Noxa蛋白在肝外膽管癌組織中的表達及其與臨床病理的關系

胡海霞，李偉，熊正文，李宏偉，黃勇，牛曉東

(中國人民解放軍第251醫院病理科，河北 張家口 075000)

Noxa蛋白在肝外膽管癌組織中的表達及其與臨床病理的關系

胡海霞，李偉，熊正文，李宏偉，黃勇，牛曉東

(中國人民解放軍第251醫院病理科，河北 張家口 075000)

目的 研究Noxa蛋白在肝外膽管癌及正常組織中的表達，同時探討其與患者臨床病理因素的關系。方法收集2006年3月至2009年6月我院肝外膽管癌和正常組織各70例，并采取免疫組織化學(EnVisionTM)法分別檢測Noxa蛋白在肝外膽管癌組織及正常組織中的表達情況。結果Noxa在肝外膽管癌組織、正常組織陽性表達率分別為32.86%(23/70)、68.57%(48/70)，兩者比較差異有統計學意義(χ2=17.86，P＜0.01)；肝外膽管癌組織Noxa的表達與TNM分期、淋巴結轉移有關(P＜0.05)，但與性別、年齡、腫瘤直徑、組織學分化、浸潤深度及神經受累無關(P＞0.05)；Noxa陽性表達的患者5年生存率低于Noxa陰性表達者[26.09%(6/23)vs 53.19%(25/47)]，差異有統計學意義(χ2=4.59，P＜0.05)。結論肝外膽管癌組織中Noxa蛋白的低表達不僅表明了癌細胞促凋亡能力的異常，而且也有利于預測淋巴結轉移及臨床分期的狀態，同時也可作為判斷患者預后的參考指標。

肝外膽管癌；Noxa蛋白；臨床病理；表達

膽管癌是膽管上皮細胞受到各種因素刺激而發生的惡性改變，依據解剖部位分為肝內膽管癌和肝外膽管癌，前者以肝內腫物為主要臨床表現，后者以皮膚黃染為主。肝外膽管癌占膽管癌的90%，且常發生于膽總管分叉處[1]。目前，肝外膽管癌的治療以手術切除為主，以化療、放療和生物治療等為輔，但患者的死亡率改善不明顯。為了探討影響患者死亡率的相關因素，本文研究Noxa蛋白在肝外膽管癌組織中的表達及其與臨床病理參數之間的關系，并進一步分析其對患者5年生存預后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2006年3月至2009年6月期間我院患者資料70例，并經病理活檢明確診斷為肝外膽管癌。70例患者中，女性39例，男性31例；年齡38～81歲，中位數年齡56歲；≥56歲46例、＜56歲24例；腫瘤直徑≥1.9 cm 37例、＜1.9 cm 33例；高分化腺癌17例，中分化腺癌31例，低分化腺癌22例。浸潤深度為肌層13例，漿膜層41例，周圍組織16例；神經受累38例，無神經受累32例；淋巴結轉移者38例，無轉移者32例；臨床分期中，Ⅰ期7例，Ⅱ期20例，Ⅲ期35例，Ⅳ期8例。所有患者均為首次接受住院治療，并電話隨訪5年。同時選取因膽道梗阻切除的膽管組織70例作為對照組。

1.2 試劑和方法 濃縮型鼠抗人單克隆抗體Noxa及其配套試劑盒、DAB顯色劑由武漢博士德生物技術有限公司提供，抗體工作濃度按1:200稀釋。方法采取免疫組化染色EnVision兩步法，詳細步驟參照說明書。陰性對照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗制成。

1.3 結果判斷 Noxa蛋白陽性著色于細胞質，可表現為淺黃色、黃色、棕黃色。判斷標準[2]：計數10個高倍視野下陽性著色細胞所占百分比：陽性細胞≤5%為陰性，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分；染色強度：0分為無色，1分為淺黃色，2分為黃色，3分為棕黃色。上述兩項相乘1～4分(+)，5～8分(++)，9～12分(+++)。染色結果由本科室兩名以上病理專家進行雙盲評估，并規定總分≤4分均記為陰性，＞4分均記為陽性。

1.4 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，計數資料采用四格表χ2檢驗，多個率之間的比較采用RxC χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Noxa蛋白在肝外膽管癌組織和正常組織中的表達 Noxa蛋白在70例肝外膽管癌組織中陽性表達23例，陰性表達47例，陽性率為32.86%；而在70例正常組織中陽性表達48例，陰性表達22例，陽性率為68.57%，數據經χ2統計分析，兩組之間表達差異有顯著統計學意義(χ2=17.86，P＜0.01)，見圖1、圖2。

2.2 Noxa蛋白的表達與肝外膽管癌臨床病理因素的關系 Noxa蛋白男性和女性比較，≥56歲與＜56歲比較，腫瘤直徑≥1.9 cm與＜1.9 cm比較，高分化組織、中分化組織及低分化組織比較，肌層癌組織、漿膜層癌組織及周圍癌組織中比較，癌組織累及神經組與未受累及比較，差異均無統計學意義(P＞ 0.05)。Noxa蛋白在淋巴結轉移與無轉移組比較、Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

圖1 Noxa蛋白在正常組織陽性表達(EnVisionx100)

圖2 Noxa蛋白在肝外膽管癌組織弱陽性表達(EnVisionx100)

表1 Noxa蛋白的表達與肝外膽管癌臨床病理因素的關系

2.3 肝外膽管癌組織中Noxa的表達對生存預后的影響 70例肝外膽管癌患者在5年隨訪期間內，無一例失訪。Noxa陽性表達的23例患者中有6例患者存活，5年存活率為26.09%；Noxa陰性表達的47例患者中有25例患者存活，5年存活率為53.19%，數據經統計分析，兩組比較差異有統計學意義(χ2=4.59，P= 0.03)，見圖3。

圖3 Noxa表達對肝外膽管癌患者5年生存預后的影響

3 討 論

Noxa是Bcl-2家族成員之一，其含有1個BH3結構域，通過此結構域活化線粒體途徑進而促進細胞的凋亡。人類Noxa基因定位于第18號染色體長臂21區，長4.301 kb，編碼含有54個氨基酸的蛋白質，該蛋白質包含1個BH3結構域和1個線粒體定位域。資料顯示，惡性腫瘤組織中Noxa蛋白的異常表達影響細胞的凋亡。董偉等[2]研究發現，Noxa蛋白在胃癌組織中的表達明顯低于癌旁組織，其表達與胃癌組織分化程度、臨床分期、淋巴結轉移和遠處轉移有關，且Noxa蛋白表達陰性的胃癌細胞凋亡指數明顯低于表達陽性者。可見，Noxa蛋白在胃癌組織存在異常表達，其表達水平不利于胃癌的發生、發展。謝奇朋等[3]通過依托泊苷誘導胃腺癌細胞凋亡的實驗發現，胃腺癌細胞中Noxa表達明顯上調，其表達在4 h即開始明顯增加，8 h達到高峰，48 h胃腺癌細胞凋亡達50%，這提示依托泊苷誘導胃腺癌細胞發生的凋亡與Noxa表達上調有關。也有研究顯示，轉染Noxa基因的乳腺癌MCF-7細胞增殖抑制和凋亡明顯高于對照組，同時細胞DNA合成受到抑制，細胞周期阻滯在G0/G1期[4]。

本實驗結果顯示，Noxa蛋白在肝外膽管癌組織中陽性表達明顯低于正常組織，這表明在肝外膽管癌組織中Noxa的活性被抑制，引起細胞凋亡與抗凋亡之間的平衡被打破，進而為腫瘤的形成提供有利條件。同時，肝外膽管癌組織中Noxa蛋白的表達與淋巴結轉移、臨床分期有關，而與性別、年齡、腫瘤直徑、組織學分化、浸潤深度及神經受累無關，因而推測，Noxa蛋白的低表達有利于癌組織淋巴結的轉移，也可為評估患者的臨床分期提供參考。研究結果進一步發現，陽性表達Noxa蛋白的肝外膽管癌患者5年生存率明顯低于其陰性表達者，這提示Noxa蛋白表達的水平可反映患者5年生存率的狀態。這也表明，通過改變Noxa蛋白表達的水平是有可能改善患者的生存預后。相關研究資料顯示，一些抗腫瘤藥物在神經外胚層腫瘤、前列腺癌、淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病等[5-8]疾病中，以依賴p53途徑或非依賴p53途徑上調Noxa的表達，激活凋亡途徑，進而誘導腫瘤細胞的凋亡。因而，未來有必要進一步研究Noxa蛋白在肝外膽管癌組織中表達的機制及相對敏感的抗腫瘤藥物。

[1]葛賢秀,李全朋,繆林.膽管癌的治療現狀與進展[J].醫學研究生學報,2012,25(5):520-523.

[2]董偉,魏志,孫自勤,等.凋亡蛋白Bad與Noxa在胃癌中表達及其與細胞凋亡的關系[J].中華實用診斷與治療雜志,2014,28(7): 636-640.

[3]謝奇朋,葉艷,郝延璋,等.bcl-2家族BH3-only蛋白在依托泊苷誘導胃腺癌細胞凋亡中的作用[J].腫瘤防治研究,2006,33(7): 502-505.

[4]趙志,吳愛國,沈三弟.Noxa基因轉染乳腺癌MCF-7細胞的增殖抑制和促凋亡作用[J].腫瘤防治研究,2010,37(10):1104-1108.

[5]Armstrong JL,Veal GJ,Redfern CP,et al.Role of Noxa in p53-in-dependent fenretinide-induced apoptosis of neuroectodermal tumours [J].Apoptosis,2007,12(3):613-622.

[6]MengY,TangW,DaiY,et al.Natural BH3 mimetic(-)-gossypolchemosensitizes human prostate cancer via Bcl-xL inhibition ac-companied by increase of Puma and Noxa[J].Mol Cancer Ther,2008,7(7): 2192-2202.

[7]Perez-Galan P,Roue G,Villamor N,et al.TheBH3-mimeticGX15-070 synergizes with bortezomib inmantle cell lymphoma by enhancing Noxa-mediated activation of Bak[J].Blood,2007,109(10): 4441-4449.

[8]Inoue S,Riley J,Gant TW,et al.Apoptosis induced by histonedeacetylase inhibitors in leukemic cells is mediated by Bim and Noxa[J]. Leukemia,2007,21(8):1773-1782.

Expression of Noxa protein in extrahepatic bile duct carcinoma and its relationship with clinicopathological factors.

HU Hai-xia,LI Wei,XIONG Zheng-wen,LI Hong-wei,HUANG Yong,NIU Xiao-dong.Department of Pathology, the 251thHospital of Chinese People's Liberation Army,Zhangjiakou 075000,Hebei,CHINA

Objective To study the expression of Noxa protein in extrahepatic bile duct carcinoma and normal tissue,and investigate its relationship with clinicopathological factors.MethodsThe expression of Noxa was detected in 70 cases of extrahepatic bile duct carcinoma and 70 cases of normal tissue from March 2006 to June 2009 by immunohistochemisty(EnVisionTM).ResultsThe positive expression rate of Noxa in extrahepatic bile duct carcinoma and normal tissue was 32.86%(23/70),68.57%(48/70),respectively,with statistically significant difference(χ2=17.86,P＜0.01).The positive expression of Noxa protein in extrahepatic bile duct carcinoma tissue was related to TNM staging,lymphaden metastasis(P＜0.05),but not to gender,age,tumor diameter,histological differentiation,infiltrating depth and infiltrating nerve (P＞0.05).The five-year survival rate of patients with positive expression of Noxa was significantly lower than that of patients with negative expression[26.09%(6/23)vs 53.19%(25/47),χ2=4.59,P＜0.05].ConclusionThe low expression of Noxa in extrahepatic bile duct carcinoma not only indicates the abnormal promoting apoptosis of carcinoma cell,but also is useful for forecasting lymphaden metastasis and TNM staging,which can be used as reference index for judging patients prognosis.

Extrahepatic bile duct carcinoma;Noxa protein;Clinicopathology;Expression

R735.8

A

1003—6350（2016）05—0709—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.05.007

2015-09-07)

李偉。E-mail：liwei-324@163.com