保存時間分別為20 min和30 min，最后加入染色劑Phenotyping Cocktail(4μl)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復沖洗后上機檢測Th17、Treg細胞占CD4+T的頻率，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.4 統計學方法 統計軟件采用SPSS17.0進行統計分析。符合正態分布的計量數據以均數±標準差(±s)表示，非正態分布的數據采用中位數和百分位數(M±Q)表示，多個組之間的比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗和秩和檢驗，相關分析采用Pearson相關檢驗分析。以α=0.05作為檢驗水準，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組受檢者的年齡、肝功能、HBV-DNA水平比較 三組受檢者在性別構成方面差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。平均年齡HBV-ACLF組高于CHB組，CHB組高于HC組，差異有統計學意義(P＜0.05)，符合慢性HBV感染相關肝病的發展過程；肝功能指標(ALT、AST、TB)HBV-ACLF組高于CHB組，CHB組高于HC組，差異具有統計學意義(P＜0.05)，符合相關診斷標準。HBV-ACLF組和CHB組的HBV-DNA水平差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

2.2 外周血Th17、Treg細胞檢測結果 圖1、圖2顯示HBV-ACLF組中Th17細胞和Treg細胞具有較大的熒光分布區；CHB組中Th17細胞和Treg細胞具有一般大小的熒光分布區；HC組中Th17細胞和Treg細胞具有較小的熒光分布區。對三組受檢者Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg行方差分析發現：HBV-ACLF組中Thl7細胞、Treg細胞、Th17/Treg較CHB組和HC組顯著升高；CHB組較HC組Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表1 三組受檢者年齡、肝功能、HBV-DNA水平比較(±s)

表1 三組受檢者年齡、肝功能、HBV-DNA水平比較(±s)

組別 性別 年齡(歲)ALT(U/L)AST(U/L)TB(μmol/L)HBV-DNA(lg copies/ml)女HBV-ACLF組(n=22) CHB組(n=24) HC組(n=20)檢驗值P值男8 1 4 10 14 10 10 χ2=2.244 0.33 47.94±10.87 36.82±9.63 28.12±4.39 F=12.579 0.00 460.76±280.42 136.50±78.59 26.48±13.54 F=9.478 0.00 173.35±125.67 88.87±52.59 18.37±8.62 F=10.376 0.00 182.24±121.45 42.34±16.53 10.48±6.83 F=12.478 0.00 6.27±1.78 5.89±1.35 0 Z=-1.91 0.13

表2 三組受檢者外周血Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg檢驗結果比較(±s，%)

表2 三組受檢者外周血Th17細胞、Treg細胞、Th17/Treg檢驗結果比較(±s，%)

組別Th17/CD4+T Treg/CD4+T Th17/Treg HBV-ACLF組(n=22) CHB組(n=24) HC組(n=20)檢驗值P值6.46±3.18 4.48±2.64 2.10±1.39 13.672 0.00 3.46±2.54 2.76±1.57 1.78±0.96 9.457 0.01 2.15±1.27 1.62±0.83 1.16±1.04 11.045 0.00

2.3 三組外周血Th17細胞、Treg細胞的相關性 對HBV-ACLF組、CHB組、HC組外周血中Th17細胞和Treg細胞采用Pearson法進行相關性分析，HBV-ACLF組Th17細胞與Treg細胞：r=0.873，P= 0.000＜0.05，存在正相關(見圖3)；CHB組Th17細胞與Treg細胞：r=0.638，P=0.02＜0.05，存在正相關(見圖4)；HC組Th17細胞與Treg細胞：r=0.617，P=0.000＜0.05，存在正相關(見圖5)。

2.4 兩組患者的Th17、Treg、Th17/Treg與肝功能(ALT、AST、TB)、HBV-DNA載量的相關性 通過Pearson相關檢驗分析，HBV-ACLF組者外周血Th17細胞率與ALT(r=0.612，P=0.029)呈正相關關系(圖6)，Th17/ Treg與ALT(r=0.592，P=0.038)呈正相關關系(圖7)；CHB組外周血Th17細胞率與ALT(r=0.636，P=0.018)呈正相關關系(圖8)，Th17/Treg與ALT(r=0.712，P=0.008)呈正相關關系(圖9)。Treg細胞與肝功能均無相關性。

圖1 三組Thl7細胞的檢測

圖2 三組Treg細胞的檢測

圖3 ACLF組Th17與Treg相關性分析

圖4 CHB組Th17與Treg相關性分析

圖5 HC組Th17與Treg相關性分析

圖6 ACLF組Th17與ALT相關性

圖7 ACLF組Th17/Treg與ALT相關性

圖8 CHB組Th17與ALT相關性

圖9 CHB組Th17/Treg與ALT相關性

2.5 兩組患者的Th17、Treg、Th17/Treg與HBV-DNA的相關性 HBV-ACLF組患者和CHB組患者Th17、Treg、Th17/Treg與HBV-DNA間均無相關關系，見表3。

組別HBV-ACLF組(n=22) Th17/Treg r=0.252 P=0.254 r=0.349 P=0.455 CHB組(n=24) Th17/CD4+T r=0.012 P=0.098 r=0.463 P=0.152 Treg/CD4+T r=0.038 P=0.231 r=0.083 P=0.237注：r為相關系數。

3 討論

HBV-ACLF是HBV感染者在某種誘因下(如飲酒、勞累、藥物等)導致的肝細胞大量壞死而出現的以肝功能嚴重受損為特征的綜合征。肝衰竭的發生是病毒、宿主和環境相互作用的結果，其中，病毒誘發的機體免疫損傷在肝衰竭的發病過程中發揮著重要的作用[9-10]。Th17細胞和Treg細胞是近年來發現的一種新的不同于Th1、Th2的CD4+T細胞新亞群，Th17細胞可以通過分泌IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-8、單核細胞趨化因子-1(MCP-1)、GM-CSF等相關炎癥因子、趨化因子和集落刺激因子的生成，誘導中性粒細胞及單核巨噬細胞遷移到病灶，促進免疫反應[11-12]；Treg細胞可以分泌TGF-β、IL-4、IL-10、等細胞因子，通過直接接觸或分泌免疫因子發揮免疫調節作用[13-14]。本研究中HBV-ACLF組、CHB組Th17細胞與Treg細胞均存在正相關，且HBV-ACLF組和CHB組中Th17/Treg較HC組高，說明正常情況下Th17細胞和Treg細胞在體內處于一種平衡，在HBV-ACLF和CHB中這種平衡被打破。

本研究中HBV-ACLF患者外周血中Th17、Treg細胞的頻率高于CHB組和HC組，Th17/Treg比率也明顯升高，且Th17細胞、Th17/Treg與血清中ALT呈正相關。這說明在HBV-ACLF患者體內，Th17、Treg細胞都有所增加，但以Th17細胞的增加更顯著，活化后的Th17細胞能募集各種炎性細胞增強機體的免疫反應，但是過強的免疫反應有致肝細胞損傷的作用；同時，Treg細胞的增加能避免過強的免疫反應造成肝細胞的大量壞死[15]，所以Treg細胞的增加可能是機體因適應性的需要而產生的一種反饋調節。Th17細胞、Th17/Treg與血清中ALT呈正相關，且它們在HBV-ACLF組、CHB組、HC組依次降低，說明Th17可能是導致HBV相關肝病重癥化的一個因素，這與國內外的研究結果基本符合[16-18]，初步表明Th17介導的炎癥反應可能參與HBV-ACLF疾病的發展。Zhang等[19]研究發現，Th17加重肝損傷的同時，也有清除乙型肝炎病毒(HBV)的作用；Yang等[20]的研究結果認為Treg細胞與HBV-DNA呈正相關。本研究中CHB組和HBV-ACLF患者組Th17、Treg、Th17/Treg與 HBV DNA間無相關性，與他們的結果不一致。說明Th17、Treg細胞并不能直接影響HBV-DNA的復制，HBV-ACLF患者中Th17、Treg細胞的分化、成熟是否受HBV或其他免疫細胞的影響，目前仍無定論，具體機制有待進一步的研究。

筆者通過在用藥和系統治療前觀察HBV-ACLF患者外周血中Th17、Treg細胞的變化及其與肝功能和HBV-DNA間的關系，發現Th17和Treg細胞與HBV-ACLF的發生、發展密切相關，其在外周血中的變化可以協助判斷機體的免疫狀態，有望成為判斷肝損傷患者嚴重程度的一個免疫標志。下一步的研究應該在用藥或系統治療后的不同時間點進一步觀察Th17、Treg細胞的變化及其與肝功能和HBV-DNA間的關系，這有利于進一步闡明HBV-ACLF的發病機制，也對制訂治療方案、判斷療效有重要的指導意義。

[1]Liu Y,Wang CM,Cheng J,et al.Hepatitis B virus in tenofovirnaive Chinese patients with chronic hepatitis B contains no mutation of rtA194T conferring a reduced tenofovir susceptibility[J].Chin Med J,2009,122(13):1585-1586.

[2]Lee WM,Squires RH,Nyberg SL,et al.Acute liver failure:summary of a workshop[J].Hepatology,2008,47(4):1401-1415.

[3]Park H,Li Z,Yang XO,et al.A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17[J].Nature Immunology,2005,6(11):1133-1141.

[4]Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases[J].Journal of Immunology(Baltimore,Md:1950),1995,155(3):1151-1164.

[5]Zhang JY,Zhang Z,Lin F,et a1.Interleukin-17-Producing CD4T cells Increase with severity of liver damage in patients with chronic hepatitis B[J].Hepatology,2010,51(1):81-91.

[6]Li J,Wu W,Peng GP,et al.HBeAg induces interleukin-10 production,inhibiting HBcAg-sp ecific Th l7 responses in chronic hepatitis B patients[J].Immunol Cell Biol,2010,88(8):834-841.

[7]中華醫學會肝病學分會.中華醫學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J].中華傳染病學雜志,2011,29(3):65-80.

[8]中華醫學會感染病學分會肝衰竭與人工肝學組.中華醫學會肝病學分會重型肝病與人工肝學組.肝衰竭診療指南[J].中華肝臟病雜志,2006,14(6):643-646.

[9]鄒正升,陳菊梅,辛紹杰,等.慢性重型病毒性肝炎發病特點的探討[J].中華實驗和臨床病毒學雜志,2002,16(4):322-325.

[10]祝成亮,李艷,袁麗.乙型肝炎病毒對白細胞介素35表達影響的研究[J].海南醫學,2015,26(19):2874-2875.

[11]Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases[J].Journal of Immunology(Baltimore,Md:1950),1995,155(3):1151-1164.

[12]Ouyang W,Kolls JK,Zheng Y.The biological functions of T helper 17 cell effector eytokines in inflammation[J].Immunity,2008,28 (4):454-467.

[13]Komijyama Y,Najae S,Matsuki T,et al.IL-17 plays an important role in the development of experimental autoimmune encephalomyelititis[J].J Immunol,2006,177:566-573.

[14]von Boehmer H,Mechanisms of suppression by suppressor T cells [J].Nature immunology,2005,6(4):338-344.

[15]劉志華,齊青松,張志安慢性HBV感染者血清IL-35含量和外周血Treg細胞的變化及意義[J].海南醫學,2014,25(11):1638-1640.

[16]Miguel-Carrasco JL,Zambrano S,Blanca AJ,et al.Captopril reduces cardiac inflammatory markers in spontaneously hypertensive rats by inactivation of NF-KB[J].J Inflamm(Lond),2010,7:21.

[17]劉光亮,周小蘭,陶鵬.Th17/treg細胞亞群數量變化在HBV相關ACLF臨床轉歸中的作用[J].免疫學雜志.2014,30(7):623-627.

[18]Wu W,Li J,Chen F,et al.Circulating Th17 cells frequency is associated with the disease progression in HBV infected patients[J].Journal of Gastroenterology and Hepatology,2010,25(4):750-757

[19]Zhang GL,Xie DY,Lin BL,et al.Imbalance of interleukin-17-producing CD4 T cells/regulatory T cells axis occurs in remission stage of patients with hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure[J].Journal of Gastroenterology and Hepatology,2013,28(3): 513-521

[20]Yang G,Liu A,Xie Q,et al.Association of CD4+CD25+FoxP3 regulatory T cells with chronic activity and viral clearance in patients with hepatitis B[J].International Immunology,2007,19(2):133-140.

Change of Th17 cell,Treg cell in patients with HBV-associated acute-on-chronic liver failure and its relationship with liver function and HBV-DNA load.

Shen Min1,LIN Ming-qiang1,FENG Qi-tao1,LV You-kai1,LI Yong-wu2.Department of Infectious Diseases1,Laboratory of Molecular Biology2,Hainan Provincial Nongken General Hospital,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo detect the levels of Th7 and Treg cells in patients with hepatitis B virus-associated acute-on-chronic liver failure(HBV-ACLF)and to analyze the effect of Th7 and Treg cells in the pathogenesis of HBV-ACLF.MethodsThe frequency of Th17 and Treg cells in peripheral blood of 22 patients with HBV-ACLF (HBV-ACLF group),24 patients with chronic hepatitis B(CHB group)and 20 healthy controls(HC group)were determined by flowcytometry.HBV-DNA loads were measured by fluorescent PCR.Finally,the correlations among Th17, Treg,Th17/Treg,alanine aminotransferase(ALT),aspertate aminotransferase(AST),total bilirubin(TB)and HBV-DNA loads were analyzed.ResultsThe levels of Th17,Treg and Th17/Treg in HBV-ACLF group were significantly higher than those in CHB group and HC group,and the levels in CHB group were significantly higher than those in HC group (P＜0.05).Th17 was positively correlated with Treg in HBV-ACLF group,CHB group,and HC group(P＜0.05),with the correlation coefficients of 0.873,0.638,0.617,respectively.Th17 was positively correlated with ALT in HBV-ACLF group and CHB group(r=0.612,P＜0.05;r=0.636,P＜0.05),and Th17/Treg was positively correlated with ALT in HBV-ACLF group and CHB group(r=0.592,P＜0.05;r=0.712,P＜0.05).Th17,Treg,Th17/Treg showed no correlation with HBV DNA load in HBV-ACLF group and CHB group,and also with AST and TB in the three groups(P＞0.05).ConclusionTh17 and Treg may be in a balanced state in healthy people,and such state might be broken in patients with CHB and HBV-ACLF,which indicates that Th17 and Treg are involved in the occurrence and development of CHB and HBV-AVLF.Th17 cell could be used as an immunological marker for determination of the liver damage degree in HBV-ACLF.Th17,Treg have no correlation with the load of HBV-DNA.

Th17;Treg;Hepatitis B virus(HBV);Acute-on-chronic liver failure(ACLF);Alanine aminotransferase(ALT);Aspartate aminotransferase(AST)

R512.6+2

A

1003—6350（2016）05—0692—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.05.004

2015-06-10)

沈敏。E-mail：531635658@qq.com