蜂膠對大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合的影響

卞明心　沈若武　劉曉彤　李春雪　李玲　楊永華

[摘要] 目的 探討蜂膠對創(chuàng)傷愈合的影響，并初步探討創(chuàng)傷愈合機制。 方法 60只健康雄性Wistar大鼠隨機分為實驗組（創(chuàng)傷模型+蜂膠組）20只、對照組（創(chuàng)傷模型+碘伏組）20只、空白組（創(chuàng)傷模型+生理鹽水組）20只，每組再隨機分為5個時間點（3、5、7、10、14 d），每組每時間點各4只，采用手術(shù)法復制大鼠背部皮膚全層1 cm×1 cm的創(chuàng)傷模型，每日換藥。分別于各個時間點處死大鼠，切取創(chuàng)面皮膚組織，計算創(chuàng)傷愈合率，通過HE染色觀察創(chuàng)面組織學的變化，免疫組織化學染色法檢測血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血小板源性生長因子（PDGF）的動態(tài)改變。 結(jié)果 與對照組比較，實驗組能明顯提高大鼠創(chuàng)傷愈合速度和愈合率（P<0.05或P<0.01）。與空白組比較，HE染色顯示實驗組毛細血管、膠原纖維增生明顯，表皮再生完全。免疫組織化學染色顯示，實驗組在3 d時VEGF表達水平明顯高于對照組（P<0.05），實驗組在5 d時PDGF表達水平明顯高于對照組（P<0.05）。 結(jié)論 蜂膠在創(chuàng)傷修復愈合過程中起明顯促進作用，可能與其促進血管生成、促進肉芽組織以及瘢痕組織增生等作用有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 蜂膠；碘伏；創(chuàng)傷愈合；血管內(nèi)皮生長因子；血小板源性生長因子；中草藥

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）01（c）-0011-04

[Abstract] Objective To discuss the influence of propolis on wound healing and study preliminarily on the mechanism of wound healing. Methods 60 healthy and male Wistar rats were randomly divided into experimental group （wound model+propolis，n=20），control group （wound model+povidone iodine，n=20） and blank group （wound model+physiological saline，n=20）.Each group was then randomly divided into 5 time points：3 d，5 d，7 d，10 d and 14 d with there were 4 rats in each time point.The wound model was established by full-thickness skin injury in rats′ back in size of 1 cm×1 cm，changed dressings every day.The rats were executed in every time point and the injuried skin tissues were cut to calculate the wound healing rate，and the change of wound histology was observed by hematoxylin-eosin （HE） staining and the dyanmic change of vascular endothelial growth factor（VEGF） and platelet-derived growth factor（PDGF） was detected by immunohistochemical staining method respectively. Results Compared with control group，the experimental group could obviously improve the healing speed and healing rate of wound in rats （P<0.05 or P<0.01）.Compared with blank group，HE staining revealed that remarkable capillary and collagen fiber hyperplasia，and complete epidermal regeneration was observed in experimental group.Immunohistochemical staining revealed that the expression level of VEGF in experimental group was significantly higher than that of control group in 3 d （P<0.05）.The expression level of PDGF was greatly higher than that of control group in 5 d （P<0.05）. Conclusion The propolis plays a significant promotion role in healing and repair of wound，it may be related to promoting angiogenesis，the role of promoting proliferation of granulation tissue and scar tissue.promote the rebuilding of capillaries，acceletate the regeneration of the epidermis and facilitate the formation of scar.

[Key words] Propolis；Povidone-iodine；Wound healing；Vascular endothelial growth factor；Platelet-derived growth factor；Chinese herbal medicine

蜂膠的藥用價值極高，其化學成分包括黃酮類化合物、烯、萜類化合物及大量微量元素等300多種成分，已被證實具有降血糖、抗菌、免疫增強、抗炎，抗氧化等多種藥理作用[1-4]，其中抗菌與抗炎作用為創(chuàng)傷愈合提供了藥理基礎(chǔ)。近年來，國內(nèi)外已有部分關(guān)于蜂膠促愈合的研究，而在臨床治療過程中，碘伏仍是外科創(chuàng)傷的首選消毒、促愈合藥物。本文將蜂膠作為促愈合劑用于創(chuàng)傷模型，通過HE染色觀察皮膚組織愈合過程，免疫組織化學染色動態(tài)觀察血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）的表達水平[5]，與碘伏進行對比，觀察蜂膠對創(chuàng)傷愈合的影響并初步探究其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

成年健康的Wistar大鼠60只，雄性，15周，體質(zhì)量（280±10）g，購自青島市藥品檢驗所實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（魯）20100010。單籠單只飼養(yǎng)于28℃清潔級動物實驗室內(nèi)。隨機分成實驗組、對照組和空白組，每組20只。

1.2 創(chuàng)傷模型的建立與干預方法

采用手術(shù)法切除大鼠背部皮膚進行造模[6]。造模當天以10%的水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，用剃毛器及脫毛劑于大鼠背部胸段兩側(cè)脫毛，暴露皮膚面積約24 cm2。用手術(shù)刀于胸段兩側(cè)作1 cm×1 cm切口，切除全層皮膚至深筋膜，形成兩個正方形創(chuàng)面。用無菌棉球擦拭止血，實驗組涂抹蜂膠（成都寶芝堂生物科技有限公司，G20100714），對照組涂抹碘伏，空白組涂抹生理鹽水，拍照記錄。用無菌紗布包扎，繃帶固定。大鼠每日自由進食、飲水。每日換藥，換藥前記錄創(chuàng)口面積。

1.3 組織取材及處理

分別于手術(shù)后3、5、7、10、14 d灌流固定實驗動物，每組4只，固定前記錄創(chuàng)口面積，不換藥。切取以創(chuàng)面為中心的2 cm×2 cm組織塊，每只取2塊，常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋，切片，每塊組織切3張切片，每組24張，隨機分為4個亞組，分別進行常規(guī)HE染色，VEGF、PDGF檢測采用SABC免疫組織化學染色，并嚴格按照試劑盒說明進行操作，光鏡下觀察組織變化。

1.4 免疫組織化學染色結(jié)果判斷

每個亞組選取6張切片，400倍鏡下隨機選取5個視野，應用Simple-PCI圖像分析系統(tǒng)對組織照片進行定量分析。VEGF的表達以陽性細胞表達百分比表示（陽性細胞百分比=陽性細胞數(shù)/視野總細胞數(shù)×100%）。陽性細胞主要為胞質(zhì)著色，表達為棕黃色或棕褐色顆粒。判斷標準如下：染色面積<10%（-），染色面積≥10%（+）。PDGF的表達以平均光密度值表示，陽性細胞主要為胞質(zhì)著色。

1.5 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以x±s表示，正態(tài)分布檢驗采用單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗，檢驗符合正態(tài)分布后采用單因素方差分析對各組均數(shù)進行比較，各組均數(shù)間兩兩比較采用SNK檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組不同時間創(chuàng)面愈合率的比較

3 d時，各組間愈合率差異有統(tǒng)計學意義（F=10.56，P<0.01），通過SNK檢驗，實驗組愈合率明顯高于對照組（q=3.57，P<0.01），同時明顯高于空白組（q=4.28，P<0.01）；5 d時，各組間愈合率差異有統(tǒng)計學意義（F=4.22，P<0.05），實驗組愈合率明顯高于空白組（q=2.75，P<0.05），對照組愈合率明顯高于空白組（q=2.17，P<0.05）；7 d時，各組間愈合率差異有統(tǒng)計學意義（F=4.58，P<0.05），實驗組愈合率明顯高于空白組（q=2.77，P<0.05），對照組愈合率明顯高于空白組（q=2.44，P<0.05）；10 d時，各組間愈合率差異無統(tǒng)計學意義（F=0.36，P>0.05）；14 d時，各組間愈合率差異有統(tǒng)計學意義（F=127.06，P<0.01），實驗組愈合率明顯高于對照組（q=5.66，P<0.05），同時明顯高于空白組（q=15.74，P<0.01），對照組明顯高于空白組（q=10.07，P<0.01）（表1）。

2.2 HE染色結(jié)果

3 d時，實驗組與對照組仍有單核粒細胞滲出，伴有少量毛細血管增生，空白組中性粒細胞滲出明顯，炎細胞浸潤程度較高。5 d時，實驗組出現(xiàn)較多毛細血管增生，肉芽組織生長旺盛，成纖維細胞增生，傷口進入典型增殖期。對照組成纖維細胞數(shù)量較少，肉芽組織生長情況較弱。7 d時，實驗組肉芽組織進一步生長，生發(fā)層開始增厚，毛細血管數(shù)量增多，表皮細胞開始從傷口邊緣向中心移行。對照組未見表皮細胞的增殖移行。10 d時，各組均有肉芽組織填埋傷口，纖維組織增生明顯，瘢痕組織開始形成，實驗組新生上皮較厚，移行較快。14 d時，實驗組創(chuàng)面已被填埋，上皮完整，愈合基本完成；對照組與空白組上皮較薄，再生不完全（圖1）。

2.3 3組不同時間VEGF、PDGF表達水平的比較

VEGF表達水平在3 d時，各組間表達差異有統(tǒng)計學意義（F=4.20，P<0.05），通過SNK檢驗，實驗組VEGF表達水平明顯高于對照組（q=2.66，P<0.05），同時明顯高于空白組（q=2.32，P<0.05）；5 d時，各組間表達差異有統(tǒng)計學意義（F=3.94，P<0.05），實驗組VEGF表達水平明顯高于對照組（q=2.81，P<0.05）；7 d時，各組間表達差異有統(tǒng)計學意義（F=4.22，P<0.05），實驗組VEGF表達水平明顯高于對照組（q=2.56，P<0.05），空白組VEGF表達水平明顯高于對照組（q=2.47，P<0.05）。PDGF表達水平在5 d時，各組間表達差異有統(tǒng)計學意義（F=6.48，P<0.05），通過SNK檢驗，實驗組PDGF表達水平明顯高于對照組（q=3.56，P<0.01）；7 d時，各組間表達差異有統(tǒng)計學意義（F=7.685，P<0.01），實驗組PDGF表達水平明顯高于對照組（q=3.84，P<0.01），空白組PDGF表達水平明顯高于對照組（q=2.59，P<0.05）；10 d時，各組間表達差異有統(tǒng)計學意義（F=6.47，P<0.05），對照組PDGF表達水平明顯高于實驗組（q=3.57，P<0.01）；14 d時，各組間表達差異有統(tǒng)計學意義（F=8.61，P<0.01），實驗組PDGF表達水平明顯低于對照組（q=3.78，P<0.01），同時明顯低于空白組（q=3.37，P<0.01）（表2、圖2）。

3 討論

蜂膠廣泛的藥理作用使其即可內(nèi)服又可外用，并且具有外用創(chuàng)傷藥的普遍作用效果[7-8]，在2010年版的《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）中就記載了蜂膠“外用解毒消腫，收斂生肌”的功效[9]，促愈合效果顯著。

本實驗結(jié)果顯示，對照組、實驗組的創(chuàng)傷愈合率均明顯高于空白組（P<0.05），說明蜂膠具有明顯促進傷口愈合的效果。3 d時，實驗組創(chuàng)傷愈合率明顯高于對照組（P<0.05），說明蜂膠與碘伏相比，能夠有效促進創(chuàng)面的收縮，減少創(chuàng)面面積及表皮爬行范圍，加快愈合。從常規(guī)HE染色結(jié)果得出，實驗組肉芽組織從3 d開始出現(xiàn)明顯增殖現(xiàn)象，肉芽毛細血管豐富，生長旺盛，加快愈合，說明蜂膠能加快肉芽組織的形成，在一定程度上促進成纖維細胞的增殖，使創(chuàng)傷修復加快進入增殖期。

VEGF是特異性最高同時也是作用最強的血管生長因子，其可促進血管內(nèi)皮祖細胞增殖，增加血管的通透性，促進血管的生成，同時與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有一定的相關(guān)性[10-12]。琚晨焰等[13]發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中VEGF陽性表達率明顯較高，與胃癌的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。通過動物實驗，陳芳等[14]發(fā)現(xiàn)，VEGF高水平表達極大地促進了腫瘤血管的生長，對血管內(nèi)皮細胞的損傷具有拮抗作用。創(chuàng)傷組織中豐富的新生血管為創(chuàng)面提供了充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，保證了肉芽組織迅速增生。本研究免疫組織化學染色中，VEGF在創(chuàng)傷愈合早期起顯著作用，實驗組3 d時表達水平與對照組、空白組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明實驗組能有效刺激VEGF的生成，促進傷口組織毛細血管的增生、增殖，為創(chuàng)面愈合提供必需的物質(zhì)條件。

PDGF能使成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞直接參與肉芽組織的形成，促進炎癥細胞的浸潤，促進細胞產(chǎn)物增多，使膠原合成增多，還可以促使VEGF轉(zhuǎn)錄和分泌從而促進血管生成[15-18]。Hom等[19]通過病例研究發(fā)現(xiàn)，使用PDGF治療可以促使患者傷口內(nèi)肉芽組織得到充分填埋； LaRochelle等[20]發(fā)現(xiàn)，PDGF與卵巢、腎、肺等部位的癌癥患者均有一定的相關(guān)性，可促進腫瘤的侵襲。創(chuàng)面組織中PDGF的含量高低可以很好地反映創(chuàng)面增殖期傷口的愈合情況。本研究免疫組織化學染色中，PDGF在5 d時呈高表達，5、7 d時表達水平與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明實驗組能夠更早形成大量的肉芽組織，激發(fā)肉芽組織的增殖生長，加快創(chuàng)面充填，加速愈合。

綜上所述，蜂膠在創(chuàng)傷修復方面療效可觀，與單純擦拭碘伏相比具有更好的促愈合效果，值得在臨床創(chuàng)傷修復治療中推廣應用。

致謝：感謝夏玉軍教授對文章討論部分提出的寶貴意見，感謝李陽、嚴金光同學對實驗過程的大力協(xié)助。

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（收稿日期：2015-09-23 本文編輯：許俊琴）